弩药液的刺激及过敏试验研究.pdf

论 著第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.2024基金项目：1.贵州省普通高等学校特色重点实验室（编号：黔教合 KY 字2017006）；2.贵州省高等学校中药（民族药）药性与效应研究重点实验室（编号：黔教技2023018 号）作者简介：邓万娟（1998.5-），女，贵州遵义人，硕士研究生，主要从事中药药理研究通讯作者：钱海兵（1977.10-），男，河南卫辉人，博士，教授，博士生导师，主要从事中药药理研究弩药液的刺激及过敏试验研究邓万娟1袁2袁3袁梁 潇1袁2袁3袁刘 娇1袁2袁3袁蔡敏芳1袁2袁3袁胡 涛1袁2袁3袁罗 萍1袁2袁3袁阮婧华4袁钱海兵1袁2袁3渊1.贵州中医药大学基础医学院袁贵州 贵阳550025曰2.贵州中医药大学贵州省道地药材性效用一致性研究中心袁贵州 贵阳550025曰3.贵州省高等学校中药药性与效应研究重点实验室袁贵州 贵阳550025曰4.贵州中医药大学第一附属医院袁贵州 贵阳550001冤摘要院目的评价弩药液的皮肤刺激性及皮肤过敏性袁为弩药液的应用提供安全依据遥方法皮肤刺激性试验院家兔4只袁雌雄各半遥采用自身对照袁左侧为对照部位渊温水冤袁右侧为给药部位渊弩药液冤袁连续给药14 d袁观察涂抹药局部有无红斑尧水肿等反应袁进行皮肤刺激反应及刺激强度评分袁并取给药部位皮肤进行组织病理学检查遥皮肤过敏性试验院豚鼠30只袁雌雄各半袁分为对照组渊温水冤尧2-4二硝基氯苯阳性组渊致敏1.0%0.2 ml/只尧激发0.1%0.2 ml/只冤和给药组渊弩药液适量冤袁于第1尧7尧14天在豚鼠左侧致敏袁末次致敏结束后第14 d袁右侧进行激发接触袁并于激发后1尧24尧48和72 h观察过敏反应情况袁计算各组豚鼠反应平均值和致敏率遥结果弩药液皮肤刺激试验中袁皮肤反应积分均值为0袁皮肤刺激强度为无刺激性袁病理检查均未见组织病理学改变曰在豚鼠皮肤过敏性试验中袁弩药液组及对照组豚鼠激发接触72 h内观察袁皮肤无红斑及水肿现象出现袁其反应级别平均值为0袁致敏率为0遥结论在家兔皮肤刺激性试验和豚鼠皮肤过敏性试验中袁弩药液对家兔皮肤无刺激性袁对豚鼠皮肤无过敏性遥关键词院弩药液曰皮肤刺激性曰皮肤过敏性中图分类号院R859.79文献标识码院ADOI院10.3969/j.issn.1006-1959.2024.04.016文章编号院1006-1959渊2024冤04-0090-05Experimental Study on Irritation and Allergy of Crossbow MedicineDENG Wan-juan1,2,3,LIANG Xiao1,2,3,LIU Jiao1,2,3,CAI Min-fang1,2,3,HU Tao1,2,3,LUO Ping1,2,3,RUAN Jing-hua4,QIAN Hai-bing1,2,3(1.Basic Medical College of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550025,Guizhou,China;2.Guizhou University of Traditional Chinese Medicine Guizhou Province Authentic Medicine Sexual UtilityConsistency Research Center,Guiyang 550025,Guizhou,China;3.Guizhou Provincial Key Laboratory of Research on Properties and Effects of Traditional Chinese Medicine,guiyang of guizhou 550025;4.The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550001,Guizhou,China)Abstract：ObjectiveTo evaluate the skin irritation and skin allergy of crossbow medicine,and to provide a safety basis for the application ofcrossbow medicine.Methods Skin irritation test:four rabbits,half male and half female.Using self-control,the left side was the control site(warmwater),and the right side was the administration site(crossbow medicine).After 14 days of continuous administration,the local erythema and edemawere observed,and the skin irritation reaction and stimulation intensity were scored.The skin of the administration site was taken for histopathologicalexamination.Skin allergy test:thirty guinea pigs,half male and half female,were divided into control group(warm water),2-4-dinitrochlorobenzenepositive group(sensitization 1.0%0.2 ml/guinea pig,challenge 0.1%0.2 ml/guinea pig)and administration group(appropriate amount of crossbowliquid).Guinea pigs were sensitized on the left side on the 1st,7th and 14th day,and challenged on the right side on the 14th day after the lastsensitization.Allergic reactions were observed at 1 h,24 h,48 h and 72 h after challenge,and the average reaction and sensitization rate of guineapigs in each group were calculated.Results In the skin irritation test of crossbow medicine,the mean value of skin reaction score was 0,the intensityof skin irritation was non-irritation,and no histopathological changes were found in pathological examination.In the skin allergy test of guinea pigs,no erythema and edema were observed in the skin of guinea pigs in the crossbow medicine group and the control group within 72 h,and the averagereaction level was 0,and the sensitization rate was 0.Conclusion In the rabbit skin irritation test and guinea pig skin allergy test,the crossbowmedicine has no irritation to rabbit skin and no allergy to guinea pig skin.Key words：Crossbow medicine;Skin irritation;Skin allergy90论 著第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.2024苗药弩药液是由大血藤、飞龙掌血、透骨香、白屈菜、黑骨藤组成，具有活血化瘀，祛风止痛的功能。常用于骨关节炎、类风湿等引起的关节疼痛1，2，亦可用于癌性疼痛辅助治疗。苗药弩药液在苗族地区广泛使用，并在贵州中医药大学第一附属医院已进行临床应用，具有一定疗效。本研究按照国家食品药品监督管理总局的 药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则 要求进行了刺激性及全身主动过敏反应（ASA）试验，旨在为临床应用提供安全性实验数据。1材料与方法1.1 仪器 组织切片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号：RM2265）；电子天平（常熟市双杰测试仪器厂，型号：JJ224B）；倒置显微镜（奥林巴斯公司，型号：BX53F）。1.2 药品与主要试剂 弩药液（由贵州中医药大学第一附属医院制剂中心提供，批号：20211201）；2-4 二硝基氯苯西亚化学科技（山东）有限公司，批号：20220504。1.3 实验动物 普通级新西兰兔 4 只，体重 1.52 kg，雌雄各半；豚鼠 30 只，体重 300400 g，雌雄各半；购于重庆腾鑫生物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK（渝）2017-0010。实验性喂养 7 d 后开始试验。1.4 方法1.4.1 皮肤刺激性试验3-5选用健康、成年、皮肤无破损的普通级新西兰兔 4 只，雌雄各半，适应性喂养7 d。试验前 24 h 将动物背部脊背两侧去毛，不损伤表皮，面积约为 3 cm伊3 cm。蘸取弩药液涂抹于左侧去毛皮肤上，用塑料薄膜外包，再用无刺激性胶布、纱布固定，维持 4 h 后用温水清洗，右侧作为空白对照部位，涂抹温水，1 次/d，连续外敷 14 d，并于 1 h后观察涂抹药局部有无红斑、水肿等反应情况，按表 1、表 2 进行皮肤刺激反应及刺激强度评分，皮肤刺激反应平均值=（红斑形成总分+水肿形成总分）/合计动物数。第 14 天维持 4 h 温水清洗观察反应情况后，空气栓塞法处死家兔，剪去给药部位皮肤及皮下组织，进行固定、脱水、透明及浸蜡，常规石蜡包埋切片，HE 染色后观察其组织病理变化。1.4.2 皮肤过敏性试验6-8选用豚鼠 30 只，适应性喂养 7 d 后，采用完全随机设计分为 3 组，对照组（温水）、阳性组（2-4 二硝基氯苯，致敏 1.0%0.2 ml/只、激发 0.1%0.2 ml/只）和给药组（弩药液适量），每组10 只，雌雄各半。试验前 24 h 动物背部脊背两侧去毛，不损伤表皮，面积约为 4 cm伊4 cm。蘸取弩药液、分值（分）00.490.52.993.05.996.08.00评价无刺激性轻度刺激性中度刺激性重度刺激性发生率（%）01011303160618081100评价无致敏性轻度致敏性中度致敏性高度致敏性极度致敏性皮肤致敏性评价标准皮肤刺激强度评价标准表2皮肤刺激强度与皮肤致敏性评价标准红斑无红斑轻度红斑，勉强可见中度红斑，明显可见重度红斑紫红色红斑到轻度焦痂形成水肿无水肿轻度水肿，勉强可见中度水肿，明显可见（边缘高出周围皮肤）重度水肿，皮肤隆起 1 mm，轮廓清楚严重水肿，皮肤隆起 1 mm 以上或有水泡或破溃最高总分值分值（分）012348皮肤反应程度表1皮肤反应程度的评分标准91论 著第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.2024温水、1.0%2-4 二硝基氯苯涂抹于左侧去毛皮肤上，用塑料薄膜外包，再用无刺激性胶布、纱布固定，维持 6 h 后用温水清洗。于第 1、7、14 天致敏 3 次，末次致敏结束后第 14 天，蘸取弩药液、温水、0.1%2-4 二硝基氯苯涂抹于右侧去毛皮肤上，进行激发接触，维持 6 h 后用温水清洗，并于第 1、24、48 和72 h 观察豚鼠皮肤红斑、水肿等其他过敏反应情况。按上述表 1、表 2 计算皮肤过敏反应平均值及致敏率。皮肤过敏反应平均值=（红斑形成总分+水肿形成总分）/合计动物数，致敏率=皮肤过敏反应阳性（不论程度轻重）动物数/受试动物总数，致敏率：010%，无致敏性；11%30%，轻度致敏性；31%60%，中度致敏性；61%80%，高度致敏性；81%100%，极度致敏性。反应平均值=（红斑形成总分+水肿形成总分）/合计动物数。1.5 统计学方法 利用 Excel 软件计算皮肤刺激反应平均值、皮肤过敏反应平均值及致敏率。2结果2.1 皮肤刺激性试验 弩药液完整性皮肤连续 14 d局部给药，4 只家兔给药侧及对照侧均未出现红斑、水肿等反应情况，且皮肤刺激分值均为 0，见图 1。2.2 弩药液刺激性试验皮肤组织病理情况 组织病理学检查显示，家兔的给药侧和对照侧皮肤结构正常清晰，均未见棘层及角质层萎缩变薄，无表皮坏死或炎性细胞浸润等病理改变，见图 2。注：A-H 为第 14 天给药结束后图1弩药液刺激性试验结果图2弩药液刺激性试验皮肤组织病理图渊HE袁伊10冤92论 著第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.20242.3 皮肤过敏性试验 弩药液组及对照组（温水）豚鼠激发接触 72 h 内观察，皮肤无红斑及水肿现象出现，其反应级别平均值为 0，致敏率为 0；阳性对照组红斑、水肿现象明显表现为不同级别的致敏反应指征、致敏率 100%，见图 3、表 3。图3弩药液过敏性试验皮肤图组别对照组给药组阳性组0 h001924 h001748 h001772 h00180 h001.924 h001.748 h001.772 h001.80 h0010024 h0010048 h0010072 h00100分值总和（分）平均分值（分）致敏率（%）表3豚鼠过敏反应评分渊=10冤3讨论苗医药理论认为，人体的生灵能（相当于中医的正气）不足时，毒邪就会内侵，所以苗医“毒学说”认为“百病由毒而生，毒为百病之源”“无毒不致病，无乱不成疾”9，并且把祛除毒素作为防治疾病的重要手段，总结形成了“治毒九法”，即攻毒法、表毒法、赶毒法等，以应对毒邪10。弩药液便是用“以毒攻毒”的方式去治疗疾病11。弩药液由黑骨藤、大血藤、透骨香、白屈菜、飞龙掌血组成的棕色液体，具有活血化瘀、祛风止痛的功效12。苗药弩药源自古代苗人射杀动物涂于弓箭上的剧毒药物，后经过减毒13，多次改进，目前已经成为一个质量稳定可控、疗效确切的外用医院制剂，常将弩药液直接涂抹于患处或与传统弩针联合应用以及用弩药桑枝棒14。透皮给药是弩药液的疗效作用精髓，通过苗医理论中的“汗窟”和“毛窟”，将弩药送入患处皮肉经脉之间，从外治内，从而达到“攻毒”的作用15。弩药液中黑骨藤（性热）为领头药，具有舒筋活血、祛风除湿的功效；大血藤（性冷）、透骨香（性热）等铺底药，具有加强领头药祛风除湿的作用和活血止痛的功效，再加以米酒，引诸药入血脉，兼以行气止痛，散瘀止痛16。其中弩药液的各味药，包括黑骨藤17、大血藤18，19、透骨香20、白屈菜21、飞龙掌血22等现代药理研究均已证实具有抗炎和镇痛等药理作用，所以弩药液具有显著的抗炎镇痛作用。弩药液在临床上广泛用于治疗项痹、腰痹等疼痛类和风类疾病23，且目前弩药液利用喷雾器进行外用，方便高效。由于弩药液中的黑骨藤、白屈菜、飞龙掌血等药物具有毒性，所以弩药液对皮肤的刺激性和过敏性仍是临床中需重视的问题。本研究用家兔和豚鼠对93论 著第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.2024弩药液进行皮肤刺激性和过敏性试验，可为弩药液临床安全用药提供一定的参考。皮肤刺激性试验中，与对照侧对比发现，弩药液给药侧皮肤刺激反应平均值为 0，且弩药液给药侧皮肤未出现红斑、水肿等异常表现。并且与对照侧相比，弩药液给药侧皮肤的病理检查也未见组织病理学改变，因此认为弩药液对家兔完整皮肤无刺激性反应。皮肤过敏性试验中，豚鼠主动皮肤过敏性试验3 次致敏后，阳性组受试药物区域均出现轻度至中度红斑、水肿，随后出现皲裂结痂；在激发之前均恢复正常，弩药液给药组和对照组均未见红斑、水肿等异常表现。激发阶段，阳性组动物激发后 1 h 即刻出现过敏反应，出现轻度至中度红斑、水肿，72 h 后恢复，致敏率为 100%，皮肤过敏反应平均值在 1.71.9,弩药液给药组和对照组动物给药部位均未出现红斑、水肿等异常表现以及哮喘、站立不稳、休克等严重全身过敏反应，致敏率为 0，皮肤过敏反应平均值为 0。因此认为弩药液对豚鼠完整皮肤无过敏性反应。整个皮肤试验过程中，未出现试验动物死亡的情况。弩药液皮肤刺激性试验以及皮肤过敏性试验研究均符合相关国家规范和要求。本实验研究证明了弩药液对皮肤的安全性，验证了弩药液是一种无刺激、无致敏、安全性高的外用制剂，为进一步深入研究和临床应用提供参考。参考文献院1成雪,朱艳,张永萍,等.基于信息熵理论研究弩药对膝骨性关节炎大鼠影响J.世界科学技术-中医药现代化,2021,23(8):2742-2748.2吕岑,方志聪,彭珺,等.苗医弩药针疗法治疗膝骨关节炎的有效性和安全性J.实用医学杂志,2021,37(19):2549-2553.3叶中药尧天然药物局部刺激性和溶血性要研究技术指导原则曳课题研究组.中药尧天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则S.北京院国家食品药品监督管理局药品审评中心,2005:11-20.4张晓萌,王康俊,陈国彪,等.骨康宁洗剂皮肤刺激性和过敏性实验研究J.中国药业,2021,30(16):59-61.5郑洋滨,刘宁,艾力奇,等.市售消炎镇痛膏皮肤刺激性和过敏性试验评价J.药品评价,2021,18(07):409-411.6叶中药天然药物免疫毒性(过敏性尧光过敏反应)研究的技术指导原则曳课题研究组.中药尧天然药物免疫毒性(过敏性尧光过敏反应)研究的技术指导原则S.北京:国家食品药品监督管理局药品审评中心,2005.7张琪薇,陈争光,万力生.小儿推拿退热乳的皮肤刺激性及过敏性实验研究J.时珍国医国药,2020,31(4):1004-1006.8向翠英,杨刚,杨冰,等.丁酸氯倍他松乳膏的家兔皮肤刺激性和豚鼠皮肤过敏性研究J.中国药房,2020,31(3):330-334.9肖淦辰,陈星宇,杨华,等.熊芳丽教授从苗医论治瘀积性皮炎及临证病案举隅J.中国民族医药杂志,2022,28(8):14-15,42.10洪秋语,招浩熙,于海洋,等.基于苗医野毒学说冶探讨苗药抗菌作用J.中医药导报,2022,28(1):71-76.11成雪,张永萍,徐剑,等.苗药弩药方最佳配伍筛选研究J.湖北民族大学学报(医学版),2022,39(2):10-14.12吴晓勇,王云龙,李成龙,等.基于苗医野四大筋脉冶理论治疗慢性颈痛经验J.中华中医药杂志,2018,33(7):2901-2903.13昝芳芳,崔瑾.HPLC法测定弩药液中5个成分的含量J.中国医药导报,2021,18(17):142-145.14陈露,王兴桂,崔瑾,等.苗医弩药桑枝棒疗法的操作规范要要要以颈型颈椎病为例J.贵州中医药大学学报,2022,44(1):50-53.15付静,刘娇莹,崔瑾.苗医弩药针疗法治疗膝骨关节炎50例J.中国针灸,2019,39(10):1087-1088.16何锦,张宏,吴晓勇,等.弩药针对类风湿性关节炎HPAA的调控研究J.中华中医药学刊,2020,38(9):64-67.17余玺,陈晨.黑骨藤化学成分的研究J.中成药,2022,44(6):1845-1849.18淳泽利,肖欣,张勇,等.超高效液相色谱法-电化学检测器同时测定大血藤中8种化学成分的含量J.理化检验-化学分册,2022,58(7):752-759.19战秀俊,裴洁荣,范文京,等.大血藤乙酸乙酯部位化学成分研究J.中药材,2022,45(5):1114-1118.20周飞,谢红,赵能武,等.透骨香水煎液HPLC指纹图谱及化学模式识别研究J.中药材,2021,44(3):629-633.21袁艺珍,黄雪妍,张鑫,等.白屈菜化学成分的分离与结构鉴定J.中国药物化学杂志,2022,32(6):454-461.22唐娟,李琴,刘娣佳,等.民族药飞龙掌血提取物抗动脉粥样硬化作用研究J.辽宁中医药大学学报,2023,25(5):28-33.23何锦,唐东昕,吴晓勇,等.苗医弩药液联合温针灸治疗腰椎间盘突出症临床疗效及安全性评估J.中华中医药学刊,2019,37(10):2478-2482.收稿日期：2023-02-28；修回日期：2023-04-07编辑/肖婷婷94