金银花中绿原酸含量测定和指纹图谱研究进展-药学专业毕业论文.doc

金银花中绿原酸含量测定和指纹图谱研究进展
 摘　要:通过对近几年来金银花中主要有效成分绿原酸的含量测定方法和药材的指纹图谱进行综述,为今后的深入研究提供参考。
 关键词:金银花 绿原酸含量测定 提取方法 指纹图谱
    金银花为忍冬科植物忍冬红腺忍冬山银花或毛花柱忍冬的干燥花蕾或带初开的花。该药为中医常用药，绿原酸为金银花的主要功 能性成分，其药效高低取决于绿原酸的含量。 绿原酸为咖啡酰奎尼酸衍生物，易溶于乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯，是一种重要的生理活 性物质，它具有抗菌、抗病毒、解热、升高白细胞、保肝利胆、免疫调节、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基等作用。笔 者在本文中综述了金银花药材的指纹图谱研究进展及其主要有效成分绿原酸的含量测定方法，为今后的深入研究提供参考。
 1 含量测定方法
 除中国药典规定的检测方法外，已见报道 的分析方法有紫外分光光度法、导数光谱 法、薄层层析法、阻抑一催化褪色光度法、毛细管区带电泳法、高效液相色谱法(HPLC 法)等。
 1.1紫外分光光度法
 李娜等研究建立了金银花提取液中绿原酸含量的UV快速测定方法，经HPLC检验， 该方法准确、快速、方便，紫外光谱中和绿原酸含量相关性最佳的波长点为294 nm，绿原酸含量测定值和预测值之间具有良好的相 关性(r=0．995 2，n=l1)，此方法可用于清 开灵注射液生产过程中金银花提取液的在线质量控制；由于绿原酸分子中含有酚羟基，张秋芳等 根据酚类物质中酚羟基与三氯化铁的 显色反应，发觉绿原酸与FeCl，的显色反应产 物的光密度与绿原酸的含量呈良好的线性关 系，因此建立了绿原酸含量的UV快速测定方 法，此方法所得绿原酸含量皆高于HPLC法， 但其差异皆< 1O％ ，这可能是由于金银花中还 会有少量其他物质也会与显色剂发生了显色 反应，这提示在实际应用中，应根据不同产地金银花的成分及其含量高低等对此快速测定 法的实测结果进行必要校正。
 1.2 差示导数光谱法
 林黎明发现以钨酸钠为分析试剂，能快 速与总绿原酸反应生成复合物，根据其光谱的特征性变化，采用差示导数分光光度法可不经 分离直接测定金银花及其制剂银翘解毒片中的总绿原酸的含量．其平均回收率为100.4％，变异系数为1.82％。方法简便，快速，准确。
 1.3导数极谱法
   李白林研究了绿原酸在柠檬酸介质中 的电化学行为和绿原酸含量的线性扫描二阶 导数极谱法测定，发现在NH-NH Cl介质 中，绿原酸不稳定，易分解，导致较大的分析误 差。而在柠檬酸钠介质中，对金银花浸取液 和银黄注射液进行绿原酸含量的测定，获得令 人满意的结果。
 1.4薄层色谱扫描法
    徐强等以薄层扫描法测定咽爽袋泡剂中 金银花中的绿原酸的含量，用薄层扫描仪进行 光谱扫描后，确定以三氯甲烷一醋酸乙酯一甲 酸(2：2：1)为展开剂，双波长反射法锯齿扫描，此方法简便，测定准确；魏云等 l也采用了薄层扫描法对 金银花中绿原酸进行了测定，样品提取条件经 试验表明，甲醇、7O％乙醇使斑点容易扩散，使用乙醇提取效果较好，薄层条件经比较，选 用氯仿一醋酸乙酯一甲酸(4：4：2)为展开剂能 达到较好的分离效果，锯齿形反射法双波长扫描，325nm，R4OOnm，扫描速度20ram／rain，狭缝1．25ram ×1．25ram，记录仪灵敏度 ×2，线性参数×3；李宗等用聚酰胺薄膜分 离绿原酸，用薄层扫描法测定其含量，为金银 花及其制剂海菊冲剂的质量控制提供了一个 新的方法。利用聚酰胺薄膜对绿原酸进行分 离和定量，色谱峰形好，消除了绿原酸在硅胶 薄层上的拖尾现象。
 1.5阻抑一催化褪色光度法
    在盐酸介质中，铁(Ⅲ)能灵敏地催化过氧 化氢还原亮绿sF的反应，绿原酸对催化反应有灵敏的阻抑作用，耿玉珍等 1据此建立了测定痕量绿原酸的阻抑-催化动力学光度分析方 法。该方法测定绿原酸的线性范围为0-0.12mg／L；检出限为4.2×l0 g／L。对浓度为0.08 mg／L绿原酸标准溶液6次平 行测定的相对标准偏差为3.8％ ；回收率为 93.4％ ～1O5％，同时考察了反应的最佳条 件和动力学参数，探讨了反应机理，该方法用 于测量金银花浸取液中绿原酸的含量，取得了较为满意的结果。
 1.6 毛细管区带电泳法
 毛细管电冰分析具有分辨率高、分析速 度快及环境友好等优点，近年来已成为中药质 量研究中的一种广泛、有效的分析技术。颜流水等 采用微波辅助萃取金银花中的有效成 分，用熔融石英毛细管柱(64.5cm ×50 m，有效长度56cm)作为分离通道；以30mmol· L 硼砂(pH=9．3)为运行缓冲溶液；分离电压 20RV；毛细管柱温25℃ ；检测波长340 nm(绿原酸)和270nm(芦丁、槲皮素)同时分离和测 定金银花中芦丁、绿原酸和槲皮素的含量， 为全面有效控制金银花药材质量提供一种简 便、快速方法；龙虹等提出了一种测定金银花和含金银花的八种中成药中绿原酸标志物的毛细管区带电泳分析方法。所用的背景电 解质为含有lOmmol／L磷酸盐和20retool／ L硼酸盐的pH7.00的缓冲溶液，并含有5％的 乙醇以提高样品的溶解度。测定的线性范围 在27.765～665ug／mL，相关系数r 0. 9996。测定金银花和含金银花的8种中成药 中的绿原酸可以在15rain内完成。这种分析方法简单、快速、适用面广。
 1.7高效液相色谱法
    目前测定金银花中绿原酸含量的主要方法还是高效液相色谱法。刘明斌等用流动相：乙腈-0.1％ 磷酸(20：8O，v／v)；流速：0.8 ml／min，检测波长：327nm，进样量：1Oul；柱温：室温，在ODS柱上比较三种不同产地的 金银花中绿原酸的含量，并鉴别出含绿原酸含量较高的品种，结果发现隆回县金银花绿原酸含量较高，河南密县金银花绿原酸含量较低，山东临沂地区平邑县金银花绿原酸含量更低；刘恩荔等采用HypersilODS2色谱柱，以乙腈：水：冰醋酸(15：85：0.2)为流动相，流速0.8 ml／min，检测波长327 nm，柱温25℃建立测定金银花有效部位中绿原酸含量的高效液相色谱法，作者比较了不同比例的冰醋酸，结果表明，当冰醋酸的浓度为0.2％时，可得到较好的色谱峰峰形；王天志等建立了用反相高效液相色谱内标法梯度洗脱，同时测定金银花中绿原酸、咖啡酸、3，5一二咖啡酰奎尼酸含量的方法，并对4个产地3种金银花中上述3种化合物进行定晕分析。方法：采用岛津 CLC-ODS柱(6.0ram ×150ram)，甲醇-1O％的磷酸氢二钠和醋酸缓冲液流动相不同比例进行梯度洗脱，内标物为水杨酸，检测波长 304nm。结果发现西南地区金银花药材主流商品灰毡毛忍冬、细毡毛忍冬干燥花蕾中绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸含量 高于山东、河南产金银花。本法灵敏快速，准确可靠。
 2金银花指纹图谱
    中药指纹图谱为在给定的色谱条件下，药材中各组分的相对保留时间和相对峰面积为 各组分所特有，如同人的指纹，利用相对保留时间和相对峰面积建立样品的相对保留值指纹谱．通过对样品色谱的数据化可产生一系列的参数，包括强峰、特征峰群及特征指纹 峰检出率等，为鉴定和区分中药材的品质提供 客观依据。目前金银花的指纹图谱研究有 GC法，HPLC法，HPCE法等。
 2.1 GC法
 田吉等采用岛津G C-1 4B；CR -7Aplus数据处理器；SE-30石英毛细管柱 (25m ×0．22mm)；柱温90℃初温，以4℃／min 升至200℃，40℃／min升至240℃保持；载气：高纯氮气1.2ml／min；补充气：氮气40ml／min，分流比1：10；氢气40ml／min；空气500 ml／min；检测器FID；检测室245℃ ；气化室 235℃，建立了金银花药材的气相色谱指纹图谱。该法以芳樟醇为参照物，对11批金银花进行分析，发现其中24个峰为各批次共有的特 征峰，选择为共有指纹峰。得到金银花药材的气相指纹图谱。芳樟醇色谱峰分离度好．强度高，故选为参照物峰。以芳樟醇峰的保留时间及峰面积为1，计算其他各共有指纹峰的相对保留时间和峰面积比值，并对占总峰面积10％ 以上的峰计算峰面积比值差值，得到金银花气相指纹图谱技术参数。结果表明金银花气相 指纹图谱稳定性、重现性好、特征性强、峰面积比值及其差值、非共有峰面积均符合规定，结果稳定可靠，可作为注射用金银花药材的鉴别标准之一。王斌等应用GC色谱法建立了中药金银花的指纹图谱，并对相似度计算软件 应用过程中某些问题进行了探讨。方法：使 用SGE 30QC3石英毛细管柱(30m ×0.32ram ×0．5)；柱温：初温100℃，以2℃／min 升至150℃ ，5℃／1min升至170℃保持 4min；载气：高纯氮气，流量：1.0ml／min；尾 吹气：氮气，40 ml／min，分流比1：10；氢气，40 ml／min；空气，400 ml／min；检测器：FID；检测器温度：200℃；气化室温度：200℃。从此 方法建立了药材GC指纹图谱共有模式，并对不同批药材进行了相似度比较，药材各成分得 到了很好的分离，可作为该药材的指纹图谱。
2.2 HPCE法
    容蓉等以40mmoL／L硼砂溶液为缓冲液，利用高效毛细管电泳法，建立不同产地金银花的HPCE指纹图谱。石英毛细管：57cmx75m(有效长度50cm)，工作电压为 17 kV，温度为25℃，压力进样时间为6S，检测波长：214 nm。通过对指纹图谱特征峰数据进行聚类分析，将不同产地的药材分为3 类,并对各类样品建立判别函数。利用指纹图谱技术，通过聚类分析或建立判别函数，可以对不同产地的金银花药材进行判别和质量控制；孙国祥等采用毛细管区带电冰法，以50 mmol／L硼砂(含20 mmol／L-环糊精，用磷酸调pH 8．0)为背景电解质，运行 电压12 kV，紫外检测波长254nm，重力进样l5s(高度8.5 cm)，建立了金银花药材水提取液的毛细管电泳指纹图谱。将l3个不同产地的金银花药材供试液的毛细管电泳指纹图谱进行比较，以电泳峰出现率100％ 计，确定金银花的共有指纹峰为l 8个，该方法具有较好的精密度和重现性，分离效能高且成本低廉。
 2.3 HPLC法
   白雪梅等采用HPLC法建立金银花的指纹图谱。色谱条件为：色谱柱YGW-C18 (250mm x 4.6mm ，10 m)，检测波长 238nm，柱温30℃，流动相：A液-0．4％磷酸 水溶液，B液-乙腈，进样量为20ul，进行梯度洗脱，所有组分在40min内出峰，并对4个 产地金银花中所含的组分进行综合评价并测定其绿原酸含量。结果为4个产地金银花指纹谱主要特征大致相同，金银花主要成分之一绿原酸含量与对照药材相比无显著性差异(p>0．05)；阳利龙 以绿原酸为参照物，对产于山东2003～2004年不同采集时间的10批忍冬金银花进行甲醇提取物HPLC指纹图谱方法的建立。色谱柱为ODS，(4.6mm ×250mm，)，流动相：乙腈：0.4％磷酸(15：85)，柱温：3 0℃ ，流速：1mL／min，检测波长：307nm。结果为药材有15个共有峰，其参数符合中药注射剂指纹图谱技术要求的有关规定，可以作为金银花质量评价和品种鉴剐的重要依据之一；王倩等用梯度洗脱法，对金银花药材进行HPLC 测定。条件为：色谱柱 Z0RBAX SB-C18(150mm ×4．6mm)；流动相：A相为1％醋酸水溶液，B相为甲 醇进行梯度洗脱；流速：1.0 mL／min；检测 波长：254mn；柱温：30℃ 。运用梯度洗脱能很好分离金银花的各类成分，经方法学考察，HPLC指纹图谱具有良好的重现性，l0批样品中1个特征指纹峰有专属性，此研究建立的 金银花药材HPLC指纹图谱分析法可用于金银花药材质量的综合评价。
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