卵母细胞培养技术的研究进展 (1).pdf

分分子子生生物物医医学学卵母细胞培养技术的研究进展万秋吟杨天兰王琼华黄东晖李瑞康家俊(.华中科技大学同济医学院武汉 .临沧市临翔区妇幼保健院妇产科云南 临沧):/基金项目:华中科技大学定点帮扶科研专项项目()通信作者:黄东晖:.中图分类号:.文献标识码:文章编号:()摘要:近年来我国的不孕不育率不断升高女性卵巢功能下降明显 卵母细胞体外培养是获取窦卵泡中未成熟的颗粒细胞卵母细胞复合体进行体外成熟的一项技术其在培养方式上可分为二维和三维培养三维培养以海藻凝胶和纤维蛋白等材料构建培养环境模拟卵母细胞的体内环境成熟率较二维培养显著提高在培养种类上可分为裸卵培养、颗粒细胞与卵母细胞共培养共培养可以防止胚胎的阻滞并提高发育潜力 除卵母细胞分离培养外还可应用卵巢组织进行体外培养如原始卵泡体外激活目前已有成功的临床应用案例为卵巢早衰患者带来了希望关键词:不孕不育卵母细胞培养卵巢组织培养卵母细胞分离 .:.:.()():.:近年来我国的不孕不育率逐渐上升而人口自然增长率正在下降甚至几乎为零增长 据统计我国的不孕率已由 年前的 提高至 左右 目前女性卵巢功能下降明显 岁前卵巢功能减退女性数量较多 卵巢功能下降按照功能衰减程度可以分为 个阶段:隐匿期原发卵巢功能不全、生化异常期原发卵巢功能不全、显性异常期原发卵巢功能不全和卵巢衰竭 在全球范围内有的女性受到月经紊乱的影响 卵巢功能减退的原因较多如遗传因素、自身疾病因素引发的原发性卵巢功能不全儿童癌症中女性幸存者的肥胖以及癌症治疗过程中放化疗等医源性因素均会导致卵巢功能下降 目前对于癌症或卵巢早衰患者可以冷冻保存其卵巢或未成熟的卵母细胞以满足将来生育的需求卵母细胞培养技术主要针对严重多囊卵巢综合征医学综述 年 月第 卷第 期 患者、促性腺激素刺激高反应者、卵巢低反应和卵巢抵抗综合征患者、卵子捐献以及有生育力保存需求的患者 目前在多囊卵巢综合征患者及卵巢低反应人群中应用较多 由于患者不成熟的卵母细胞较多有必要进行卵母细胞体外培养以有效提高卵母细胞利用率 因此该技术对于有生育需求、卵巢早衰且需要行放化疗的癌症患者以及卵巢储备功能差的女性有重要意义 目前卵母细胞体外培养的方法较多有二维培养和三维培养两大类但卵泡的培养成熟率有待进一步提高培养环境的材料有待进一步优化 现就卵母细胞体外培养的方法及不同方法的优缺点进行综述 卵母细胞的分离方法.机械分离法机械分离法指使用超细的注射针头或眼科小剪分离卵泡 等首次利用显微分离的方法分离出单个窦前卵泡用于研究 机械分离法受纤维化和卵巢韧性的制约一般可用于分离人的卵皮质卵泡以及犬类、羊(山羊、绵羊)、鼠、猪的窦前卵泡 然而由于人类卵巢皮质富含胶原纤维结构致密用这种方法分离卵泡尤其是早期卵泡非常困难所得卵泡数量较少而且可能造成未知的机械损伤同时耗时过长也可能导致卵泡活力下降 机械分离法较为烦琐且对人员技术有一定要求故分离得到的卵泡质量参差不齐.酶消化分离法酶消化分离法是先使用酶软化分解卵泡间的结缔组织再使用针头或细小工具从基质中将卵泡分离出来 胶原酶是目前常用的卵泡分离酶制剂不同类型的胶原酶用途不同可单独使用也可结合 水解酶或机械法分离使用 等将小鼠的卵巢组织置于含胶原酶和(或)酶的消化液中孵育一段时间软化及消化卵泡间的基质和结缔组织然后用针尖分离卵泡 和 首次成功报道了利用胶原酶和 酶分离人卵巢窦前卵泡 虽然用酶解法可以一次性得到较多卵泡但会对卵泡造成不同程度的损伤降低卵泡在后期培养过程中的发育、成熟以及分泌能力 等通过酶()和胶原酶 的分组对比发现 对卵泡超微结构几乎无明显影响 等发现 纯化酶的分离效果优于胶原酶且在发育各个阶段对卵泡损伤更小 等将胎牛、小牛和成年牛卵巢组织切成小块培养后以分组培养和定期检测发育情况发现酶对卵泡细胞膜的损伤取决于消化处理时间 和收集成年仓鼠卵巢孵育并获得卵泡后对卵泡进行组织学研究发现酶对卵泡的影响与酶的浓度和组织情况有关 丁婷等以小鼠卵泡为实验材料对比机械加酶分离方法发现酶分离方法的优点是耗时短能较快地得到相对多的窦前卵泡以及裸卵以供研究 与机械分离法相比酶消化法更省时省力且一次分离得到的卵泡质量相对稳定数量更多对卵泡的损伤在一定程度上可以控制.机械加酶法和两步法机械加酶法是利用酶的消化作用使卵巢皮质的组织变疏松并使其所含的基质细胞脱落增强其在显微镜下的透光度使卵泡轮廓清晰然后用机械法在短时间内完成分离 马莉认为机械加酶分离法为显微解剖卵泡创造了条件可以保持卵泡的活力 这为人类和大动物卵泡分离提供了一种有效方法 机械加酶法分离可缩短酶处理时间同时降低机械分离的难度和技术要求减少卵泡的机械损伤以及酶导致的化学损伤两步法指将卵巢组织块在无血清培养体系中培养一段时间使组织结构松散再利用机械法分离腔前卵泡 等认为这种分离方法既避免了胶原酶对卵泡基底膜的损害又充分发挥了机械分离法的优越性所得腔前卵泡结构完整周围有基膜附着有利于卵泡后期的生长、发育 卵母细胞的体外培养方式.二维培养技术.培养板培养法培养板直接培养法是将分离得到的单个卵泡放置于孔板中或细胞外基质铺层表面进行培养 等在培养板上进行二维培养的窦前卵泡显示出较高活力雌二醇产生增加认为培养板培养可能导致早期次级卵泡结构受损而体积较大的次级卵泡反而能够维持活力矿物油的使用对卵泡活力有积极影响使卵泡雌二醇产生增加 但 和 发现培养次级卵泡会产生结构扁平化和受损的现象 培养板培养法操作简单但培养环境中缺乏卵母细胞与颗粒细胞之间的信号交流所以培养的成熟率不佳医学综述 年 月第 卷第 期 .直接接触培养法和间接接触培养法 小室是一种通透性支持物具有多微孔膜可允许细胞在基底面和顶面分泌和吸收分子这种结构使细胞在更自然的极性条件下生长可提高细胞的分化水平 因此 小室中培养的细胞在形态和功能上更接近体内细胞卵泡膜间质细胞与卵泡细胞直接接种在上室纤维薄膜两侧使其处于体外模拟的血脑屏障环境中 将共培养细胞接种于多孔滤膜的上下两侧可以使两种细胞得到一定程度的接触可能更接近体内卵泡和卵泡膜间质细胞间的相互作用模式陈原等发现由于底层多微孔膜的影响结构观察不清但贴壁生长的颗粒细胞易于增殖直径增长幅度大 等以小鼠卵泡为材料通过对照实验发现 间接培养的存活率显著高于简单直接接触培养 间接培养可以维持卵泡细胞与卵母细胞之间的相互作用如间隙连接、旁分泌效应这对卵泡发育至关重要 但目前由于 采用的多微孔膜等通透性支持物存在生物安全性问题尚未在临床广泛采用陈原等将卵泡膜间质细胞放入底部将卵泡放入上室内培养卵泡两种细胞被间隔于两个腔室中没有直接的接触 等认为卵泡在体外生长发育过程中经历了缓慢生长期和加速生长期 等通过对人的卵泡实验发现培养得到的卵母细胞成熟率与体内有一定差异 等发现大多数培养的牛卵泡无法形成胃窦 和 以羊为实验对象也发现 间接培养系统无法支持羊卵泡的正常发育 实验发现在大型动物物种中维持卵母细胞和颗粒细胞之间的关联更加困难其原因可能是大型动物的成熟卵泡体积大于小型动物且需要更长的培养时间 等发现细胞细胞和细胞基质相互作用在卵泡和卵母细胞发育中发挥作用 间接接触培养法将膜间质细胞和卵泡隔开对大型动物卵泡正常发育的影响可能是通过阻碍细胞细胞和细胞基质相互作用实现的.三维培养技术三维培养技术是使用生物材料模拟卵泡在体内卵巢内发育的状况提供良好发育环境的培养技术 目前三维培养技术的研究主要集中在生物材料、生化信号的传递、机械性能方面生物材料是用于卵泡培养的基质 等认为水凝胶或胶囊等易于包封并保留活力允许营养物质和激素向卵泡运输和远离卵泡允许卵泡扩增并在培养结束时能够收集到卵泡 等发现在三维培养中细胞间传递的生化信号能够调节卵泡发育在卵泡培养成熟过程中有重要作用 三维培养材料的机械性能主要指系统通过水凝胶等生物材料的物理性质变化促进或限制细胞存活、增殖、分化和迁移速率 等认为三维基质的机械性能在支持卵泡发育方面具有重要作用 等和 等总结认为机械性能可影响各种组织中的细胞行为 因此生物材料、生化信号的传递、机械性能是三维培养技术领域的研究方向主要通过以上 个方面的改良提高卵泡培养成熟率 目前三维培养技术可以大致分为两大类:支架类和非支架类 李延等认为支架类的基质胶海藻酸盐、纤维蛋白海藻酸盐、仿生卵巢微组织培养法均采用了天然材料海藻酸盐的浓度、生物黏度和硬度以及纤维蛋白的浓度影响卵泡的发育 非支架类的悬挂液滴操作更为简单可以减少因包埋而产生的卵泡损伤因而成为替代方案.基质胶海藻酸盐中滤泡壁细胞与未成熟卵母细胞的三维共培养基质胶海藻酸盐中滤泡壁细胞与未成熟卵母细胞的三维共培养是使用藻酸盐水凝胶包封未成熟的小鼠颗粒细胞卵母细胞复合物随后将其维持在无血清体外培养物中 等以小鼠卵泡为实验材料发现颗粒细胞增殖卵母细胞体积也增大存在成熟卵母细胞的结构特征包括皮质颗粒形成、发育良好的透明带(微绒毛)、正常线粒体和细胞质中的晶格样结构整体合并的效率达到 滤泡复合物的结构在包封和随后的培养过程中得以维持 等分别采用基质胶海藻酸盐和纤维蛋白海藻酸盐对照实验发现基质胶中含有丰富的细胞外基质成分能更好地模拟卵巢状况 陈原等发现三维共培养能够有效模拟体内的生长环境有一定的生物相容性能够排出废物提供营养物质得到与个体发育相似的直径但凝胶的硬度限制了卵泡的生长导致生长半径较二维培养小 藻酸盐水凝胶材料一方面为卵母细胞和颗粒细胞的增殖提供了类似体内的生理环境另一方面由于材料的硬度和延展性与真实组织有所差异医学综述 年 月第 卷第 期 而限制了细胞体积的增长.海藻酸钡鱼精蛋白膜中颗粒细胞的三维培养 海藻酸钡鱼精蛋白膜中颗粒细胞的三维培养是将获得的卵泡与颗粒细胞置于纤维蛋白海藻酸盐三维支架的结构中与基质胶海藻酸盐中细胞的三维共培养不同在于替换了模仿卵巢组织基质的三维支架材料和包封材料 研究显示海藻酸钡胶囊允许代谢物和营养物质的扩散 等将剥落的生发囊泡置于海藻酸钡鱼精蛋白膜中进行颗粒细胞三维共培养发现胶囊粒径分布适合于从标准培养孔中装载到胶囊中的细胞培养颗粒细胞的包封被证明能够延迟黄体化过程从而为卵泡细胞数量多的卵母细胞保持合适的环境 与微滴培养相比三维共培养系统在成熟方面显示出更高的成功率 等通过分组对照试验并跟随培养进行检查发现两个时期后三维共培养的成熟率明显高于微滴培养并产生类固醇类激素.三维悬挂液滴法三维悬挂液滴法是将多个窦前卵泡悬挂在培养基的上方 或 后将细胞转移到培养基下方用矿物油覆盖或更换培养基继续悬挂培养直到 左右见图 三维悬挂液滴法中每个卵泡的球体结构均得到了很好维护且每个聚集体中的卵泡能够相互交流同步生长从而防止未成熟的卵泡破裂 等在类视黄醇代谢物对卵母细胞发育的浓度分组实验中发现卵母细胞的自发释放和滤泡变性是常见的不良事件需要培养基进一步补充视黄酸以增强卵母细胞的发育能力.仿生卵巢微组织中早期窦前卵泡的体外培养 此方法是在人造的仿生卵巢或去细胞化卵巢组织中封装早期窦前卵泡进行培养 卵巢的细胞外基质实际上是异质性的具有较硬的外层和较软的内层分别称为卵巢皮质和髓质 为了模拟这种具有卵巢机械异质性的两层结构研究人员设计并制造了一种非平面微流体装置将早期窦前卵泡封装在具有较软核心(髓质)和较硬壳(皮质)的微胶囊中机械异质性在调节早期窦前卵泡的发育中起重要作用 体外培养早期窦前卵泡可以获得具有受精能力的 卵母细胞 等发现具有藻酸盐水凝胶壳的富含卵泡的仿生微组织可以保持卵泡冷冻保存的空间结构 这种培养方式模拟了人类卵巢的异质性结构和机械环境可以调节早期窦前卵泡的发育对于长期保存女性的生育能力有重要意义 卵母细胞体外培养的影响因素.颗粒细胞对卵母细胞体外培养的积极影响 等认为与卵母细胞单独培养相比颗粒细胞共培养可显著提高卵母细胞的成熟速率和囊胚形成率加快胚胎发育到囊胚或桑葚胚的速率提高胚胎发育的可能性 对此现象有 种解释:共培养 细胞阶段的胚胎细胞可能分泌对胚胎早期发育有利的物质如甘氨酸、生长因子共培养可去除培养环境中对早期胚胎发育有不利作用的物质如重金属二价阳离子、葡萄糖、次黄嘌呤共培养可以有效稳定或改变某些物理化学条件如氧气与二氧化碳的浓度比从而使环境接近体内有利于胚胎的发育注:为卵母细胞体外培养图 三维悬挂液滴法培养卵泡示意图医学综述 年 月第 卷第 期 .培养基的改变对卵母细胞体外培养成熟的影响 卵母细胞体外成熟的培养基主要以 为基础培养液再添加激素、血清及颗粒细胞等成分来模拟卵母细胞体内成熟的生化环境以及各种成分间的相互作用以期达到与体内相当的成熟效果 培养基是人类卵母细胞体外成熟常用的碱性卵母细胞体外培养培养基有学者在此类培养基的基础上通过改变成分来加以改进提高成熟率无糖培养基是在标准培养基条件下除去葡萄糖补充丙酮酸和乳酸 等以人的卵母细胞为实验材料比较得出卵母细胞在无糖 培养基中的成熟速度较 培养基更快在无糖培养基和 培养基中培养的卵母细胞 后达到中期的比例相似而在无糖培养基中培养的卵母细胞 后成熟率更高 且 和 发现在培养中挤出极体 的卵母细胞更有可能在培养 后达到中期分裂并发育到囊胚阶段此外还有在培养基中加入其他动物体内细胞提供相似环境促进卵母细胞成熟的方式如囊胚培养基、人输卵管液培养基 囊胚培养基有一定优势便于配置适用于临床 虽然培养基的种类较多有不同的效果与优点但最适合体外卵母细胞成熟的培养基仍不明确需要有明确的成熟机制作为支撑.影响卵母细胞体外培养成熟的其他因素 除了培养基的种类影响最终的成熟率外细胞间分泌的化学物质也会改变培养效果因此可以使用药物阻止或促进原有通路以达到改良的目的 等在无血清多步培养系统中实现了人卵母细胞从原始阶段到减数分裂恢复和极体发射的发育在培养基中使用 型利钠肽等可以调控环腺苷酸水平对卵母细胞成熟有积极效果 卵泡的培养有不同的阶段而处于不同阶段的卵泡营养需求不同故可以通过改变不同阶段卵泡细胞的培养基成分优化培养过程 等认为分离出卵巢的次级卵泡处于发育阶段需要在培养基的基础上加入一定量的激活素和少量的卵泡刺激素以帮助建立卵泡细胞间的联系并促进胃窦的形成进而提高卵母细胞成活率和受精率 同时需要注意卵泡培养的物理环境 等在生物工程体系中培养从癌症患者中分离得到的卵泡 发现三维培养系统能够增加卵泡的培养直径但大多数卵泡培养后不具有有丝分裂能力 等认为体外三维培养卵泡可以通过释放胶囊内的部分卵泡模拟体内卵泡的迁移以增加激素的产生使卵泡在未达到人体排卵前直径时即具有卵母细胞的有丝分裂能力 卵泡的直径不是检验卵泡体外培养成功与否的准确因素而应检验产生的卵母细胞是否具有分裂能力以及在下一步的卵母细胞体外培养过程中能否成熟达到 中期 卵巢组织体外培养技术目前认为原始卵泡的活化需要多种因子的相互作用在早期研究中直接培养分离的原始卵母细胞的存活率较低达到生长阶段后分离卵泡培养的成功率较高所以体外培养卵泡通常在生长阶段开始因此不能由卵巢内直接获得的原始卵泡开始培养需要有卵巢体外培养使原始卵泡在卵巢中发育的先前阶段 等在无血清多步培养系统的实验步骤是先获取含有未成熟的原始卵泡的卵巢皮质碎片去除任何生长中的卵泡和大部分底层基质组织使组织主要由包含原始和初级卵泡的卵巢皮质组成(微皮质)漂浮在培养基中培养一段时间使卵泡活化待卵泡达到多层后将卵泡分离并进行单独培养原始卵泡体外激活()是指将卵巢组织体外处理以激活原始卵泡的技术适用于高龄女性、卵巢早衰、早发性卵巢功能不全和卵巢功能低下患者 研究发现对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 和磷脂酰肌醇激酶信号通路的激活以及对河马信号通路的抑制可以促进卵泡生长 而 等认为物理上的卵巢穿孔术和楔形切除术等方法同样可刺激卵泡生长但可能引起卵巢皮质破裂 等将早发性卵巢功能不全患者的卵巢切割成组织立方体随后将其置于含有人第 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因抑制剂和磷脂酰肌醇激酶激活剂的培养基中孵育活化 后通过腹腔镜移植到输卵管的浆膜下得到卵母细胞并成功娩出男婴 等将卵巢解剖成小条并在低温条件下使其玻璃化移植手术前 加热使其破碎为立方体并在细胞培养插入物中培养之后在腹腔镜手术下将立方体移植到输卵管的浆膜下 此方法也检测到卵泡的生长医学综述 年 月第 卷第 期 并成功产下婴儿 激活的卵泡移植回母体后患者需定期复查雌激素水平以及判断卵泡发育状况 目前研究表明早发性卵巢功能不全患者可以使用 技术激活残余卵泡但是仍需要更大规模的随机对照试验证明 技术的有效性 宋文广等认为 的操作对卵巢储备有严重损伤妊娠率较低 技术是国内外针对卵巢早衰的前沿探索之一虽然存在一定的风险如卵巢皮质破裂、损伤卵巢储备但目前临床已有 技术用于卵巢功能不全、卵巢早衰等患者并成功妊娠的案例 小 结由于凝胶硬度对卵泡发育的限制还需要进一步的研究改良三维培养支架材料使其更接近体内卵巢结构的坚韧程度和通透性保证卵母细胞的正常生命活动 对于 治疗 等认为未来的研究需要评估卵巢组织的最佳移植部位并确定其生物标志物以指示早发性卵巢功能不全中残留卵泡的存在预测治疗结果 总之卵母细胞培养技术通过逐步改善在全球的几个中心得到应用具有成本较低、并发症少、引入肿瘤风险低等优点且可以有效提高卵母细胞的利用率 技术用物理化学方法激活原始卵泡且已有成功的案例 未来关于卵母细胞培养技术与卵巢组织培养的研究主要集中在减少分离对卵泡的破坏提高卵母细胞培养技术的卵泡成熟率寻找更加贴合人类卵巢生理环境的三维培养材料明确卵巢组织培养成熟的标志物等方面 综上卵母细胞体外培养技术在保留多囊卵巢综合征、肿瘤、抵抗性卵巢综合征患者的生育能力方面有一定的应用前景参考文献 .():.胡燎燎张静郑月慧.人类未成熟卵母细胞的体外成熟培养研究进展.实用临床医学():.:.():.().:.():.()():.():.():.():.():.吴锐黄官友赵淑云.卵母细胞体外成熟技术的改进策略.生殖医学杂志():.():.高红孙莹璞.窦前卵泡的分离与体外培养.国际生殖健康/计划生育杂志():.():.:.():.():.():.高建明万善霞高立云等.二种分离液对牛腔前卵泡卵母细胞体外培养效果观察.北京农学院学报():.():.():.():.医学综述 年 月第 卷第 期 .():.潘红平石德顺梁明振等.胶原酶对水牛腔前卵泡的分离及培养的影响.广西畜牧兽医():.():.马莉.冻融人卵巢组织腔前卵泡的分离及体外培养的研究.郑州:郑州大学.:.():.():.:.():.():.:.():.丁婷罗爱月杨书红等.小鼠腔前卵泡不同分离方法的比较.中国现代医学杂志():.():.():.:.:.():.:.陈原沈薇罗爱月等.小鼠窦前卵泡与卵泡膜间质细胞的 种共培养方法比较.中国妇幼保健():.():.():.():.():.:.():.():.:.():.().():.():.():.:.():.李延胡方方陈欢欢等.窦前卵泡体外三维培养系统研究进展.国际生殖健康/计划生育杂志():.():.():.:.():.():医学综述 年 月第 卷第 期 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