XPA基因内含子区rs31...8多态性与乳腺癌易感性分析_闵建平.pdf

甘肃医药 2023 年 42 卷第 6 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.6单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位点可能通过影响基因的甲基化、转录子结合、剪切、mRNA 降解等导致基因表达的变化1，从而造成乳腺癌易感性的差异。目前对于乳腺癌易感基因SNPs 的研究，主要集中在基因外显子和启动子区域的SNPs2，对于内含子区域 SNPs 的关注较少。然而，多项研究发现，内含子的剪接对于 mRNA 代谢几乎每一步骤都产生影响3。此外，内含子 mRNA（intron-containingmRNA）对多种肿瘤的转录多样性具有重要作用4。例如，在家族性乳腺癌患者的研究中发现，P53 基因内含子上 13964GC 的突变，使乳腺癌细胞对于顺铂引发的凋亡产生耐受5。可见对于乳腺癌相关基因的内含子区域 SNPs 进行研究具有重要价值。核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）是 DNA 修复系统的四种机制之一6。着色性干皮病A（xeroderma pigmentosum A，XPA）蛋白是着色性干皮病所缺乏的 8 种因子之一7，对于转录偶联的 NER（transcription-coupledNER，TC-NER）和全基因组 NER（global genome NER，GG-NER），XPA 蛋白都是不可缺少的因子8。XPA 蛋白可以通过转录控制和转录后调控来调节 NER9。从功能上来说，XPA 蛋白主要负责识别 DNA 损伤、稳定修复中间体以及将其他 NER 因子运送到 DNA 损伤部位10。由于 XPA 在 NER 中具有关键作用，结合对于 XPA 蛋白结构与功能的研究报道11，我们推测 XPA 基因的 SNPs 可能影响 XPA 蛋白的折叠或性能，从而影响 NER 的功能，可能对于乳腺癌的易感性具有影响。本研究中我们通过在线软件查找 XPA 基因内含XPA 基因内含子区 rs3176658 多态性与乳腺癌易感性分析闵建平宋丽娟王兰王海涛郭欢胡清荣王千千白晓蓉张斌明朱公建甘肃省医学科学研究院/甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州 730050【摘要】目的：探讨着色性干皮病 A（XPA）基因单核苷酸多态性（SNPs）与汉族女性人群中乳腺癌易感性的关系，以甘肃省居住的汉族散发性乳腺癌 101 例和乳腺纤维腺瘤 101 例作为研究对象。方法：结合在线预测与文献回顾，筛选出 XPA 基因 rs3176658（CT）SNPs 位点，使用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法，提取基因组 DNA 进行 rs3176658 位点 SNP 分型检测。结果：研究结果显示，XPA 基因 rs3176658 位点多态性与甘肃地区女性乳腺癌易感性相关，突变型 T/T 携带者增加乳腺癌发病风险（2=4.641，PT）SNPs of XPA gene werescreened out，and PCR-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）was used to extract genomic DNA for SNP typing of rs3176658.Results：The results showed that the polymorphism of rs3176658 site of XPA gene was associated with the susceptibility of female breast cancerin Gansu Province，and the mutation of T/T carriers increased the risk of breast cancer（2=4.641，P0.05）。1.2试剂与仪器全血 DNA 提取试剂盒以及限制性核酸内切酶 Mlu（日本 TaKaRa 公司），Go Taq GreenMaster Mix（美国 Promega 公司），琼脂糖（美国 Invitrogen 公司），PCR 仪、电泳系统、凝胶成像系统（美国 Bio-Rad 公司）。1.3免疫组化对纳入研究的乳腺癌患者术后组织病理切片，采用免疫组化 SP 法检测 ER、PR、Her-2、P53及 Ki67 蛋白的表达。ER 与 PR 的阳性判断标准：Allred 评分3，核阳性细胞数10%。Her-2 阳性判断标准：以阳性细胞数和胞膜染色强弱进行分级，无染色或胞膜染色细胞数0%为（-）；胞膜不持续染色的细胞数10%为（+）；胞膜完整染色细胞数 10%30%为（+）；胞膜强染色的细胞数30%为（+）；样本（-）和（+）为阴性，（+）为阳性，（+）需经 FISH 进一步检测确认。P53 阳性判断标准：核阳性细胞数25%。Ki67 阳性判断标准：核阳性细胞数10%。1.4血液标本采集与 DNA 提取纳入研究的乳腺癌患者在化疗前、乳腺良性肿物患者在治疗前，抽取静脉抗凝血 3mL，按照试剂盒方法立即分离白细胞基因组DNA，置于-80保存。1.5SNP 位点选择采用美国生物技术信息中心（NCBI）dbSNP 数据库和 PolymiRTS3.0 数据库预测核苷酸切除修复相关基因 XPA 可能存在的 SNPs 位点。1.6基因型检测与分析使用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction amplification，PCR-RFLP）分析方法进行基因表型分析。根据 HapMap 提供的XPA 序列，设计 XPA rs3176658 位点引物，F：TAG CTGGAA TTA CAG GTA CGC G；R：GAA CTG TTT CTCCCA GCA AGT C，由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR 反应总体积 25L：DNA 模板 1.2L、上下游引物各 0.35L、Green Mster Mix 12.5L，ddH2O 10.6L。PCR 条件为：94预变性 4min 后，于 9430s、5730s、7215s，进行 37 个循环，最后 72延伸 10min。根据说明书取 10L PCR 产物与限制性核酸内切酶 Mlu于37消化 16h。3.5%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。1.7统计学分析先进行 Hardy-weinberg（哈代温格）平衡检验，采用 2检验 Hardy-weinberg 平衡，以群体处于 Hardy-weinberg 平衡状态为假设前提，证明研究样本的群体代表性，然后进行关联分析。统计运用 SSPS16.0版统计软件，采用 2检验比较病例组与对照组间基因型分布频率的差异。使用 Fisher 法计算确切 P 值，以非条件Logistic 回归法计算相对危险度的比值比（OR）及其 95%可信区间（95%CI）。P0.05 表示差异有统计学意义。2结果2.1XPA 基因 SNP 位点的选择和酶切分析通过NCBI 中 dbSNP 数据库筛选，我们挑选 XPA 内含子上MAF0.1 的 SNP 位点，再结合文献回顾，发现有必要对 XPA 基因 rs3176658 与乳腺癌易感性性进行研究。XPA 基因 rs3176658 野生型 C/C 只有 223bp 一个片段（缺乏 Mlu酶切位点），突变型 T/T 的酶切产物为 205bp和 18bp 两个片段，杂合型 C/T 有 223bp、205bp 和 18bp三个片段。见图 1。2.2XPA 基因 rs3176658 基因多态性与乳腺癌发病风险研究经哈代温伯格平衡检验，对照组乳腺纤维腺瘤患者 rs3176658 位点基因频率符合哈代温伯格平衡（2=2.341，df=1，P=0.126）。乳腺癌组中，C/C 基因型频率482甘肃医药 2023 年 42 卷第 6 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.6表 2rs3176658 位点多态性与乳腺癌临床病理特征相关性的分析表 1XPA 基因 rs3176658 位点多态性与乳腺癌易感性的相关性分析为 0.545（55/101）；C/T 为 0.366（37/101）；T/T 为 0.089（9/101）。乳腺纤维腺瘤对照组中，C/C基因型频率为0.594（60/101）；C/T 为 0.386（39/101）；T/T 为 0.020（2/101）。2检验结果表明：XPA 基因 rs3176658 在乳腺癌组，与C/C 基因型比较，C/T 型的肿瘤发病风险没有差异（P0.05）；T/T 型增加乳腺癌发病风险。同时，与 C/C 基因型比较，C/T+T/T 基因型不增加乳腺癌发病风险（P0.05）；与 C/C+C/T 基因型比较，T/T 基因型增加乳腺癌发病风险（P0.05）（见表 1）。与乳腺纤维腺瘤肿患者相比，T/T 基因型乳腺癌患者相对于C/C 基因型或 C/C+C/T 基因型乳腺癌患者，乳腺癌发病风险分别增加4.909 倍（OR=4.909）和 4.842 倍（OR=4.842）。SNP基因型乳腺癌组乳腺纤维腺瘤对照组2POR（95%CI）rs3176658CC55（54.45）60（59.41）CT37（36.63）39（38.61）0.0130.9081.035（0.5801.848）TT9（8.91）2（1.98）4.6410.0314.909（1.01623.721）显性模型（CT+TT）/CC0.5050.4771.224（0.7012.138）隐形模型 TT/（CC+CT）4.7110.0304.842（1.01923.004）2.3XPA rs3176658 基因型与乳腺癌临床病理特征的关系应用非条件 Logistic 回归分析，通过年龄矫正，比较不同基因型与乳腺癌特异性肿瘤标志物孕激素受体（progesterone receptor，PR）、雌激素受体（estrogen receptor，ER）、人表皮生长因子受体 2（human epidermalgrowth factor receptor 2，Her-2）、P53、Ki67 及淋巴结转移（LN）的相关性。结果表明 XPA 基因 rs3176658 位点多态性与上述乳腺癌临床病理学指标的表达差异不显著。见表 2。病理特征基因型数量（%）POR（95%CI）阳性阴性ERCC3025参考基因CT21140.6171.245（0.5272.945）TT620.2862.507（0.46413.538）显性模型0.4151.403（0.6213.172）隐性模型0.3232.305（0.44112.075）PRCC2629参考基因CT19170.6271.232（0.5302.866）TT620.1583.373（0.62418.239）显性模型0.3551.458（0.6563.204）隐性模型0.1793.109（0.54916.268）Her-2CC1936参考基因CT12240.9611.023（0.4182.502）TT350.7871.237（0.2655.761）显性模型0.8931.060（0.4572.457）隐性模型0.7901.226（0.2745.481）P53CC2925参考基因CT14200.2570.605（0.2541.442）TT710.1046.010（0.69152.267）显性模型0.6520.829（0.3681.868）隐性模型0.0717.145（0.84360.568）Ki67CC1639参考基因CT9260.1791.823（0.7594.377）TT350.1903.107（0.57016.943）显性模型0.1021.998（0.8724.580）隐性模型0.2862.471（0.46913.023）LNCC1131参考基因CT11110.0692.760（0.9228.261）TT250.7441.303（0.2147.940）显性模型0.1032.337（0.8436.479）隐性模型0.9050.899（0.1565.179）483甘肃医药 2023 年 42 卷第 6 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.63讨论本研究采用病例对照的方式，采集了 101 例乳腺癌病例作为癌症组，采集 101 例健康人作为对照组。同时，根据世界卫生组织 2012 年对乳腺纤维腺瘤的定义12，乳腺纤维腺瘤为起源于终末导管小叶单位的界限清楚的乳腺肿块，故本课题采集 101 例乳腺纤维腺瘤病例同时设为对照组。由于健康人组哈代温伯格检测不平衡，未能纳入进一步的数据分析，因此本课题将乳腺纤维腺瘤病例作为对照组。关于 rs3176658 多态性与肿瘤易感性关系的研究较少。Annah 等报告 rs3176658 位点 SNPs 与头颈癌易感性无相关13；Doherty 等报告 rs3176658 位点 SNPs 总体上与子宫内膜癌易感性无相关，但是在“高风险”妇女组（指连续使用雌激素 6 个月以上），rs3176658 位点SNPs 与子宫内膜癌易感性相关（未提供详细数据）14；Lori 等报告 rs3176658 位点 SNPs 与肺癌的易感性相关，且女性中较男性更为明显15。本课题对于 XPA 基因 rs3176658 位点 SNPs 与乳腺癌这一病种的易感性进行了研究，报告了 XPA 基因内含子 rs3176658 位点 SNPs 与乳腺癌易感性相关，rs3176658 位点突变型 T/T 增加乳腺癌易感性。参考文献1Deng N，Zhou H，Fan H，et al.Single nucleotide polymorphisms andcancer susceptibility J.Oncotarget，2017，8（66）：110635-110649.2 Easton D F，Pharoah P D，Antoniou A C，et al.Gene-panel sequencingandthepredictionofbreast-cancerrisk J.NEngl JMed，2015，372（23）：2243-2257.3 Shaul O.How introns enhance gene expression J.Int J Biochem Cell Biol，2017，91（Pt B）：145-155.4 Dvinge H，Bradley RK.Widespread intron retention diversifies mostcancer transcriptomes J.Genome Med，2015，7（1）：45.5 Lehman T A，Haffty B G，Carbone C J，et al.Elevated frequency andfunctional activity of a specific 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个数字之间不得加顿号，例如一两千米、七八十岁；（3）带有“几”字的数字表示的概数，例如十几、几十万分之一；（4）中国及世界各国、各民族的非公历纪年；（5）含有月日简称表示事件、节日和其他特定含义的词组中数字；（6）古籍参考文献中的数字。读者 作者 编者484