表观遗传和代谢调控间充质干细胞成骨分化的研究进展_石玉.pdf

（Biomedical Transformation），2023年6月，第4卷，第2期表观遗传和代谢调控间充质干细胞成骨分化的研究进展石玉，尹贝，李鑫，叶玲*收稿日期：2022-07-18；修回日期：2023-05-10基金项目：国家杰出青年科学基金项目（81825005）通信作者：叶玲（1975-），女，四川成都人，教授，主要从事牙髓/骨生物学、干细胞调控的研究。E-mail：【摘要】间充质干细胞是目前硬组织再生与修复中最为重要的种子细胞，在临床应用中前景广阔，因此其命运调控以及定向分化机制一直是领域内的重点研究方向。但由于间充质干细胞的异质性以及对其定向分化调控机制尚未完全清楚等诸多原因，制约了间充质干细胞在临床治疗中的应用。近些年来越来越多的研究证明，在间充质干细胞成骨分化过程中表观遗传修饰发挥了重要调控作用；表观遗传调控异常与骨质疏松症的发生有关，且干预表观遗传修饰的小分子化合物具有改善骨质疏松的潜能。另一方面，营养物质代谢，尤其是葡萄糖代谢（糖代谢）不仅为细胞生理活动提供必需的能量物质，其代谢中间产物也是干细胞增殖、分化的调控因子；表观遗传修饰与糖代谢紧密关联，对间充质干细胞的生物学特性、命运决定起到至关重要的作用。在本文中，我们简要叙述了糖代谢和表观遗传修饰调控间充质干细胞成骨分化的研究进展和表观遗传在骨质疏松症中的临床应用前景。【关键词】间充质干细胞；成骨分化；表观遗传修饰；骨质疏松中图分类号：Q254文献标识码：A文章编号：2096-8965（2023）02-0057-15Research progress on the epigenetic and metabolicregulation on osteogenesis of MSCsShi Yu,Yin Bei,Li Xin,Ye Ling*(State Key Laboratory of Oral Diseases&National Clinical Research Center for Oral Diseases,West China Hospital of Stomatology,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan,China)【Abstract】Until now,mesenchymal stem cells(MSCs)are the most important candidates for calcified tissueregeneration and injury repair,showing broad clinical application prospects.Therefore,the mechanism of fatedetermination and differentiation regulation has been the fundamental question in the field.However,due to manyreasons,such as the heterogeneity and limited knowledge of regulatory mechanisms,the further investigation andclinical application of MSCs are restricted.In recent years,emerging studies have proved that epigeneticmodification plays an important regulatory role in the process of osteogenic differentiation of MSCs.Abnormalepigenetic regulation is associated with the development of osteoporosis,and small molecules that interfere withepigenetic modifications have the potential to improve osteoporosis.On the other hand,nutrient metabolism,especially glucose metabolism,is a necessary energy source for cell physiological activities and a regulatoryfactor for stem cell proliferation and differentiation.They are closely related and play a crucial role in the（口腔疾病研究国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，四川大学华西口腔医院，四川 成都 610041）DOI：10.12287/j.issn.2096-8965.2023020757（Biomedical Transformation），2023年6月，第4卷，第2期0前言颌面骨缺损多由创伤、炎症、肿瘤以及先天性发育不良等引起，严重影响患者颌面部外形美观，并引起口腔功能障碍1。在临床上常用的治疗方法包括自体骨移植、异体骨移植、人工骨移植等。但是由于自体骨骨量有限，异体骨有潜在的排斥反应，而人工骨因为力学活性以及生物学活性问题对临床应用造成局限。因此，基于间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）的硬组织修复手段有望成为治疗颌骨缺损的有效方法。目前已有报道，MSCs已经用于2型糖尿病2、中风3、心肌梗死4以及自身免疫疾病5等相关疾病的临床实验。MSCs的应用作为一种新型治疗手段，受到广泛关注。但是全球正在进行的MSCs临床研究大多处于早期阶段，随着试验进入后期，研究数量迅速减少。从发表在ClinicalTrials.gov上的数据可以看出，MSCs在临床期期的研究数目在500600项左右，而进展到期临床的研究数目降到60项左右（ClinicalTrials.gov，以MSCs和Clinical Trail为关键词）。有研究指出，临床试验数据可比性差、重复性欠佳的主要原因包括不同组织的MSCs存在异质性，对于MSCs生物学功能了解不足而导致的制备方法不同，以及MSCs在治疗时的传代数目有差异等等6。这些问题反应出 MSCs 的研究仍有欠缺，无法满足标准化、规模化的临床疾病治疗。而在骨骼研究领域，骨来源的MSCs已被报道可用于治疗大段骨缺损，骨折愈合以及颅颌面骨损伤修复的临床试验处于进展中7，8，但由于其定向分化调控机制不明，从而制约了其临床试验效果。近年来，越来越多的科学研究集中在探讨骨来源MSCs维持和分化过程中的调控机制。在这些研究进展中，表观遗传修饰调控MSCs对组织的维持和再生作用无疑是领域内的热点与重点之一9。在体内外实验中，表观遗传学修饰决定MSCs的分化方向10，11；并且表观遗传修饰的异常会导致MSCs功能障碍，其中包括增殖、凋亡以及炎症反应的发生12。因此，在MSCs生物学功能调控与命运决定的过程中，对表观遗传修饰的了解与研究，可为探讨MSCs的定向分化机制提供科学基础，同时也为其临床应用提供指导意义。1骨来源间充质干细胞在骨骼研究中常用的MSCs于 1968 年首次在骨髓内被分离出来，其具有良好的贴壁能力以及体外增殖能力，可自我复制，并且可以形成单克隆13；随后研究发现，骨来源的MSCs可以在体外特定诱导刺激下，分化成为中胚层的多种细胞（包括成骨细胞、脂肪细胞以及软骨细胞），内胚层细胞以及神经外胚层细胞14。位置分布上，MSCs常常聚集在血管周围，在获取养分的同时，也可以通过分泌细胞因子以及外泌体影响微环境14。目前越来越多的研究表明，骨来源的MSCs存在着异质性，不同硬组织来源的MSCs表达干细胞表面标志物的情况差异明显，在同一组织中干细胞的生物学特性以及种类也有区别15。尽管如此，由于 MSCs容易获得，并且具有多向分化能力以及低免疫原性等特点，仍然成为治疗多种骨骼疾病的潜在细胞群体16。2MSCs成骨分化中的表观遗传修饰调控近些年来，MSCs的表观遗传修饰逐渐成为干细胞分化领域的研究热点17。核小体是染色体最为基本的结构单元，由脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid，DNA）以及包裹在外侧的组蛋白构成。基因的表达受到转录因子和表观遗传学修饰共同的、动态的调控。因此，作用于DNA或是核心组蛋白层面上的各种表观遗传修饰酶成为研究的重点与核心（见图1）。2.1 DNA甲基化在多种表观遗传修饰的方式中，DNA甲基化中的 5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5 mC）修饰是研究比较深入的MSCs行为调控方式之一。在大多数的情况下，基因启动子区域的甲基化代表着基因表达被抑制。在体内和体外的实验中，众多基因启动子区域CpG岛的甲基化被报道调控着干细胞的分化。其中，10-11 易位家族（Ten-ElevenTranslocation Family，TET Family）去 甲 基 化 酶TET1、TET2、以及TET3在MSCs中都有明显的表达。动物实验证明，在小鼠体内敲除Tet1和Tet2基因会导致骨髓MSCs功能障碍，从而产生骨质疏松的表型11，18。biological characteristics and fate determination of MSCs.In this paper,we briefly describe the research progressof glucose metabolism and epigenetic modifications in regulating osteogenic differentiation of MSCs and theprospect of clinical application of epigenetics in osteoporosis.【Keywords】Mesenchymal stem cell;Osteogenic differentiation;Epigenetic modification;Osteoporosis58（Biomedical Transformation），2023年6月，第4卷，第2期DNMT1：DNA甲基化转移酶1；DNMT3B：DNA甲基化转移酶3B；TET1：10-11易位家族去甲基化酶TET1；TET2：10-11易位家族去甲基化酶TET2；N6AMT1：N-6腺嘌呤特异性DNA甲基转移酶1；ALKBH1：AlkB同系物1，组蛋白H2A双加氧酶；P2rx7：嘌呤能受体P2X7；Runx2：Runt相关转录因子2；Ocn：骨钙素；Dlx5：远中缺失同源盒基因5；Osx：Osterix；Pten：磷酸酶与张力蛋白同源物基因；SETDB1：SET结构域分叉的组蛋白赖氨酸甲基转移酶；LSD1：赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1；KDM4A：赖氨酸去甲基化酶4A；K；DM4B：赖氨酸去甲基化酶 4B；EZH2：Zeste同源物增强子 2；KDM6A：赖氨酸去甲基化酶 6A；KDM6B：赖氨酸去甲基化酶 6B；Cebpa：CCAAT/增强子结合蛋白 alpha；Sfrp4：分泌型卷曲相关蛋白 4；Dkk1：Wnt 抑制剂 Dickkopf-1；ASH1L：组蛋白甲基化转移酶ASH1L；NO66：蛋白核仁蛋白66；KDM2A：赖氨酸去甲基化酶2A；SETD2：含有set结构域的蛋白2；Aldh1a2：醛脱氢酶1家族成员A2；Ereg：表皮调节素；Sfrp2：分泌型卷曲相关蛋白2；Sox9：SRY（性别决定区域Y）相关的高迁移率族框族9；PCAF：p300/CBP相关因子；HDAC1：组蛋白去乙酰化酶1；HDAC3：组蛋白去乙酰化酶3；SIRT1：Sirtuin 1；SIRT3：Sirtuin 3；SIRT6：Sirtuin 6；Bmp2：骨形态发生蛋白2；Bmp4：骨形态发生蛋白4；Bmpr1B：骨形态发生蛋白受体1B；Jag1：Jagged1；Sost：硬骨素；Opg：骨保护素。图1MSCs成骨分化中的表观遗传调控另 一 方 面，DNA 甲 基 化 转 移 酶（DNAMethyltransferase，DNMT）抑制基因表达，负调控MSCs介导的硬组织再生。DNMT1负责维持已有的甲基化位点，DNMT3A以及DNMT3B则是在未发生甲基化的 DNA 上添加新的甲基基团19。DNA的甲基化状态与分化潜能有关，并进一步影响骨骼疾病的过程。例如，当MSCs经过DNMT1抑制剂处理后，伴随着基因组DNA的去甲基化以及成骨调控基因的表达增加，如 Runx2、骨钙素（Osteocalcin，Ocn），远 中 缺 失 同 源 盒 基 因 5（Distal-less Homeobox 5，Dlx5）和Osterix（Osx），同 时，成 骨 分 化 特 异 染 色 显 示 碱 性 磷 酸 酶（Alkaline Phosphatase，ALP）活性和矿化也有明显增强20。与此类似，DNMT 家族中的 DNMT3B 也参与调控了MSCs的成骨分化。敲除骨髓MSCs中的DNMT3B降低了磷酸酶与张力蛋白同源物基因（Phosphatase and Tensin Homolog，PTEN）启动子的DNA甲基化水平，从而上调Pten表达，促进了骨髓MSCs的成骨潜能21。最新研究成果显示，DNA 的另一种甲基化修饰形式N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenine，6mA）修饰不但可以调控胚胎干细胞的发育过程22，而且对MSCs的成骨分化也起到负调控作用23。这个过程 中，AlkB 同 系 物 1，组 蛋 白 H2A 双 加 氧 酶（AlkBHomolog1,HistoneH2ADioxygenase，ALKBH1）作为一种去甲基化酶，N-6腺嘌呤特异性 DNA 甲基转移酶 1（N-6 Adenine-specific DNAMethyltransferase 1，N6AMT1）作为甲基化酶共同59（Biomedical Transformation），2023年6月，第4卷，第2期调节6mA的修饰。前者被证明在MSCs成骨分化以及损伤修复中不可或缺23，但是后者对 DNA 的6mA甲基转移酶作用仍有争议24。2.2 组蛋白修饰2.2.1 组蛋白甲基化目前，已知的被广泛研究的甲基化位点包括组蛋白 3（Histone 3，H3）的第四位赖氨酸残基（Lysine 4，K4）、K9、K27、K36和K79以及组蛋白H4的K2025。H3K4、H3K36和H3K79的甲基化通常被认为是转录和基因表达活跃的标志，而H3K9、H3K27和H4K20的甲基化通常与染色质浓缩和基因活性抑制有关26。组蛋白甲基化修饰依赖于组蛋白甲基转移酶（Histone Methyltransferase，HMT），而组蛋白去甲基化酶（Histone Demethylase，HDM）的发现证明了组蛋白甲基化是一个可逆的过程。甲基化过程的调控是由HMT和HDM两类酶相反的活性所动态控制，通过与特定的组蛋白残基结合，调控蛋白甲基化和去甲基化的功能27。2.2.1.1 H3K9me3作为特异性催化H3K9的甲基转移酶SET结构域分叉的组蛋白赖氨酸甲基转移酶1（SET DomainBifurcatedHistoneLysineMethyltransferase1，SETDB1），在调控MSCs成骨分化过程中具有重要作用。SETDB1可与成骨重要调控基因Runx2启动子区结合，诱导H3K9甲基化修饰在其上的积累，抑制 Runx2 的转录活性28。赖氨酸去甲基化酶 4A（Lysine Ddemethylase 4A，KDM4A）与KDM4B也是H3K9去甲基化酶，在MSCs定向分化中起到重要作用。Kdm4a在成骨和成脂分化过程中表达升高，然而，过表达Kdm4a阻碍了ST2细胞（小鼠骨髓基质细胞系）和原代骨髓MSCs的成骨分化。最新研究报道，在MSCs中靶向Kdm4b的治疗策略不仅可以调节成骨与成脂肪分化异常，而且可以逆转细胞衰老，达到骨骼健康的目的29。2.2.1.2 H3K27me3Zeste 同 源 物 增 强 子 2（Enhancer of ZesteHomolog 2，EZH2）是另一种组蛋白甲基转移酶，是 多 梳 抑 制 性 复 合 物 2（Polycomb RepressiveComplex 2，PRC2）的催化亚基，其特异性催化H3K27的甲基化。有文章报道，Ezh2抑制骨骼发育和成骨分化30，31；药物抑制和siRNA介导的Ezh2敲除均可降低转录起始区附近H3K27me3水平，从而刺激相关骨基因的表达，促进MSCs的成骨分化32。Kdm6a和Ezh2在MSCs成骨或成脂分化过程中具有相反的作用，Kdm6a的过表达通过降低Runx2和Ocn启动子区域的H3K27me3甲基化水平，从而增加了Runx2和Ocn的表达33。同时，在小鼠成骨细胞系MC3T3细胞和原代成骨细胞中，Kdm6a的表达在成骨细胞分化过程中升高，外源性抑制KDM6A 导致 Osx 和 Runx2 的启动子活性降低34。KDM6A可降低H3K27me3对Wnt抑制剂Dickkopf-1（Dkk1）启动子的富集，从而阻碍了成骨细胞功能。2.2.1.3 H3K4me3和H3K36me3另一方面，染色质活化型的表观遗传修饰H3K4me3以及H3K36me3在MSCs成骨分化过程中起到正相关作用，可以作用于成骨相关基因的启动子区域上，从而促进成骨分化10，35。含有Jmjc结构域 的 蛋 白 核 仁 蛋 白 66（Nucleolar protein 66，NO66）是 激 活 型 组 蛋 白 修 饰 H3K4me3 和H3K36me3的组蛋白去甲基化酶。NO66通过其去甲基化酶活性以及 NO66 与 Osx 之间的相互结合，抑制了Osx的转录因子活性，从而抑制了Osx下游靶基因的转录，抑制MSCs的成骨分化，最终导致成骨受损36。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶 1（Lysine-Specific Histone Demethylase 1，LSD1）能特异性地去除组蛋白H3K4和H3K9的单和双甲基化修饰。近期，Science Advances报道LSD1在Prx1阳性MSCs中的缺失导致骨折延迟愈合并发生骨不连的症状，这项研究证明，LSD1在骨缺损中的关键作用37。此外，Yu 等38发现在根尖乳头干细胞中，KDM2A通过降低 Sfrp2启动子处的 H3K4me3和 H3K36me2来抑制 Sfrp2的转录，而 SFRP2被报道可以通过Osx增强成骨分化，因此认为KDM2A在MSCs成骨、成牙过程中起到负调控功能。与之对应的，含有 set 结构域的蛋白 2（SetDomainContaining2，SETD2）可 以 催 化H3K36me3 的修饰水平，提升 MSCs 的成骨能力，同时抑制其脂肪向分化的能力。在小鼠模型中特异地敲除 MSCs 中的 Setd2，明显地导致骨量丢失，同时骨髓腔中脂肪细胞含量显著升高10。此外，H3K4me3的甲基化水平可被组蛋白甲基化转移酶ASH1L（Absent,Small,or Homeotic-Like，ASH1L）调控，后者的过表达可以促进MSCs成骨、成软骨向分化，抑制脂肪向细胞分化35。2.2.2 组蛋白的乙酰化组蛋白乙酰化是另一种表观遗传修饰，促进转录激活；相应的，组蛋白去乙酰化会导致染色质紧凑，进而转录被抑制39。乙酰化转移酶（Histone60（Biomedical Transformation），2023年6月，第4卷，第2期Acetyltransferases，HATs）介导组蛋白乙酰化，并被报道参与MSCs的成骨分化。例如，乙酰化转移酶 p300/CBP 相 关 因 子（p300/CBP-AssociatedFactor，PCAF）通过在骨形态发生蛋白 2（Bonemorphogenetic protein，Bmp2）、Bmp4、骨形态发生 蛋 白 受 体 1B（Bone morphogenetic proteinreceptor,Type 1B，Bmpr1B）等基因启动子区富集H3K9 乙酰化（H3K9-Acetyl，H3K9ac）修饰，活化BMP通路进而促进成骨分化，增加骨量40。组蛋白去乙酰化，是由组蛋白去乙酰化酶家族（Histone Deacetylases，HDACs）调控的。H3K9ac是组蛋白乙酰化常见的修饰，据报道调控它的去乙酰化酶HDAC3，4，5，7在软骨内骨化中不可或缺，其中，在软骨中特异敲除Hdac3会导致胚胎死亡，而出生后敲除Hdac3延迟了钙化形成以及生长板处软骨成熟，同时也会导致破骨细胞活性增强41，42。研究表明43，Sirtuin 蛋白通过作用于 MSC 和成骨细胞，在正常骨骼发育和稳态中发挥关键作用，其失调可能与不同的骨骼疾病有关。线粒体去乙酰化酶SIRT3，在细胞传代过程中表达水平下降，表现为氧化应激减弱以及细胞衰老，Sirt3的敲除降低MSCs分化为脂肪和成骨细胞的能力；Sirt1也在骨组织发育中必不可少，在成年小鼠中敲除Sirt1明显降低松质骨和密质骨的骨量44。体内实验证明，使用Prx1-Cre小鼠在MSCs中过表达Sirt1，可以通过促进MSCs的成骨分化，增加骨细胞在系统中的累积进而增加年轻小鼠（1月龄）和老年小鼠（18月龄）的骨密度，这充分说明Sirt1在MSCs衰老过程中对成骨分化的关键作用45，46。Sirt家族的Sirt6对骨稳态的维持同样至关重要。成骨细胞特异的敲除Sirt6，影响H3K9的去乙酰化修饰，降低了骨保护素（Osteoprotegerin，OPG）的表达水平；随后因OPG旁分泌作用的减弱，使得破骨细胞活性增加，导致骨量丢失47。3表观遗传与骨质疏松症尽管有文献报道48，骨质疏松患者与健康成人的外周血全基因组 DNA 甲基化谱并无显著差异，但通过比较正常妇女和绝经后骨质疏松妇女的全血DNA样本，发现了77个显著差异甲基化的CpG位点，表明雌激素相关的这一类骨质疏松可使用全血DNA甲基化分析49，预估发病风险，使患者从早期治疗干预中受益。与全血组织相比，局部的骨组织中成骨相关基因的DNA甲基化水平可能在原发性骨质疏松症的发病机制中发挥更为主要的“开关”作用。与非骨质疏松的骨折组织比较，骨质疏松的骨折组织中 Sost 基因启动子去甲基化50，而Opg51和 核 因 子 E2 相 关 因 子 2（Nuclear FactorErythroid Derived 2-related factor-2，Nrf2）52的基因启动子甲基化水平较高，从而影响了上述基因的转录。此外，HAT1、HDAC6 和 DNMT3A 在绝经后骨质疏松症患者的骨小梁组织样本中表达显著降低，并且与骨矿物质密度指标、OPG水平显著相关53。有报道称在个体增龄过程中，H3K9me3以及H3K27me3在成骨相关基因的启动子区域富集，导致MSCs成骨向分化能力减弱，在小鼠体内表现为骨量丢失以及骨髓脂肪积累的表型29-31。在糖皮质激素诱导的骨质疏松小鼠中，H3K27去甲基化酶组蛋白KDM6A表达下调，从而使Runx2和Osx基因的 H3K27me3 水平升高，抑制二者的转录54。EZH2的抑制剂GSK126可降低上述基因启动子区的H3K27甲基化水平，有助于上调成骨相关基因的表达，具有促进成骨和恢复骨量的潜能。研究者使用卵巢切除术（Ovariectomy，OVX）模型模拟绝经后骨质疏松症，术后每天注射 50 mg/kg 的GSK126，发现 GSK126刺激骨形成而不影响骨吸收，对骨质疏松的治疗具有重要的应用前景55。且GSK126可与BMP2联合用药，促进小鼠颅骨临界缺损的愈合，同时降低BMP2用药的成本及不良反应56。此外，EZH2的抑制剂EPZ-6438在体外实验中刺激成骨细胞生成方面比GSK126 更有效，而其体内效果尚待进一步研究，针对EZH2的化合物的开发为骨增强策略提供了机会57。除H3K27甲基化修 饰 外，H3K4 甲 基 化 也 参 与 了 骨 质 疏 松。H3K4me3 去甲基化酶 KDM5A 的转录水平在骨质疏松患者的BMSCs中较对照组明显上调，因此降低了Runx2启动子上的H3K4me3水平，抑制Runx2的基因表达。KDM5A抑制剂JIB-04可以部分挽救骨质疏松症的骨质流失58。Pargyline是LSD1的抑制剂，pargyline可通过提高成骨相关基因启动子区域 的 H3K4 二 甲 基 化 水 平，挽 救 了 OVX 小 鼠BMMSCs的成骨分化能力，改善老年或卵巢切除小鼠模型的骨质疏松状况59。除组蛋白甲基化外，干预组蛋白乙酰化修饰也是调节骨重塑失衡和治疗骨质疏松等疾病的潜在靶点。广泛控制氨基酸合成蛋白 5（General Controlof Amino-Acid Synthesis 5，GCN5）是一种重要的组蛋白乙酰基转移酶，可乙酰化 H3K9/14 位点；61（Biomedical Transformation），2023年6月，第4卷，第2期Gcn5-慢病毒表达载体注入小鼠股骨骨髓，可防止OVX后股骨的骨矿物质密度下降和骨小梁丢失60。临床前研究表明，用SIRT激动剂治疗对小鼠衰老以及绝经引起的骨质疏松症具有保护作用，包括SIRT1激动剂白藜芦醇61，62、SRT172044、SRT210463和SRT302564，其机制为刺激骨形成、抑制骨吸收和减少Sost水平。除上述骨质疏松模型外，SIRT1的激活可防止使用糖皮质激素的骨质流失和废用性骨质疏松症65。花青素是SIRT6的激动剂，动物实验表明，花青素治疗通过抑制破骨细胞的形成和骨吸收来保护 OVX 小鼠的骨质流失48。除 Sirt 家族外，另一类组蛋白去乙酰化酶家族也被证明有治疗骨质疏松的潜能。HDAC1抑制剂丙戊酸预处理可以部分挽救机械卸荷引起的骨质疏松49。此外，局部注射 HDAC 的抑制剂曲古柳菌素（TrichostatinA，TSA）可促进大鼠实验性牙周炎的牙周组织修复，有望成为牙周组织修复的潜在治疗选择66。HDAC2和HDAC3的选择性抑制剂MI19能在体外和体内促进hBMSCs成骨分化，表现出在骨增强策略中的治疗潜力67。除组蛋白乙酰化外，有研究表明50干预 DNA甲基转移酶也是治疗骨质流失的策略，研究者采用小鼠尾部悬吊法建立后肢去负荷动物模型后发现，机械性卸载导致大鼠股骨组织中DNMT1上调。在大鼠的髓内局部注射 Dnmt1 小干扰 RNA（smallinterfering RNA，siRNA）可挽救废用性骨质疏松症模型导致的组织病理学变化。另有研究表明，后肢去负荷小鼠的 BMSCs中具有高水平的 Dnmt3b，通 过 DNA 甲 基 化 机 制 下 调 了 Sonic Hedgehog（Shh）的表达，从而抑制了成骨分化；DNMT3B抑制剂 Nanaomycin A 可使骨量、骨矿物质密度、骨小梁数量和厚度有不同程度的改善51。溴结构域和端外结构域（Bromodomain andExtra-Terminal Domain，BET）蛋白家族选择性地识别并结合到乙酰化组蛋白，是一类重要的“组蛋白阅读蛋白”，BET抑制剂如N，N-二甲基乙酰胺（N，N-Dimethylacetamide，DMA）、JQ1及其衍生物 ND、N-甲基吡咯烷酮（N-Methyl Pyrrolidone，NMP）通过抑制BET对乙酰化组蛋白的结合发挥作用，动物实验表明，上述药物能抑制OVX相关的骨质疏松症中的病理性骨质流失，是潜在的骨质疏松症治疗候选药物52-53，68-70。靶向表观遗传的干预措施尤其是小分子化合物的激动剂和抑制剂有望成为新的治疗手段（见表1）。表1表观调控小分子化合物在骨质疏松症临床前研究中的应用调控剂GSK12655JIB-0458Pargyline59丙戊酸49Nanaomycin A51DMA/JQ1/NMP52，53，68-70白藜芦醇/SRT1720/SRT2104/SRT302544，61-64花青素48调控剂类型小分子抑制剂小分子抑制剂小分子抑制剂小分子抑制剂小分子抑制剂小分子抑制剂小分子激动剂小分子激动剂靶分子EZH2KDM5ALSD1HDAC1DNMT3BBETSIRT1SIRT6靶分子类型组蛋白甲基转移酶组蛋白去甲基化酶组蛋白去甲基化酶组蛋白去乙酰化酶DNA甲基转移酶组蛋白阅读蛋白组蛋白去乙酰化酶组蛋白去乙酰化酶生物学功能降低Runx2和Osx基因启动子区H3K27me3水平，刺激骨形成上调Runx2基因启动子区H3K4me3水平，挽救骨质流失上调成骨相关基因启动子区H3K4me2水平，挽救OVX BMSCs的成骨分化能力挽救骨质疏松上调Shh水平，改善骨量、骨矿物质密度、骨小梁数量和厚度抑制BET与乙酰化组蛋白结合，抑制骨质流失刺激骨形成、抑制骨吸收和减少Sost水平抑制破骨细胞形成和骨吸收动物模型OVX骨质疏松OVX骨质疏松OVX/衰老骨质疏松机械卸荷所致骨质疏松后肢卸荷所致骨质疏松OVX骨质疏松衰老/绝经/糖皮质激素/废用性骨质疏松OVX骨质疏松62（Biomedical Transformation），2023年6月，第4卷，第2期4葡萄糖代谢与骨除了上述的表观遗传修饰外，葡萄糖代谢（糖代谢）对MSCs定向分化也十分重要，并且可以直接或间接调控表观遗传修饰水平。糖代谢不仅为机体消耗能量的生物学功能提供所需的三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP），还可以提供细胞分裂过程中合成代谢反应所必需的中间产物。实验证明，细胞ATP的主要来源之一是葡萄糖。糖代谢可被分为氧化磷酸化（在线粒体中完成）和有氧糖酵解（在细胞质中完成）。葡萄糖主要通过特殊的葡 萄 糖 转 运 蛋 白 家 族（Glucose Transporter，GLUT）转运到细胞中57。随后，葡萄糖经历一系列生化反应，产生丙酮酸和两个ATP分子71。丙酮酸可以通过单羧酸转运蛋白进入线粒体中，发生氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation，OXPHOS）并产生ATP分子72。丙酮酸也可以在细胞质内，在乳酸脱氢酶 A（Lactate Dehydrogenase A，LDHA）的作用下发生有氧糖酵解，转化为乳酸；在产生乳酸的同时，还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NADH）被转化 为 氧 化 型 的 烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸（Nicotinamide Aadenine Ddinucleotide+，NAD+）（见图2）。NADH：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NAD+：氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；ATP：腺嘌呤核苷三磷酸；ADP：腺嘌呤核苷二磷酸；FADH2：还原型黄素二核苷酸；FAD：黄素腺嘌呤二核苷酸；SAM：S-adenosyl methionine（S-腺苷甲硫氨酸）；Met：甲硫氨酸；SAH：S-腺苷同型半胱氨酸；meTHF：5,10-亚甲基四氢叶酸；mTHF：5-甲基四氢叶酸；ACLY：ATP柠檬酸裂合酶；虚线代表两者之间中间有省略的步骤。图2能量代谢示意图有报道认为，在干细胞向体细胞分化的不同阶段，对于能量代谢的使用方式会发生明显的改变，在干细胞阶段，细胞更加倾向于使用糖酵解；而在分化过程中，细胞更倾向于使用氧化磷酸化73-75。在MSCs分化中，成骨向分化的细胞倾向于使用糖酵解产生ATP；而成脂肪向分化的细胞倾向于使用氧化磷酸化的方式提供细胞生理反应所需的能量76。这种特异的方式对细胞高效使用环境中的能量物质、减少分子水平活性氧自由基的损伤以及维持特定的表观遗传修饰至关重要。在成骨分化过程中，葡萄糖代谢起到重要作用。在成骨细胞中可以检测到GLUT1和GLUT3的表达77，78。并且，GLUT1被证明是原代成骨细胞中葡萄糖的主要转运蛋白，并通过抑制腺苷5-单63（Biomedical Transformation），2023年6月，第4卷，第2期磷酸激酶和阻断 RUNX2 的泛素化来调节 RUNX2的翻译后修饰；体外和体内实验证明，成骨细胞前体中选择性缺失 Glut1 会抑制成骨细胞的分化79。同时也有报道称，在新生儿颅骨成骨细胞中，Glut4在成骨分化过程中及胰岛素刺激葡萄糖摄取的作用下表达量增加，但是Glut4基因缺失不会导致明显的骨骼表型66。因此，未来的研究需要了解在体内成骨细胞中不同GLUT转运蛋白之间潜在的功能冗余。在葡萄糖经过GLUT家族介导进入细胞后，对于MSCs成骨分化过程中糖的使用方式，一直都存在争论。一部分研究认为80-82，和肿瘤细胞类似，MSCs响应成骨信号的同时，发生有氧糖酵解（又称 Warburg Effect），终产物为乳酸。WNT 可以通过哺乳动物雷帕霉素复合物 2（mammalian Targetof Rapamycin Complex 2，mTORC2）途 径 促 进MSCs细胞系ST2摄取更多的葡萄糖，并且产生更多的乳酸67。Notch通过抑制糖酵解从而抑制MSCs的成骨分化83。BMP2在软骨内骨化过程中，通过mTORC1-缺氧诱导因子（Hypoxia Inducible Factor，HIF）通 路 促 进 Glut1 表 达，从 而 促 进 葡 萄 糖代谢84。另一部分研究认为，由于MSCs分化需要大量ATP，因而普通糖被代谢后会进入三羧酸循环，发生氧化磷酸化。例如，MSCs 在成骨诱导液刺激下，氧化磷酸化活性增强，同时伴随有糖酵解的减弱；在成脂肪分化的细胞中却展现出糖酵解的明显增强，氧化磷酸化不变的现象。机制层面，通过实验分析发现NAD+介导的线粒体氧化磷酸化水平的改变是改变干细胞定向分化的主要原因之一85。因此，深入研究糖代谢的发生机制并解决这一争论，对靶向糖代谢治疗骨相关疾病有着重要的指导意义。5糖代谢对表观遗传修饰的影响糖代谢除了为细胞和组织提供生存所必需的ATP之外，其催化反应还提供了细胞合成新的生物物质所必需的中间产物，这些中间产物可以重新合成，并以核苷酸、磷脂和氨基酸的形式存在，且在表观遗传学的调控中起到重要作用。例如，单碳代谢过程中产生的 S-腺苷甲硫氨酸（S-AdenosylMethionine，SAM），糖酵解过程中产生的乙酰辅酶 a，三羧酸循环中产生的黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide，FAD）和-酮戊二酸（-Ketoglutaric Acid，KG），糖酵解以及氧化磷酸化中产生的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NicotinamideAdenine Dinucleotide，NAD）等等都是代谢过程中产生的对表观遗传修饰不可或缺的中间产物86。5.1 糖代谢与表观遗传修饰甲基化目前，已知葡萄糖通过相应酶的代谢被分解为葡萄糖-6-磷酸，进而形成果糖-6-磷酸，随后形成3-磷酸甘油醛，通过磷酸戊糖途径形成核苷酸。3-磷酸甘油醛经过代谢产生的3-磷酸甘油酸酯通过单碳代谢产生非必需氨基酸丝氨酸和甘氨酸87。单碳代谢是一系列复杂的循环反应，涉及单个碳原子的转移，包括三种途径：叶酸循环、甲硫氨酸循环和转硫途径88。这些循环联合作用在细胞增殖过程中，提供合成磷脂和核苷酸所必需的碳单元89，单碳代谢还可能通过NADPH的氧化和谷胱甘肽的生成（通过转硫途径）来调节细胞水平的氧化还原状态。叶酸在细胞内代谢为四氢叶酸，随后代谢为5,10-亚甲基四氢叶酸以及5-甲基四氢叶酸，这个过程后一个碳原子可以被加到同型半胱氨酸上形成甲硫氨酸，随后通过甲硫氨酸的腺苷酰（化）作用，产生 SAM90，而后者作为重要的甲基供体，可参与 DNA在 5甲基胞嘧啶处的甲基化91以及组蛋白H3K4的甲基化92等甲基化事件。甲基基团可以从SAM上转移