DB62∕T 4671-2023 草木樨香豆素含量的测定(甘肃省).pdf

ICS 65.020CCS B 05B62甘 肃 省 地 方 标 准DB62/T 46712023草木樨香豆素含量的测定Determination of coumarin content in Melilotus spp.2023-03-28 发布 2023-05-01 实施甘肃省市场监督管理局 发布DB62/T 4671 2023目 次前言.III1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14原理.14.1高效液相色谱法.14.2荧光光谱法.14.3紫外光谱法.14.4近红外光谱法.14.5电化学分析法.15试剂或材料.25.1无水甲醇.25.2 无水乙醇.25.3 标准品溶液（对照品）.25.4 标准品储备液.25.5 微孔滤膜.25.6 乙醇/水溶液.25.7 四丁基四氟硼酸钱.25.8 N,N-二甲基甲酰胺.25.9 电解质溶液.26仪器设备.26.1高效液相色谱仪.26.2 分析天平.26.3 旋转蒸发仪.26.4 振荡器.36.5超声波清洗器.36.6 荧光光谱仪.36.7 紫外分光光度计.36.8 近红外光谱仪.36.9 电化学工作站.37试样制备与保存.38分析步骤.38.1 提取.38.2标准曲线的制定.39测定.49.1高效液相色谱法测定.49.2 荧光光谱法测定.49.3 紫外光谱法测定.5IDB62/T 4671 20239.4 近红外光谱法测定.59.5电化学分析测定.510实验数据处理.511 允许差.6附录A（资料性）香豆素标准样品液相色谱图.7附录B（资料性）香豆素标准样品荧光光谱图.8附录C（资料性）不同样品香豆素近红外预测模型.9附录D（资料性）香豆素标准样品电化学差分脉冲伏安图.10IIDB62/T 4671 2023*I-1刖 B本文件按照GB/T L 12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本文件由甘肃省林业和草原局提出并监督实施。本文件由甘肃省草业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：兰州大学草地农业科技学院、中国科学院兰州化学物理研究所、农业部牧草与草 坪草种子质量监督检验测试中心（兰州）、兰州市农业科技研究推广中心。本文件主要起草人：张吉宇、董树清、王艺蒙、彭文静、闫启、王彦荣、邵士俊、王朋磊、张正社。本文件由兰州大学草地农业科技学院负责解释。IIIDB62/T 4671 2023草木樨香豆素含量的测定1范围本文件规定了草木樨中香豆素含量的色谱、光谱、电化学等测定方法。本文件适用于草木樨中香豆素含量的测定和定量分析。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。GB/T 14699.1饲料采样NY/T2129饲草产品抽样技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1香豆素coumarin2H-1-苯并毗喃2酮，分子式为C9H6。2,相对分子质量146.13,熔点：68。73。(lit.),呈白色结 晶固体，具有抗肿瘤、抗菌、抗凝血等作用，可提高植物的抗逆性。4原理4.1 高效液相色谱法利用反相色谱柱分离，以保留时间定性，外标法定量。4.2 荧光光谱法利用香豆素在激发波长为660nm,发射波长660nm750nm的荧光强度进行荧光光谱分析测定。4.3 紫外光谱法利用香豆素在300nm600nm光谱区的分子吸收来进行紫外光谱分析测定。4.4 近红外光谱法利用香豆素中的化学键的泛频振动或转动对近红外光的吸收特性，以漫反射或透射方式获得在近 红外区的吸收光谱或透射光谱。4.5 电化学分析法1DB62/T 4671 2023利用香豆素在特定的电位下的电解液中发生氧化还原反应，产生相应电极电流，进行香豆素的电化 学分析检测。5试剂或材料5.1无水甲醇CH3OHCAS号：65-56-1,色谱纯；光谱纯；分析纯。5.2无水乙醇C2H6O,CAS号：64-17-5,色谱纯；光谱纯；分析纯。5.3 标准品溶液（对照品）香豆素,C9H6。2,CAS 号：91-64-5,纯度沙8%。5.4 标准品储备液香豆素为干态标准品，准确称量标准香豆素0.0146g,用甲醇定容至100mL的容量瓶中，并稀释1000 倍至浓度为0.146Rg/mL,超声处理10mm后经0.45叩1滤膜过滤并作为标准品储备液备用，现配现用。5.5 微孔滤膜尼龙滤膜或性能相当者，孔径0.45即。5.6 乙醇/水溶液800mL乙醇与200mL水超声混匀。5.7 四丁基四氟硼酸锻Ci6H36BF4N,CAS号：429-42-5,纯度N98%。5.8 N,N-二甲基甲酰胺C3H7NO,CAS号：68-12-2,纯度38%。5.9 电解质溶液称取相应重量的四丁基四氟硼酸镂，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂配制成的电解质溶液。6仪器设备6.1高效液相色谱仪柱温箱、二极管阵列检测器（DAD）。6.2 分析天平精确度:O.OOOlgo6.3 旋转蒸发仪2DB62/T 4671 2023旋转速度范围：0r/min 1200r/min 水浴锅控温范围：099。（3。6.4振荡器振幅：4.5mm。转速范围：0rpm3000rpm。6.5 超声波清洗器超声频率：40kHz06.6 荧光光谱仪发射波长范围：35Onm8OOnm6.7 紫外分光光度计波长范围：300nm600nm。6.8 近红外光谱仪波长范围：1400nm2600nmo6.9 电化学工作站三电极系统：工作电极（玻碳电极）、对电极、参比电极。电压范围：2.0Vo精确度：0.3%。转换速率：OV/slV/s。7试样制备与保存按GB/T 14699.1和NY/T2129-2012的规定采集牧草样品。将鲜草样品于常温通风干燥或自然晒干制 成干草样品，用四分法缩至50g100g,经粉碎机粉碎，全部通过0.45mm孔径筛，常温储存备用。8分析步骤8.1提取称取干草样品坨（精确到0.001g）试样于25mL离心管中，加入25mL 80%乙醇溶液，振荡10mm,常 温下超声提取30mm后过滤，共提取2次，合并滤液，滤液减压浓缩至干，残渣用甲醇溶解并定容至50mL,摇匀，经0.45pm微孔滤膜过滤。8.2标准曲线的制定8.2.1高效液相色谱法分别准确吸取标准品储备液0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL,加甲醇分别定容至10 mLo准确吸取上述定容液体20pL,在确定色谱条件下进样，得到液相色谱图（附录A）。以对照品峰面 积（Y）作为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标作图，得线性回归方程。DB62/T 4671 20238.2.2荧光光谱法分别准确吸取标准品储备液0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL,加甲醇分别定容至10mL。取lOuL上述储备液，用甲醇定容至5mL,设定激发波长（Ex）为660nm,采样步径（Inc）为5nm,激发 狭缝（Ex Slit）为2nm；发射波长的（Em）范围取650nm750nm,采样步径（Inc）为5nm,发射狭缝（Em Slit）为2nm；积分时间（integration time）设置为0.2s,于此条件下得到荧光图谱（附录B）,以 荧光强度（Y）作为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标作图，得线性回归方程。8.2.3紫外光谱法分别准确吸取标准品储备液0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL.10mL,加甲醇分别定容至10 mLo取10uL上述储备液，用甲醇定容至5mL,以甲醇为参比溶液。在300nm800nm紫外波长范围内测 定紫外吸收，得到紫外吸收谱值，以吸光度（Y）作为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标作图，得线性 回归方程。8.2.4近红外光谱法将粉碎的样品在仪器上进行多次扫描，收集每个样品光谱值。通过光谱值与经典分析方法测定值的 对应关系，建立预测模型（附录C）。以样品的近红外预测值（X）为横坐标，经典分析方法测定值（Y）为纵坐标，得线性回归方程。8.2.5电化学分析法分别准确吸取标准品储备液0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL,加甲醇分别定容至10mL。采用三电极体系，称取适量的四丁基四氟硼酸核作为溶质，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂制备L0mol/L电 解质；测量前，用氮气将溶液脱气5mm。在5.0mL电解液中加入lO.OpL样品溶液。将玻碳电极在砂纸上 打磨，将氧化铝（O.IrM）和水混合后用于电极抛光，之后超声清洗并晾干备用。在电解池中加入5mL 的电解质溶液，在-2.0V0.0V电位范围内以1.0mv/s的扫速进行扫描，待曲线稳定后加入标准溶液，在 上述条件下用差分脉冲伏安法（DPV）测定不同样品的氧化峰电流（附录D）。为保持电极的重现性和 稳定性，每个样品扫描结束后，要重新超声清洗后再检测。以电流（Y）作为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标作图，得线性回归方程。9测定9.1高效液相色谱法测定9.1-1高效液相色谱参考条件色谱柱：C18柱，4.6mmx250mm,5叩1,或同等性能的色谱柱。流动相：甲醇：水体积比为65:35。流速：检测波长：280nm。柱温：35。7 进样量：20PL。9.1.2色谱法定量测定取样品溶液上机分析，通过标准曲线作多点校准，用外标法定量测定。9.2荧光光谱法测定9.2.1荧光光谱法参考条件4DB62/T 4671 2023荧光光谱激发波长660nm,发射波长650nm750nm,狭缝2nm,步径5nm,样品量3mL4mL。9-2.2光谱法定量测定待测样品使用荧光光谱仪进行测定，由822的标准曲线查得样品中香豆素的浓度。9.3紫外光谱法测定9.3.1紫外光谱法参考条件紫外波长范围：300nm800nm,样品量3mL4mL。9.3.2紫外光谱法定量测定待测样品溶液使用紫外分光光度计进行测定，由823的标准曲线查得样品中香豆素的浓度。9.4近红外光谱法测定9.4.1近红外光谱法参考条件近红外光谱波长范围：1400nm2600nm。样品量10mg。9.4.2近红外光谱法定量测定待测样品按照8.1的方法进行测定，由824的标准曲线求得样品中香豆素的浓度。9.5电化学分析测定9.5.1电化学分析测定参考条件三电极系统，玻碳电极为工作电极，钳电极为对电极，Ag/AgCl作参比电极，起扫电位：-2.0V,终 止电位：0V,电解质溶液5mL,力HOpL样品溶液，采用差分脉冲伏安法进行测定。9.5.2电化学定量测定按照8.2.5的方法，在5 mL电解液中加入10皿样品溶液，用DPV测定不同样品的氧化峰电流。由标 准曲线中查得样品中香豆素的浓度。10实验数据处理试样中香豆素含量以质量分数X表示，单位为微克每克g/g）,按公式计算。式中：Ci试样溶液中香豆素浓度，由标准曲线中查得，单位为微克每毫升（呢/mL）；Vi提取液体积，单位为毫升（mL）；C试样的浓度，单位为克（g/mL）V提取液总体积，单位为毫升（mL）；n稀释倍数；测定结果用平行三次测定的算数平均值表示，结果保留三位有效数字。5DB62/T 4671 202311允许差在相同条件下获得的同一样品溶液三次独立重复测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。6DB62/T 4671 2023附录A（资料性）香豆素标准样品液相色谱图香豆素标准样品液相色谱图如图A.1所示。图A.1不同浓度香豆素标准品的液相色谱图7DB62/T 4671 2023附录B（资料性）香豆素标准样品荧光光谱图香豆素标准样品荧光光谱图如图B.1所示。仁(ndb石 LUOJPods DougosoJon-0.5040 ng/mL波长 Wavelength/nm图B.1不同浓度香豆素标准品的荧光光谱图8DB62/T 4671 2023附录c（资料性）不同样品香豆素近红外预测模型不同样品杳豆素近红外预测模型如圉C.1所示。0550s34504cl3f2s02015c1*0.019DB62/T 4671 2023附录D（资料性）香豆素标准样品电化学差分脉冲伏安图香豆素标准样品电化学差分脉冲伏安图如图D.1所示。图D.1不同浓度香豆素标准品的电化学差分脉冲伏安图w 1/N 9 8 a10