沉降菌检验标准操作规程.doc

01.0 目的
01.1 阐述洁净室（区）空气中沉降菌检测操作规程，保证药品的质量，防止生产环境对产品的污染，保证实验室的环境达成检测产品的规定。

02.0 合用范围
02.1 合用于本公司的洁净室（区）的沉降菌监测和洁净度等级的验证。

03.0 人员职责
测试人员对洁净室（区）沉降菌的测试。

04.0 内容
04.1 术语和定义
下列术语和定义合用于本规程。
04.1.1 菌落：细菌培养后，由一个或几个细菌繁殖而形成的细菌集落，简称CFU，通常用个数来表达。
04.1.2 沉降菌：用GB/T16292-2023 提及的方法收集空气中的活性微生物粒子，通过专门的培养基在适宜的生长条件下系繁殖到可见到的菌落数。
04.1.3 沉降菌菌落数：规定期间内每个平板培养皿收集到空气中沉降菌的数目，以cfu/皿表达。
04.2 测试原理：本测试方法运用沉降法，即通过自然沉降原理收集空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落数，以平板培养中的菌落数来评估洁净环境内的活微生物数，并以此来评估洁净区的洁净度。
04.3 监测周期：A级洁每次室验做监控，B级每周一次，C级每季度一次，D级每半年一次监控。
04.4 测试方法：
04.4.1 使用设备与材料
高压灭菌锅：使用时应严格按照操作规程进行。
恒温恒湿培养箱：必须定期对培养箱进行校验。
培养皿：一般采用φ90mm×15mm培养皿。
培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）； 已灭菌配制好的培养基平皿放入30-35℃恒温培养箱中培养72小时，若培养基平皿上确无菌落生生即可供采样用，制备好的培养基平皿应放在2-8℃的环境中存放。
清洁剂：75%酒精
04.4.2 测试时间：
（1）对单向流，如A级净化房间内及超净工作台，测试应在净化空调系统正常运营不少于10分钟后开始。
（2）对非单向流，如B级、C级、D级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运营不少于30分钟后开始。
（3）培养皿的采样时间：静态测试时，培养皿暴露时间为30min以上；
动态测试时，培养皿暴露时间为不大于4小时。
04.4.3 采样点数及其布置
（1）最少采样点数目：
面积(M)（m2）
洁净度级别
A级
B级
C级
D级
M﹤10
2～3
2
2
2
10≦M﹤20
4
2
2
2
20≦M﹤40
8
2
2
2
40≦M﹤100
16
4
2
2
注：表中的面积，对于单向流洁净室（区）、洁净工作台，指的是送风面积，对非单向流洁净室（区），指的是房间面积。
（2）最少培养皿数
洁净度等级
所需φ90mm培养皿数（以沉降4h计）
A级
14
B级
2
C级
2
D级
2
（3）采样点布置
洁净室（区）采样点布置宜力求均匀，避免采样点在局部区域过于稀疏。下列多点采样的采样点布置图示可作参考（见图1）

图1平面采样点布置图
A级单向流区域，洁净工作台或局部空气净化设施的采样点宜布置在正对气流的工作面上，气流形式可参考图2、图3。

图2水平单向流的气流形式
图3垂直单向流气流形式
①工作区采样点的位置离地0.8m-1.5m左右（略高于工作台面）。
②取样时，应尽量避免在回风口附近取样（距离1m以上），且测试人员应在取样的下风测，并尽量少走动。
ƒ可在关键设备或关键工作活动范围处增长采样点。取样时，取样设备会对
流产生干扰，取样时应避免也许对气流组织的干扰。
04.4.4 测试环节：
04.4.4.1 采样方法
用无菌容器将预先培养的培养基（无菌平皿）放至传递窗，紫外灯照0.5小时，待检测用，将培养皿取出，用75%酒精擦平皿表面，放置在预先拟定的取样点，打开培养皿盖，使培养基表面暴露时间不少于30min，现将培养皿盖，盖后倒置培养。检测时记下培养皿打开的起始时间和结束时间。
04.4.4.2 培养：
所有采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。30℃-35℃培养，时间为72小时。
每批培养基应有对照实验，检查培养基自身是否污染，可每批选定3个培养皿做对照培养。
04.4.4.3 菌落计数
用肉眼直接计数，然后用5-10倍放大镜检查，是否有漏掉。若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上计数。
04.4.5 注意事项
04.4.5.1 测试用品要做灭菌解决，以保证测试的可靠性、对的性。
04.4.5.2 采用一切措施防止人为对样本的污染。对培养基条件及参数的具体记录。
04.4.5.3 由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般有透射光于培养皿背面或正面仔细观测，不要漏计培养皿边沿生长的菌落，必要时用显微镜别。
04.4.5.4 采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。
04.4.5.5 测试状态
沉降菌测试前，温度在18℃-26℃，相对湿度在45%-65%，洁净区与非洁净区和洁净区与洁净区之间的静压差＞10Pa。
01.0
02.0
03.0
04.0
04.1
04.2
04.3
04.3.1
04.3.2
04.3.3
04.3.4
04.3.5
04.3.5.1
04.3.5.2
04.3.5.3
04.3.5.4
04.3.5.5
04.3.5.6 测试人员
测试状态有静态和动态两种，并在报告中注明测试状态。静态测试时，室内测试人员不多于2人。被测试洁净区已消毒，测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。
04.4 结果计算
用计数方法得出各个培养皿的菌落数。
平均菌落数的计算见下式：
计算公式：

式中M为平均菌落数（CFU）
Mi表达1，2，3，……n号皿菌落数；n表达平皿总数。
04.5 标准
洁净度级别
沉降菌平均菌落数（CFU/皿）以4小时计
A级
﹤1
B级
5
C级
50
D级
100
04.6 结果评估
04.6.1 每个测点的沉降菌平均菌落数必须低于所选定评估标准中的界线。
04.6.2 在静态测试时，若某测点的沉降菌落数超过评估标准，则重新测试两次，两次测试结果均合格才干判为合格。
05.0 附件
05.1 REC：JY-001-01《沉降菌检查原始记录》

06.0 参考文献
《药品生产质量管理规范》                   2023年版
《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》 GB/T16294-2023

07.0 变更记载
版本号
实行日期
变更描述
01

新建立