白藜芦醇对亚硝酸盐的清除及亚硝胺阻断作用研究应用.doc

首页设计目 录摘要1核心词1前言11试剂和仪器21.1试剂21.2仪器22 原理22.1亚硝酸钠清除率测定22.2阻断亚硝胺合成原理23实验办法33.1溶液配制33.2 NaNO2 原则液制备及吸光度测定33.3不同浓度白藜芦醇溶液在pH=3时对亚硝酸钠清除率测定43.4不同浓度白藜芦醇溶液在pH=3时对亚硝胺合成阻断率测定44 成果及分析54.1 NaNO2溶液原则曲线绘制54.2不同浓度白藜芦醇在pH=3时对亚硝酸钠清除率及对亚硝胺阻断率55讨论及结论7道谢7参照文献8英文摘要9白藜芦醇对亚硝酸盐清除及亚硝胺阻断作用研究药物制剂 ：刘玉锋指引教师 ：张孝林摘要：目：以亚硝酸盐清除率和亚硝胺合成阻断率为指标，研究不同浓度白藜芦醇在酸性下对亚硝酸盐清除和对亚硝胺合成阻断作用。办法：分别配制0.1mg/mL、0.2mg/mL 、0.4mg/mL 、0.8mg/mL 、0.16mg/mL、0.32mg/mL和0.64mg/mL浓度白藜芦醇溶液和5ug/mL亚硝酸钠溶液,在pH=3模仿胃酸条件下,采用分光光度法，分别测定不同浓度白藜芦醇对亚硝酸钠清除率及亚硝胺生成阻断率1。成果：在酸性条件下，不同浓度白藜芦醇对亚硝酸钠均有较强清除作用，在浓度不大于0.32 mg/mL时随着浓度增大而增大，最大达到63.48%。同步对亚硝胺生成有较强阻断率，最大达到40.94%。结论：白藜芦醇对亚硝酸盐有很强清除能力，对亚硝胺生成有较强阻断能力。核心词：亚硝酸盐，白藜芦醇，分光光度法，亚硝胺，清除，阻断前言癌症是当前威胁人类生活最大杀手，依照世界卫生组织记录，全世界每年约有 500万左右人被癌症夺去生命。在致癌物中，亚硝胺是最令人关注一类化学致癌物质。亚硝酸盐作为一种发色剂和防腐剂2，在肉制品加工中得到了普遍应用3 。许多蔬菜中天然具有硝酸盐，在人体内通过细菌作用也可被还原为亚硝酸盐。亚硝酸盐是合成亚硝胺前体之一4，人体内这些亚硝酸盐在一定条件下可以与食物中仲胺、叔胺等形成亚硝胺。N-亚硝基化合物是一种致癌性很强化合物5，已研究近300种N-亚硝基化合物中，约90%以上具备动物致癌性，并证明N-亚硝基化合物可在体内外由前体物胺类与硝酸盐或亚硝酸盐形成6。在体内代谢过程中，特别是在胃液中容易形成亚硝胺7。因而，减少胃内亚硝酸盐含量及阻断亚硝胺前提合成 7从而达到防癌抗癌目是人类同癌症斗争有效途径之一，而白藜芦醇在这方面研究鲜见报道。白藜芦醇(resveratrol，简称Res)是非黄酮类多酚化合物，日本人Tokaoka 1940年初次从毛叶藜芦根某些离得到。1963年Nonomura等提出白藜芦醇是某些草药治疗炎症、脂类代谢紊乱和心脏疾病等有效成分，是存在于植物中天然抗氧化剂，如葡萄、虎杖等8被列为抗心血管、抗癌最有前景药物之一。白藜芦醇具备优良药理活性和保健功能，其市场需求很大且与日剧增。当前，已有大某些国家和地区都开发了白藜芦醇有关保健品和其她产品。中华人民共和国已将含白藜芦醇植物提取物制成降脂美容天然保健食品，美国也已把白藜芦醇作为膳食补充剂，日本已将从植物提取白藜芦醇作为食品添加剂9。白藜芦醇药理功能引起了人们广泛兴趣，由于它涉及到与人体健康密切有关许多生理疾病，例如，动脉粥样化、老年痴呆症、病毒性肝炎、胃溃疡、炎症与过敏反映等。随着人们对白藜芦醇进一步研究，已经显示白藜芦醇具备抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎以及防止食物过敏等作用，可广泛地应用于医药、保健品、食品、化妆品等领域。因此，对白藜芦醇研究及开发，特别是白藜芦醇对亚硝酸盐清除及阻断作用品有良好市场前景及重要意义。1 试剂和仪器1.1试剂白藜芦醇（纯度99%，购于陕西西慈生物技术有限公司）、蒸馏水、二乙胺盐酸盐、二水合柠檬酸三钠、十二水合磷酸氢二钠、二甲胺盐酸盐、磷酸二氢钠（均为AR，购于国药集团化学试剂有限公司）、亚硝酸钠（AR，淮化试剂厂）、无水对氨基苯磺酸（AR，上海山浦化工有限公司）、95%乙醇、氢氧化钠、盐酸（均为AR，合肥工业大学化学试剂厂）1.2 仪器紫外可见分光光度计 UV-5500PC型（上海元析仪器有限公司）、电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）、恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）、超净工作台（苏州苏净有限公司）2 原理2.1 亚硝酸钠清除率测定10亚硝酸钠在弱酸性条件下，能与氨基苯磺酸重氮化后，再与 N -1-萘乙二胺盐酸盐偶合生成红色化合物，本实验通过测定相似条件下亚硝酸钠含量变化来反映白藜芦醇对亚硝酸根离子清除能力，并计算清除率：清除率=( A 0 - A x ) / A0100%A 0没有加入白藜芦醇亚硝酸钠溶液空白实验吸光度值； A x加入不同浓度白藜芦醇溶液时反映液平均吸光度值。温度为37在pH=3条件下，当用相似量亚硝酸钠溶液同具备一定浓度梯度白藜芦醇溶液反映后，再测量吸光度。吸光度越小，溶液中残存亚硝酸钠含量就越小，表白白藜芦醇对亚硝酸盐清除率越高；反之，表白白藜芦醇对亚硝酸盐清除率越低。2.2 阻断亚硝胺合成原理11 二甲胺与亚硝酸钠在 37条件下，可适本地生成二甲基亚硝胺，反映式如下:(CH3)2NH+NaNO2 HCl (CH3)2NHNO + NaCl + H2O其实质为:(CH3)2NH+HONO (CH3)2NHNO + H2O当往白藜芦醇溶液中依次加入二甲胺与亚硝酸钠时，白藜芦醇优先同亚硝酸钠作用，使得二甲胺不能与亚硝酸钠反映，达到制止二甲基亚硝胺生成目。据此可以比较相似条件下生成二甲基亚硝胺量多少来反映白藜芦醇阻断能力强弱，生成二甲基亚硝胺量少，白藜芦醇阻断能力就强，反之则弱。在紫外光照射下，二甲基亚硝胺可分解成二甲基仲胺和亚硝酸根，反映式如下:H2O + (CH3)2N-N=O 紫外光 (CH3)2NH2+ + NO2- 亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与1-萘胺偶合生成红色化合物。用紫外分光光度计测出该红色化合物吸光度值可反映出溶液中亚硝酸根离子含量，亚硝酸根离子含量可反映出本来溶液中二甲基亚硝胺含量多少。3 办法3.1 溶液配制3.1.1 0.4%对氨基苯磺酸溶液配制：用分析天平精准称取对氨基苯磺酸0.4g充分溶解后，定容至100mL。3.1.2 0.2%盐酸萘乙二胺溶液配制：精准称取盐酸萘乙二胺0.2g充分溶解后，定容至100mL。3.1.3 0.1% 1-萘胺溶液配制：精准称取1-萘胺0.1g充分溶解后，定容至100mL。3.1.4 浓度为1mmol/L二甲胺盐酸盐溶液配制：精准称取二甲胺盐酸盐0.08541g充分溶解后，定容至100mL。3.1.5 浓度为1mmol/L亚硝酸钠溶液配制：精准称取亚硝酸钠0.069g充分溶解后，定容至1000mL。3.1.6不同浓度白藜芦醇溶液配制：精准称取64mg白藜芦醇，置于烧杯中，加适量95%乙醇溶解，用蒸馏水定容于100mL 容量瓶中，配制成0.64mg/mL白藜芦醇溶液并标记为7号容量瓶，再分别稀释配制成0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL 、0.08mg/mL 、0.16 mg/mL和0.32mg/mL白藜芦醇溶液，分别标记为1,2,3,4,5,6号容量瓶，避光保存，备用。3.2 NaNO2原则液制备及吸光度测定12NaNO2原则液制备:用天平精准称取亚硝酸钠20mg，充分溶解后，定容至1L即得20 mg/L NaNO2溶液。然后精确取20 mg/ L NaNO2溶液250mL于一1L容量瓶中并用蒸馏水稀释、定容至刻度，摇匀后得到浓度为5ug/mLNaNO2原则液。NaNO2原则曲线绘制:分别精确吸取浓度为5ug/mLNaNO2原则液0mL,0. 2mL ,0. 4mL ，0. 6mL ,0.8mL,1. 0mL ,1. 5mL ,2. 0 mL置于10 mL具塞试管中，并分别编号为0，1，2，3，4，5，6，7号试管。然后分别向各试管中加入0. 4%对氮基苯磺酸1 mL，摇匀，静置35 min，再加入0. 2 %盐酸萘乙二胺溶液0.5 mL ,用水稀释至刻度，摇匀得到浓度分别为0 ug/mL，0.1ug/mL，0.2ug/mL，0.3ug/mL,0.4 ug/mL，0.5ug/mL，0.75ug/mL，1.0ug/mLNaNO2溶液，将所得到溶液静置15 min后，亚硝酸根离子在538 nm下存在最大吸取峰，因而，本实验在538 nm下测定其吸光度值，绘制NaNO2原则曲线。3.3 不同浓度白藜芦醇溶液在pH=3时对亚硝酸钠清除率测定13取8个10mL具塞试管，分别标记为0，1，2，3，4，5，6，7号试管，依次向各试管中加入5ug/mLNaNO2 溶液1mL。然后分别取0，1，2，3，4，5，6，7号100mL容量瓶中白藜芦醇溶液分别依次向0，1，2，3，4，5，6，7号具塞试管中顺序加入1mL，并依次向各试管中分别加入1mL pH=3.0 柠檬酸钠-盐酸缓冲液14，之后将8个试管置于37 恒温水浴槽中反映1小时。反映结束后，取出试管后及时分别向8个试管中加入质量分数为0.4% 对氨基苯磺酸溶液各1mL,摇匀静置3至5分钟后，再向各试管加入质量分数为0. 2%盐酸萘乙二胺溶液各1mL ，摇匀放置15 min 后，用分光光度计在 538 nm 处分别测出0，1，2，3，4，5，7号试管反映液吸光度值（A）,其中以加入除白藜芦醇溶液和亚硝酸钠溶液外其她所有等量其她试剂溶液作为参比溶液，每个浓度配制3个样品测量吸光度求平均值。依照下列公式求得白藜芦醇对亚硝酸根离子清除率：清除率= ( A 0 - A x ) / A0100%A 0没有加入白藜芦醇溶液试管中NaNO2 吸光度值，即0号试管吸光度值； A x加入不同浓度白藜芦醇溶液反映后试管中NaNO2吸光度值。3.4 不同浓度白藜芦醇溶液在pH=3时对亚硝胺合成阻断率测定11取8个10mL具塞试管，分别标记为0，1，2，3，4，5，6，7号试管。分别取0，1，2，3，4，5，6，7号100mL容量瓶中白藜芦醇溶液分别依次向0，1，2，3，4，5，6，7号具塞试管中顺序加入0.5mL，然后再依次向各试管中分别加入1mL pH= 3.0 柠檬酸钠-盐酸缓冲液,然后依次向各试管加入1mmol/mLNaNO2溶液1mL,再向各试管加入1mmol/mL二甲胺溶液1mL。用蒸馏水将各试管定容刻度为8mL，将各试管置于37恒温水浴槽中反映1 小时。反映结束后，置于紫外分析仪上照15 min ，取出后加1%对氨基苯磺酸溶液1mL,再加0.1%1-萘胺1mL,然后摇匀放置15min后，用分光光度计在525nm 处测吸光度值(A) ,其中以加入除白藜芦醇溶液和亚硝酸钠溶液外其她所有试剂溶液为参比溶液，每个浓度配制3个样品测量吸光度求平均值。依照下列公式求得白藜芦醇对亚硝胺合成阻断率：阻断率= ( A 0 - A x ) / A 0100%A 0 没有加白藜芦醇溶液试管中NaNO2 吸光度值，即0号试管吸光度值；A x 加入不同浓度白藜芦醇溶液后试管中NaNO2 吸光度值。4 成果及分析4.1 NaNO2溶液原则曲线绘制：NaNO2原则液在538 nm下测定其吸光度值如表1所示,原则曲线如图1所示。从原则曲线可NaNO2知在浓度0.1-1 ug/mL存在较好线性关系，随着亚硝酸根离子浓度增大吸光度增大。表1 NaNO2原则液吸光度Table 1 The absorbance of standard solution of NaNO2序号1234567浓度(ug/mL)0.10.20.30.40.50.751吸光度 A0.0040.0070.0110.0140.0170.0250.034图1 NaNO2原则曲线Figure 1 The standard curve of NaNO24.2 不同浓度白藜芦醇在pH=3时对亚硝酸钠清除率及对亚硝胺阻断率从表2和图2可知，白藜芦醇浓度在0.01-0.32mg/mL时，对亚硝酸根离子清除率随着浓度增大而增大，对亚硝酸根离子清除率最大达到63.48%。随后对亚硝酸根离子清除率并不再继续随着浓度增大明显增长。表2 pH=3时不同浓度白藜芦醇对亚硝酸钠清除率Table 2 The rate of resveratrol at different concentrations clearing sodium nitrate under PH=3序号01234567白藜芦醇浓度（mg/mL）00.010.020.040.080.160.320.64清除率（%）0.0018.4428.7234.7539.0143.4363.4863.49图2 pH=3时不同浓度白藜芦醇对亚硝酸钠清除率Figure 2 The clearing rate of NaNO2 on resveratrol with different concentrations at PH=3从表3和图3可知，白藜芦醇浓度在0.01-0.32mg/mL时，对亚硝胺阻断率随着浓度增大而增大，对亚硝胺阻断率最大达到40.94%。随后对亚硝胺阻断率并不再继续随着浓度增大明显增长。表3 pH=3时不同浓度白藜芦醇对亚硝胺阻断率Table 3 The blocking of nitrosamine on resveratrol with different concentrations at PH=3序号01234567白藜芦醇浓度（mg/mL）00.010.020.040.080.160.320.64阻断率（%）0.008.3912.7517.1124.1631.2140.9440.96图3 pH=3不同浓度白藜芦醇对亚硝胺阻断率Figure 3 The rate of resveratrol at different concentrations blocking nitrosamines under PH=35 讨论及结论当溶液环境为酸性条件时相称于胃液环境条件下，随着白藜芦醇浓度增大，白藜芦醇对亚硝酸盐清除能力不断增强，当白藜芦醇浓度大概在0.32mg/mL时有着63.48%最大清除率；但是当白藜芦醇浓度增大到一定限度后，白藜芦醇对亚硝酸钠清除能力不再随着白藜芦醇浓度增大而明显增长，而是达到一种稳定清除率水平。不同浓度白藜芦醇溶液对亚硝胺生成有一定阻断作用，白藜芦醇浓度约在0.32mg/mL时有着40.94%最大阻断率；但是当白藜芦醇浓度增大到一定限度后，白藜芦醇对亚硝胺阻断能力也不再随着白藜芦醇浓度增大而明显增长，而是达到一种稳定阻断率水平。成果表白，白藜芦醇对人体中亚硝酸盐有着良好清除及阻断作用。人们应充分结识到白藜芦醇在寻常生活中重要作用，进而为关于白藜芦醇药物、保健食品开发和推广提供保障。道谢.参照文献1 王广健.亚硝酸根偶联反映及其应用于光度法测定亚硝酸根离子J.分析化学.1998.26(4:):495-497.2 李冬梅.减少肉制品中亚硝酸盐含量J.肉类加工.1997,(3):16-19.3 谭燕,庄松娟.肉制品中亚硝酸盐国标测定办法探讨.,(7):26-28.4 曹会兰.亚硝酸盐对人体危害和防止J.微量元素与健康研究,(2):78-80.5 徐国平.蔬菜、水果对N-亚硝基化合物致癌防止作用J.国外医学:卫生学分册,1989,(2):93-94.6 许后效.环境中N-亚硝基化合物M.北京:科学出版社,1988:59-65.7 褚衍信,冯华进.亚硝酸根清除剂体外研究新办法及其应用J.癌症,1994,13(5):470-471.8 李延华,王伟君.白藜芦醇研究现状及应用前景J.中华人民共和国酿造,.7:10-12.9 高年发,姜丽等.葡萄酒发酵过程中白藜芦醇含量变化研究J.酿酒科技,(12):33-36.10 赵二劳,王晓妮,张海容等.山楂清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成研究J.食品与发酵工业,32(10):29-31.11 黄高凌,翁聪泽,倪辉等.琯溪蜜柚果皮提取物抑制亚硝化反映研究J.食品科学,(12):36-39.12 张平,叶文慧,石志华.姜汁对亚硝酸盐清除作用研究J.黑龙江八一农垦大学学报,17(4):73-75.13 王威.4种辛辣蔬菜抗氧活性研究.食品与发酵工业.,(5):123-126.14 勃拉特AH.有机合成（第二集）（中译本）M.北京科学出版社,1964,321.Thestudyofresveratrolsabilityonclearingsodiumnitrateand blockingnitrosamineYufeng Liu,Xiaolin ZhangSchool of Food and Drug，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，Anhui，ChinaAbstract:Objective:Itistheindicatortostudythedifferentconcentrationsofresveratrolinthe acidicenvironmentandalkalineenvironment,clearingnitriteandblockingnitrosamine,which includestheclearingrateofnitriteandthe blockingrateofnitrosamine. Methods:Preparing concentrations of resveratol solution differently,which is at 0.1mg/mL，0.2mg/mL，0.4mg/mL，0.8mg/mL，0.16mg/mL，0.32mg/mL and 0.64mg/mL and the concentration of sodium nitrate solution,which is at 5ug/mL，simulating gastric conditions under PH=3，different concentrations of resveratrols clearing rate of nitrite and blocking rate 1of nirosamine are measured by spectrophotometry respectively. Results:Under acidic conditions，different concentrations of resveratrol all have strong scavenging effect on sodium nitrate at concentrations less than 0.32mg/mL,which is increased as the concentration increases ，and up to 63.48%.Meanwhile ，the rate of blocking the formation of nitrosamine is high ，and up to 4.94%. Conclusion：Resveratrol have a strong ability to clear sodium nitrateand block the formation of nitrosamine. Keywords：nitrite，resveratrol，spectrophotometry，nitrosamines，clear，blocking