‘红颜’草莓果实成熟过程中...累及合成途径基因表达的分析_彭贞贞.pdf

彭贞贞，钟传飞，王宝刚，等.红颜草莓果实成熟过程中花色苷积累及合成途径基因表达的分析 J.食品工业科技，2023，44（14）：346354.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022090106PENG Zhenzhen,ZHONG Chuanfei,WANG Baogang,et al.Analysis of Anthocyanin Accumulation and Gene Expression ofAnthocyanin Synthesis Pathway during Fruit Ripening of Benihoppe StrawberryJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(14):346354.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022090106 贮运保鲜 红颜红颜草莓果实成熟过程中花色苷积累及合成途径基因表达的分析草莓果实成熟过程中花色苷积累及合成途径基因表达的分析彭贞贞1,2，钟传飞3，王宝刚1,4,5，李文生1,4,5，周家华1,4,5，傅达奇2，常虹1,4,5，王云香1,4,5,*（1.北京市农林科学院农产品加工与食品营养研究所，北京 100097；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；3.北京市农林科学院林业果树研究所，北京 100093；4.果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室，北京 100097；5.农业农村部蔬菜产后处理重点实验室，北京 100097）摘要：为探究红颜草莓果实成熟过程中花色苷积累和合成相关基因表达规律，以红颜草莓白果期（whitefruit，WF）、转色期（initial ripening fruit，IR）、半红期（part ripening fruit，PR）、全红期（full ripe fruit，FR）四个发育时期果实为研究对象，采用高效液相色谱-串联质谱方法对其花色苷物质进行定性和定量分析，并测定不同发育过程中的花色苷生物合成途径中结构基因表达水平，以期为草莓果实花色苷代谢以及色泽品质调控提供理论依据。结果表明：红颜草莓中有 24 种花色苷化合物和 4 种原花青素，随着果实成熟，总花色苷含量逐渐增加，原花青素含量逐渐降低。各发育时期的差异代谢物质主要是天竺葵素和矢车菊素。其中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-芸香糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷是花色苷中的主要物质，在红颜草莓全熟期时，分别占花色苷总量的 79.7%，14.1%和 3.56%。实时定量 PCR 分析表明，花色苷合成途径基因 FaPAL1、FaC4H、FaF3H、FaANS、FaUFGT 和转录因子 FaMYB10 表达水平随果实发育逐渐升高。综上所述，红颜草莓果实的花色苷含量随果实成熟逐渐积累，花色苷差异代谢的物质包含天竺葵素和矢车菊素，花色苷合成途径相关结构基因FaPAL1、FaC4H、FaF3H、FaANS、FaUFGT 表达水平影响果实花色苷的积累。关键词：红颜草莓，花色苷，代谢物质，基因本文网刊:中图分类号：TS255.1 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）14034609DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022090106AnalysisofAnthocyaninAccumulationandGeneExpressionofAnthocyaninSynthesisPathwayduringFruitRipeningofBenihoppeStrawberryPENGZhenzhen1,2，ZHONGChuanfei3，WANGBaogang1,4,5，LIWensheng1,4,5，ZHOUJiahua1,4,5，FUDaqi2，CHANGHong1,4,5，WANGYunxiang1,4,5,*（1.Institute of Agricultural Products Processing and Food Nutrition,Beijing Academy of Agricultural and ForestrySciences,Beijing 100097,China；2.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China；3.Institute of Forestry and Fruit Trees,Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences,Beijing 100093,China；4.Beijing Key Laboratory of Fruits and Vegetable Storage and Processing,Beijing 100097,China；收稿日期：20220913 基金项目：国家自然科学基金（31901732）；现代农业产业技术体系北京市特色作物创新团队（BAIC04-2022）；北京市农林科学院青年基金（QNJJ202228）；北京市农林科学院协同创新基金（KJCX201915）。作者简介：彭贞贞（1993），女，博士，研究方向：果蔬采后生理与分子生物学，E-mail：。*通信作者：王云香（1986），女，博士，副研究员，研究方向：果蔬采后生理与分子生物学，E-mail：。第 44 卷 第 14 期食品工业科技Vol.44 No.142023 年 7 月Science and Technology of Food IndustryJul.2023 5.Key Laboratory of Vegetable Postharvest Processing,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Beijing 100097,China）Abstract：To explore the genes related to anthocyanin accumulation and synthesis during the ripening process of strawberryfruit,qualitative and quantitative analysis of anthocyanin substances was conducted using high-performance liquidchromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)on the fruits of four development stages of Benihoppestrawberry:White(WF),initial ripening(IR),part ripening(PR),and full red fruits(FR).The expression level of structuralgenes in anthocyanin biosynthesis pathway in different development processes was determined to provide a theoretical basisfor anthocyanin metabolism and color quality regulation of strawberry fruit.The results showed 24 anthocyanins and fourproanthocyanidins in Benihoppe strawberry.With the ripening of the fruit,the total anthocyanin and proanthocyanidincontents gradually increased and decreased,respectively.Pelargonidin and cyanidin were the main differential metabolitesin different developmental stages.Among them,pelargonidin-3-O-glucoside,pelargonidin-3-O-rutinoside and cyanidin-3-O-glucoside were the main substances in anthocyanins,accounting for 79.7%,14.1%and 3.56%of the total anthocyanins atthe full maturity of Benihoppe strawberry,respectively.Real-time PCR analysis showed that the transcription levels of theanthocyanin synthesis pathway genes FaPAL1,FaC4H,FaF3H,FaANS,FaUFGT,and FaMYB10 gradually increased withthe fruit development.In summary,the anthocyanin content of Benihoppe strawberry fruit gradually accumulates with fruitmaturity,and the substances of anthocyanin differential metabolism include pelargonidin and cyanidin.The expression levelof structural genes related to anthocyanin synthesis pathway affects the anthocyanin accumulation of fruit.Keywords：Benihoppe strawberry；anthocyanins；metabolites；genes 草莓（Fragariaananassa Duch）是蔷薇科草莓属多年生的草本植物，是一种重要的经济作物。草莓果实颜色艳丽，柔软多汁，口感清新，营养丰富，深受广大消费者喜爱。草莓果实中含有的丰富花色苷，是重要的功能性营养物质，具有抗氧化、抗炎、抗癌、预防慢性病等作用1。除此之外，花色苷可增强植物的抗性，不仅可抵御生物和非生物胁迫，还可清除非生物胁迫下过量的活性氧2。另外，花色苷的形成是果实成熟的标志，使果实产生特征性的红色、蓝色和紫色色调，对果实的品质有重要影响3。花色苷是由花青素和糖苷组成，花青素的结构决定了呈现出的颜色，糖苷使花青素分子更加稳定，在植物中多以花色苷形式存在4。自然界中发现的花色苷有 600 多种，其中锦葵素（Malvidin,Mv）、天竺葵素（Pelargonidin,Pg）、矢车菊素（Cyanidin,Cy）、飞燕草素（Delphini-din,Dp）、矮牵牛素（Petunidin,Pt）、芍药素（Peonidin,Pn）为植物中常见的 6 种类型花色苷5。在草莓果实中主要富含天竺葵素，葡萄糖是最常见的替代糖6。花色苷生物合成受到一系列编码生物合成过程酶基因的转录调节进而影响花色苷的生物合成7。苯丙氨酸裂解酶（PAL）是花色苷合成途径中的第一个酶，也是该途径的关键酶。Pombo 等8发现FaPAL6 的表达是果实特异性的，并且其表达和活性可能与草莓花青素积累增强有关。肉桂酸羟化酶（C4H）参与花色苷合成途径的第一阶段，是生成花色苷生物合成的前体，在黑树莓中，C4H 基因在果实成熟后期的颜色发育过程中发挥作用，而早期 C4H 基因的表达可能与黄烷醇的积累有关9。查尔酮合成酶（CHS）是进入花色苷合成途径中第二阶段的第一个酶，已有研究表明果实组织中 CHS 基因的表达受到发育调节并与果实着色相关，除此之外，反义 CHS基因构建的草莓果实 CHS 活性降低，果实中花色苷、黄酮醇和原花青素的水平下调，类黄酮途径的前体被分流到苯丙素途径，Hoffmann 等10发现沉默CHS 基因后同样使花色苷水平下调。黄烷酮 3-羟化酶（F3H）在花色苷生物合成途径的早期阶段将黄烷酮转化为二氢黄烷醇。当 RNAi 沉默 F3H 后草莓果实的花青素含量显着降低，花色苷生物合成途径被阻断，代谢物被分流至苯丙素途径11。二氢黄酮醇在类黄酮-3-羟化酶（F3H）是在 3位引入 B 环羟基的关键，FaF3H 阻断红肉和白肉两个品种草莓花色苷 3-葡萄糖苷的积累12。二羟黄酮醇-4-还原酶（DFR）催化底物生成无色花青素，研究发现 RNAi 沉默 FaDFR降低草莓果实 DFR 酶活性，影响花色苷的生物合成，最终导致草莓果实的表皮颜色变浅13。ANS 通过将无色花色苷转化为有色花色苷直接影响花色苷的积累14。此外，UFGT 催化植物中花青素稳定性和水溶性的关键步骤，在草莓红肉品种中检测到的UFGT 表达水平远高于草莓白肉品种12。总之，单个酶也会对生物合成途径的整体稳定性产生影响，因为单酶基因的沉默、过表达或异源表达通常会导致靶组织类黄酮成分的显著变化1517。花色苷合成途径中相关基因也是协调诱导的，并且在几个物种中已经鉴定出直接调节该途径结构基因表达的转录因子18。转录因子通过转录调控，激活或抑制花色苷合成过程中结构基因的表达。例如，Zhang 等19发现草莓转录因子 FaRAV1 可直接结合并激活 FaMYB10、CHS、F3H、DFR 和 GT1 启动子正调控花色苷积累。其中大多数参与花色苷合成第二阶段（类黄酮生物合成）调控的 MYB 转录因子都是增强其途径结构基因表达的正调控因子。之前已有研究证明草莓中的 FaMYB10 可与 FvbHLH33 相互作用并激活 FvDFR 和 FvUFGT 启动子调节花色苷积累20。然而，草莓中 FaMYB1 转录因子抑制花第 44 卷 第 14 期彭贞贞，等：红颜草莓果实成熟过程中花色苷积累及合成途径基因表达的分析 347 色苷和黄酮醇的积累，可能起到抑制转录的作用，以平衡草莓果实成熟后期产生的花青素水平21。FvMAPK3 可诱导 FvMYB10 磷酸化和 FvCHS1 降解，抑制草莓果实中花青素的积累22。但花色苷生物合成相关的转录因子和结构基因也受品种、果实成熟度以及外界因素的影响23。ABA 和钙处理增加花色苷的积累，ABA 还可增强花青素相关酶的活性，而钙可上调 FvDFR2、FvANS1 和 FvUGT1 花色苷生物合成关键结构基因的转录水平2425。而在本研究中，以红颜草莓为材料，对草莓果实白果期、转色期、半红期、全红期四个发育时期果实的花色苷合成相关基因和转录因子的表达量及花色苷化合物含量及变化进行分析，明确花色苷的代谢机制，为草莓果实的色泽品质调控提供理论依据。1材料与方法 1.1材料与仪器草莓品种为红颜草莓。采自北京市昌平草莓种植园。如图 1，选择白果期（white fruit，WF）、转色期（initial ripening fruit，IR）、半红期（part ripeningfruit，PR）、全红期（full ripe fruit，FR）四个时期草莓果实，采摘当天运回实验室，果实切成小块，液氮速冻后置于80 冰箱保存，以待测定；甲醇色谱纯，美国 Sigma 公司；甲酸色谱纯，德国默克公司；盐酸分析纯，信阳市化学试剂厂；超纯水由艾科浦超纯水系统（美国艾科浦国际有限公司）制备；植物RNA 提取试剂盒天根生化科技（北京）有限公司；反转录试剂盒美国赛默飞世尔科技公司；引物上海生工生物工程有限公司。WFIRPRFR图 1 不同发育时期的红颜草莓果实表型Fig.1 Fruit phenotype of Benihoppe strawberry at differentdevelopmental stages LGJ-100F 真空冷冻干燥机北京松源华兴科技发展有限公司；MM400 球磨仪德国 Retsch 公司；MIX-200 涡旋振荡仪上海净信实业发展有限公司；KQ5200E 超声清洗仪昆山舒美超声仪器有限公司；QTRAP 6500+高效液相色谱-串联质谱美国 AB SCIEX 公司；ACQUITY BEH C18色谱柱美国 Waters 公司；CFX96Touch 实时荧光定量 PCR仪美国伯乐公司。1.2实验方法 1.2.1 花色苷物质提取花色苷提取方法参照 Jiang等26的方法并略做修改。草莓样品真空冷冻干燥后利用球磨仪研磨至粉末状。称取 50 mg 的粉末，溶解于 500 L 提取液（50%的甲醇水溶液，含 0.1%盐酸）中，涡旋震荡混匀，超声提取 5 min 后离心 3 min（12000 r/min,4），吸取上清，用 0.22 m 微孔滤膜过滤样品，并保存于进样瓶中，用于 LC-MS/MS分析。1.2.2 花色苷定性定量检测花色苷定性定量测定方法参照 Yuan 等27的方法。采用高效液相色谱（ExionLC AD，SCIEX）-串联质谱（QTRAP6500+，SCIEX）（HPLS-MS/MS）的方法对花色苷进行定性定量分析。液相色谱所用色谱柱为 ACQU-ITY BEH C18色谱柱（1.7 m，2.1 mm100 mm），流动相 A 液为超纯水（加入 0.1%的甲酸），B 液为甲醇（加入 0.1%的甲酸）。洗脱梯度为 0.00 min B 液比例为 5%，6.00 min 增至 50%，12.00 min 增至 95%，保持 2 min，14 min 降至 5%，并平衡 2 min。流动相流速为 0.35 mL/min；柱温 40，进样量 2 L。质谱条件主要包括：电喷雾离子源温度 550，正离子模式下质谱电压 5500 V，气帘气 35 psi。获得不同样本的质谱分析数据后，对所有目标物的色谱峰进行积分，通过迈维代谢建立的标准品数据库进行定性和定量分析。采用 Analyst 1.6.3 软件处理质谱数据。1.2.3 花色苷合成相关基因表达分析 1.2.3.1 红颜草莓不同发育时期总 RNA 提取和cDNA 合成红颜草莓的总 RNA 参照 RNAprepPure Plant Plus Kit 多糖多酚试剂盒（TIANGEN，DP441）进行提取。使用 RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit 反转录试剂盒（Thermo Scientific，K1622）将红颜草莓不同发育时期 RNA 反转录为cDNA。利用 Primer Premier 5.0 软件，设计花色苷生物合成途径过程中关键基因的实时荧光定量PCR 引物（表 1），主要包括查尔酮合成酶基因（FaCHS）、查尔酮异构酶基因（FaCHI）、反式肉桂酸-4-单氧化酶（FaC4H）、黄烷酮-3-羟化酶基因（FaF3H）、类黄酮 3单加氧酶（FaF3H）、苯丙氨酸解氨酶基因（FaPAL1 和 FaPAL2）、二氢黄酮醇 4-还原酶基因（FaDFR）、花色苷合成酶基因（FaANS）、类黄酮-3-葡糖基转移酶基因（FaUFGT）及转录因子FaMYB1、FaMYB10。引物序列合成由上海生工生物工程有限公司北京测序部进行。1.2.3.2 实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）分析RT-qPCR 在 BIO-RAD/伯乐 CFX96Touch 荧光定量 PCR仪器上进行，以 1.4.1 的 cDNA 为模板，使用表 1 引物通过 PCR 扩增目的基因。扩增体系为：5.0 L（2SYBR q PCR Mix，上、下游引物各1.0 L（10 mmolL1），1 L cDNA 模板和 2.0 L 灭菌双蒸水）。反应条件：95 预变性 5 min；95 变性 10 s；60 退火 30 s；72 延伸 10 s；循环数 40；72 延伸 3 min。以草莓 Actin 作为内参基因，每个样品 3 个生物学重复。通过 2CT方法28计算花色苷合成途径中关键基因以及相关转录因子 FaMYB10、FaMYB1 的表达 348 食品工业科技2023 年 7 月量，所有结果重复 3 次，以平均数标准误表示。1.3数据处理采用 Graphpad Prism 9.3.1 软件和 Excel 2013软件分析试验数据及绘图。使用 OmicShare 工具绘制热图和韦恩图（www.OmicS 2.1红颜草莓果实花色苷和原花青素物质的鉴定采用液相色谱质谱联用技术对草莓果实中的花色苷进行定性和定量分析，经过分析共鉴定到 24 种花色苷和 4 种原花青素，物质鉴定结果见表 2。在鉴定到 24 种花色苷中，天竺葵素类花色苷种类最多，鉴定到了 10 种，矢车菊素类花色苷种类数量次之，鉴定到 6 种。芍药花素、飞燕草素和锦葵色素类花色苷分别鉴定到了 4、3 和 1 种。此外还鉴定到了4 种原花青素物质，包括原花青素 B1、原花青素B2、原花青素 B3、原花青素 C1。植物种常见的花 表 1 荧光定量 PCR 引物序列Table 1 Primers sequences for real-time PCR analysis基因名称上游引物下游引物FaCHSGGCTCACCGTCGAGACCGGGTGAACCCAGATACCTTCFaCHITCGGAGTCTACTTGGAGGATAAGCGATCTCCCTGAAGAACTCAACFaC4HCGTTTGGTGTTGGGAGGATGGTGGAGTGCTTTAGGAFaF3HAGGGTGGCTTCATCGTTTCGGCTGGGGGCATTTCGGGTFaF3HCCGTAGCGTCTCAGTTCTTGACGAGGTCCTGGTAGTTGTAFaPAL1GATCTCGGAAAGAACAGCTAGAGGAAGGACTTGCTTTGGTGAATGFaPAL2AGGGAGTAATGTTGTGGTTGAGGAGCAGCCATGCTTGTTAGAFaDFRCACGATTCACGACATTGCGAAATTGAACTCAAACCCCATCTCTTTCAGCTTFaANSGAAGTGCGTACCCAACTCCATCGTACCTTCTCCTTGTTGACGAGCCCFaUFGTGGTAAGCCACAGGAGGACATATGAGCACCGAACCAAAAFaMYB1GCAACTTGAGGATCAGCCGGTGCCTGAGTTGAATCTCFaMYB10TTACCAACAGAACCACCACAAAACCAAGACCAGAACACATActinTGTGCGACAATGGAACTCCCACATAGGCATCTTT 表 2 红颜草莓花色苷物质Table 2 Anthocyanins of Benihoppe strawberry strawberry序号Compounds物质1Pelargonidin-3-O-glucoside天竺葵素-3-O-葡萄糖苷2Pelargonidin-3,5-O-diglucoside天竺葵素-3,5-O-二葡萄糖苷3Pelargonidin-3-O-galactoside天竺葵素-3-O-半乳糖苷4Pelargonidin-3-O-rutinoside天竺葵素-3-O-芸香糖苷5Pelargonidin-3-O-（6-O-malonyl-beta-D-glucoside）天竺葵素-3-O-（6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷）6Pelargonidin-3-O-arabinoside天竺葵素-3-O-阿拉伯糖苷7Pelargonidin-3-O-sophoroside天竺葵素-3-O-槐糖苷8Pelargonidin-3-O-sambubioside天竺葵素-3-O-桑布双糖苷9Pelargonidin-3-O-sophoroside-5-O-（malonyl）-glucoside天竺葵素-3-O-槐糖苷-5-O-（丙二酰基）-葡萄糖苷10Pelargonidin-3-O-（6-O-p-coumaroyl）-glucoside天竺葵素-3-（6-O-p-对香豆酰）-葡萄糖苷11Cyanidin-3-O-（6-O-malonyl-beta-D-glucoside）矢车菊素-3-O-（6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷）12Cyanidin-3-O-glucoside矢车菊素-3-O-葡萄糖苷13Cyanidin-3-O-xyloside矢车菊素-3-O-木糖苷14Cyanidin-3-O-sambubioside矢车菊素-3-O-桑布双糖苷15Cyanidin-3,5-O-diglucoside矢车菊素-3,5-O-二葡萄糖苷16Cyanidin-3-O-rutinoside矢车菊素-3-O-芸香糖苷17Peonidin-3-O-glucoside芍药花素-3-O-葡萄糖苷18Peonidin-3-O-（6-O-malonyl-beta-D-glucoside）芍药花素-3-O-（6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷）19Peonidin-3-O-rutinoside芍药花素-3-O-芸香糖苷20Peonidin-3-O-（6-O-p-coumaroyl）-glucoside芍药花素-3-（6-O-p-对香豆酰）-葡萄糖苷21Delphinidin-3-O-galactoside飞燕草素-3-O-半乳糖苷22Delphinidin-3-O-glucoside飞燕草素-3-O-葡萄糖苷23Delphinidin-3-O-（6-O-malonyl-beta-D-glucoside）飞燕草素-3-O-（6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷）24Malvidin-3-O-glucoside锦葵色素-3-O-葡萄糖苷25Procyanidin B1原花青素B126Procyanidin B2原花青素B227Procyanidin B3原花青素B328Procyanidin C1原花青素C1第 44 卷 第 14 期彭贞贞，等：红颜草莓果实成熟过程中花色苷积累及合成途径基因表达的分析 349 色苷主要分为 6 种类型，分别为锦葵色素、天竺葵素、矢车菊素、飞燕草素、矮牵牛素和芍药素。除矮牵牛素类花色苷外，其他种类花色苷都在草莓果实中鉴定到。植物中的花青素不稳定，与糖结合发生糖基化化反应后才能形成稳定的有色花色苷。红颜草莓果实中花色苷的糖苷以葡萄糖类糖苷为主，包括葡萄糖苷、酰化葡糖苷、二葡萄糖苷等，此外还含有芸香糖苷、半乳糖苷、木糖苷、阿拉伯糖苷、桑布双糖苷。2.2红颜草莓果实中花色苷和原花青素总含量的变化红颜草莓果实成熟过程中颜色逐渐变红，花色苷总量显著增加（图 2A），原花青素总含量随着果实成熟呈下降趋势（图 2B）。在白果期果实表面虽未观察到红色，但仍有少量花色苷被检测到（图 3）。这一时期花色苷以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为主，占花色苷总量的 68.5%。草莓果实在转色期开始着色，花色苷总量快速增加。在果实刚开始着色时，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-（6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷）、天竺葵素-3-O-芸香糖苷及芍药花素-3-O-葡萄糖苷的含量增长较快，发生数量级的改变，在这一时期仍以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为主要花色苷类型，占花色苷总量的 61.3%，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量占花色苷总量的17.9%，矢车菊素-3-O-（6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷）占花色苷总量的 12.3%。随着果实成熟，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和天竺葵素-3-O-芸香糖苷含量急速增加，在果实完全成熟时，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的含量占花色苷总量的 79.7%，天竺葵素-3-O-芸香糖苷含量占花色苷总量的 14.1%。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-（6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷）含量虽然也随果实成熟而增加，但含量变化并不显著，在果实完全成熟时，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量占总花色苷含量的 3.56%，矢车菊素-3-O-（6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷）含量占花色苷总量的 0.87%。芍药花素-3-O-葡萄糖苷含量在转色期含量达到最大值，后随果实成熟含量降低。在果实完全成熟时，天竺葵素-3-O-（6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷）的含量也较高，占花色苷总量的 1.10%。在发育早期，原花青素总含量较高，达 486.3 g/g（图 2B），其中原花青素 B3 的含量占原花青素总量 69.4%，在整个发育阶段，原花青素 B3 在原花青素总量的占比较为稳定。当红颜草莓转色时，原花青素总量略有增加，但到达果实半红期时，原花青素总量下降。果实成熟时，原花青素总量降至 130.7 g/g，与白果期相比含量降低了 73.1%。随着果实成熟，各种类花色苷和原花青素含量有明显差异。从图 3 中可看出红颜草莓中原花青素、锦葵色素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-半乳糖苷和芍药花素-3-O-（6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷）在发育过程中逐渐减少；而芍药花素-3-O-（6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷）、矢车菊素-3-O-木糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-（6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷）和天竺葵色素类花色苷含量则不断增加，在成熟期达到峰值；矢车菊素-3,5-O-二葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-桑布双糖苷、天竺葵素-3-（6-O-p-对香豆酰）-葡萄糖苷、芍药花素-3-O-葡萄糖苷、芍药花素-3-O-芸香糖苷和飞燕草色素类花色苷含量均先增加后减少。2.3红颜草莓不同发育时期花色苷物质差异分析草莓果实成熟过程中，花色苷物质含量呈现不同的变化趋势，不同时期差异显著的物质也不同。图 4 中表示的是不同发育时期花色苷代谢物质差异分析。左边蓝色矩形可以看出，WF-VS-IR、WF-VS-PR、WF-VS-FR、IR-VS-PR、IR-VS-FR、PR-VS-FR 各有 13、15、18、13、15、11 个差异表达的代谢物质。WF-VS-FR 和 PR-VS-FR 组对应有单个黑色点，WF-VS-FR 组特有花色苷代谢物质共 3 个（天竺葵素-3-O-阿拉伯糖苷，天竺葵素-3-O-槐糖苷，天竺葵素-3-O-槐糖苷-5-O-（丙二酰基）-葡萄糖苷），PR-VS-FR 组特有花色苷物质 1 个（芍药花素-3-（6-O-p-对香豆酰）-葡萄糖苷）。WF-VS-FRIR-VS-FR 和WF-VS-PRIR-VS-PR 两点中间有线相连，其共有花色苷代谢物质各为 1 个。IR-VS-PRIR-VS-FRPR-VS-FR、WF-VS-FRIR-VS-FRPR-VS-FR、WF-VS-FRIR-VS-PRIR-VS-FR、WF-VS-IRIR-VS-PRIR-VS-FR、WF-VS-IRWF-VS-PRWF-VS-FR三黑点及线相连，代表其共有花色苷代谢物质各是1、1、1、2 和 5 个。WF-VS-PRWF-VS-FRIR-1500A10005000WFIRPR发育时期花色苷总含量(g/g)原花青素总含量(g/g)FRWFIRPR发育时期FR800B6004002000图 2 不同发育时期红颜草莓花色苷总含量和原花青素总含量Fig.2 Total content of anthocyanins and procyanidins inBenihoppe strawberry at different development stages 350 食品工业科技2023 年 7 月VS-FRPR-VS-FR 的共有花色苷代谢物质为锦葵色素-3-O-葡萄糖苷。WF-VS-PRWF-VS-FRIR-VS-PRIR-VS-FRPR-VS-FR 和WF-VS-IRWF-VS-PRWF-VS-FRIR-VS-PRIR-VS-FR 的共有花色苷代谢各为 2 和 3 个。而 6 个组共有的花色苷物质则有 3 个，分别为天竺葵素-3-O-（6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷），天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，天竺葵素-3-O-芸香糖苷。2.4红颜草莓果实花色苷合成途径基因表达量的分析花色苷合成受到其合成途径的结构基因调控，还受到转录因子的调控。花色苷合成主要包括苯丙烷代谢和类黄酮生物合成两个环节29。对花色苷合成途径过程中的关键基因进行 qRT-PCR 分析（图 5）发现，随着果实发育阶段，苯丙烷代谢途径的关键基因 FaPAL1 和 FaC4H 表达量均呈上升趋势，而FaPAL2 表达量在半红期达到峰值后下降。类黄酮生物合成途径的上游结构基因 FaCHS和FaCHI 是合成花色苷的关键基因，其表达直接影响果实着色，它们在红颜草莓发育阶段中均呈先上升后下降的趋势，表明其在果实着色阶段发挥重要作用。类黄酮生物合成途径的下游结构基因 FaF3H 的转录水平呈现出从果实白果期到果实成熟期表达增加的趋势，矢车菊素-3,5-O-二葡萄糖苷矢车菊素-3-O-葡萄糖苷矢车菊素-3-O-桑布双糖苷矢车菊素-3-O-(6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷)矢车菊素-3-O-芸香糖苷矢车菊素-3-O-木糖苷飞燕草素-3-O-半乳糖苷锦葵色素-3-O-葡萄糖苷飞燕草素-3-O-(6-O-内二酰-D-葡萄糖苷)飞燕草素-3-O-葡萄糖苷天竺葵素-3,5-O-二葡萄糖苷天竺葵素-3-O-阿拉伯糖苷天竺葵素-3-O-(6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷)天竺葵素-3-(6-O-p-对香豆酰)-葡萄糖苷天竺葵素-3-O-槐糖苷天竺葵素-3-O-半乳糖苷天竺葵素-3-O-葡萄糖苷天竺葵素-3-O-芸香糖苷天竺葵素-3-O-桑布双糖苷芍药花素-3-O-葡萄糖苷芍药花素-3-O-芸香糖苷天竺葵素-3-O-槐糖苷-5-O-(丙二酰基)-葡萄糖苷芍药花素-3-O-(6-O-丙二酰-D-葡萄糖苷)芍药花素-3-(6-O-p-对香豆酰)-葡萄糖苷原花青素B1原花青素B2原花青素B3原花青素C1WF1WF2WF3IR1IR2IR3PR1PR2PR3FR1FR2FR3WFIRPRFR2101图 3 不同发育时期红颜草莓花色苷合成途径代谢物相对含量变化Fig.3 Relative content change of anthocyanin synthesis pathway metabolites in Benihoppe strawberry at different development stages注：不同颜色表示各个样本中花色苷代谢物相对含量的变化，蓝色代表低表达水平，红色代表高表达水平。WF-VS-IRIntersection size1313151511201510Set size5018WF-VS-PRWF-VS-FRIR-VS-PRlR-VS-FRPR-VS-FR6423353221 1 1 1 1 110图 4 红颜草莓不同发育时期的花色苷差异代谢物质韦恩图Fig.4 Venn diagram of anthocyanin differential metabolites inBenihoppe strawberry at different development stages注：左边水平柱状图表示各集合的元素统计数值，中间矩阵中的单个点表示某个集合特有的元素，点和点之间的连线表示不同集合特有的交集，竖直柱状图中则分别表示对应的交集元素数值。第 44 卷 第 14 期彭贞贞，等：红颜草莓果实成熟过程中花色苷积累及合成途径基因表达的分析 351 从而增加草莓成熟期花色苷的积累。然而 FaF3H在果实半熟期达到峰值后下降，FaF3H 的高表达与类黄酮的高含量有关。FaDFR 在前三个发育时期的转录水平变化不显著，但在果实成熟期的表达下降。FaANS 的表达直接影响花色苷的积累，在红颜草莓中，其转录水平随着果实逐渐成熟而增加