细胞生物学实验指导书.doc

实验一 普通光学显微镜的结构及其使用
一、实验目的
1、了解普通光学显微镜的工作原理，掌握光学显微镜的使用方法。
2、熟悉光学显微镜细胞的形态与结构。
二、实验用品
普通光学显微镜、生物制片标本、擦镜纸。
三、实验原理和方法
1、普通光学显微镜的构造
从构造上，重要分三部分：
①光学放大系统，为两组玻璃透镜：目镜和物镜；
②照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片以控制光的波长范围；
③机械和支架系统：重要保证光学系统的准确配制和灵活调控。
显微镜的质量重要取决于物镜，物镜是显微镜最重要的光学部件。物镜的 种类很多。
2、显微镜的能力
显微镜的能力是质量和性能的标志。能力涉及分辨率、放大率、焦点深度和视场宽度等，其中最重要的是分辨率。
物镜分辨力是指分辨被检样品微细结构的能力。通常以能清楚地分辨两个物体点的最短距离来表达。其公式如下：R=0.61λ/N.A.
R：分辨率（两点的最短距离）
λ：照明光线波长
N.A.：物镜数值孔径
分辨率以分辨两个点的最短距离表达，R值愈小，分辨能力愈大。物镜的分辨率与照明光线的波长成反比，与物镜的数值孔径成正比。
3、显微镜的使用
①聚光器的调节
②光阑的调节
③工作距离
④油镜的使用
4、观测标本
注意观测下列结构：
①细胞核及核仁：不同细胞的核及核仁――蚕豆根尖切片、兔肝切片（Unna试剂染色）多核及多核仁现象――蛙卵切片、肌肉切片
染色体――蚕豆根尖切片、玉米花粉母细胞切片（Giemsa,地衣红或洋红染色）。
②中心体：蝗虫精巢切片（巴西木素染色）。
③线粒体：蚕豆根尖切片、兔肝切片。
④高尔基体：兔肝切片、蚕豆根尖切片（硝酸银或四氧化锇染色）。
四、实验结果
简述显微镜的重要结构和操作要领；绘制细胞显微结构图。

实验二 线粒体和液泡系的超活染色与观测
一、实验目的
1、观测植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布。
2、学习一些细胞器的超活染色技术。
二、实验原理
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
詹纳斯绿B和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。
三、实验用品
1、器材
显微镜、恒温水浴锅、镊子、双面刀片、载玻片、盖玻片、吸管、吸水纸

2、试剂
①Ringer溶液
氯化钠 0.85g
氯化钾 0.25g
氯化钙 0.03g
蒸馏水 100ml

②1％、1／3000中性红溶液
称取0.5g中性红溶于50ml Ringer溶液，稍加热（30～40℃）使之不久溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。
临用前，取已配制的1％中性红溶液1ml，加入29mlRinger溶液混匀，装入棕色瓶备用。

③1％、1／5000詹纳斯绿B溶液
称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加热（30～40℃）使之溶解，用滤纸过滤后，即为1％原液。取1％原液1ml加入49mlRinger溶液，即为1／5000工作液,装入瓶中备用。最佳现用现配，以保持它的充足氧化能力。

3、材料
洋葱鳞茎内表皮细胞、黄豆幼根根尖。
四、实验方法
1、洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色观测
线粒体是细胞进行呼吸作用的场合，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。
詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），显蓝绿色；而线粒体周边的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。

①用吸管吸取1／5000詹纳斯绿B染液，滴一滴于干净的载玻片上，然后撕取一小块洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10～15分钟。
②用吸管系去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观测。
③在高倍镜下可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处。仔细观测细胞质中线粒体的形态与分布。

2、黄豆根尖细胞液泡系的中性红超活染色与观测
中性红为弱碱性染料，对液泡系（即高尔基体）的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这也许是与液泡中某些蛋白质有关。
①实验前，把黄豆培养在培养皿内潮湿的滤上，使其发芽，胚根伸长到1cm以上。
②用双面刀片把初生的黄豆幼苗根尖（约1～2cm长）小心切一纵切面，放入载玻片上的1／3000中性红染液滴中，染色5～10分钟。
③吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地压盖玻片，使根尖压扁，利于观测。
④在高倍镜下，先观测根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的 圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向伸长区观测，在一些已分化长大的细胞内，液泡染色较浅，体积较大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞挤到细胞一侧贴近细胞壁处。
五、实验结果

实验三 植物细胞骨架的光学显微镜观测
一、 实验目的
观测植物细胞骨架的形态。
二、 实验原理
当用适当浓度的TritonX—100解决时，可将细胞蛋白质破坏，但细胞骨架系统的蛋白质却被保存，后者用考马斯亮蓝R250染色，可在光学显微镜下观测到细胞骨架的网状结构。
二、实验用品
1、材料
洋葱鳞茎
2、器材
显微镜，50ml烧杯，玻璃滴管，容量瓶，试剂瓶，载玻片，盖玻片，镊子
三、试剂
1、M—缓冲液：50m mol/L咪唑、50m mol/L KCl、0.5m mol/L MgCl2、1m mol/L EGTA[乙二醇双（α-氨基乙基）醚四乙酸]、0.1m mol/L EDTA、1m mol/L巯基乙醇或DTT（二硫苏糖醇）。
2、6m mol/L pH6.8磷酸缓冲液（用NaHCO3调pH）。
3、1﹪Triton－X100，用M－缓冲液配制。
4、0.2﹪考马斯亮蓝R250，其溶剂是：甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml。
5、3﹪戊二醛，用2液配制。
四、实验方法
1、撕取洋葱鳞茎内的表皮细胞（约1c㎡大小若干片）置于装有pH6.8磷酸缓冲液的50 ml烧杯中，使其下沉。
2、吸去磷酸缓冲液，用1﹪Triton－X100解决20～30分钟。
3、吸去1﹪Triton－X100，用M－缓冲液洗三次，，每次10分钟。
4、3﹪戊二醛固定0.5～1小时。
5、pH6.8磷酸缓冲液洗三次，每次10分钟。
6、0.2﹪考马斯亮蓝R250染色20～30分钟。
7、用蒸馏水洗1～2次，细胞置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观测。
五、实验结果

实验四 叶绿体的分离与荧光观测

叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的.。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，运用低速离心即可分离集中进行各种研究。
一、实验目的
1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2、观测叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
二、实验原理
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增长离心力和离心时间，就可以使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管的底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液{0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液}中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体{混有部分细胞核}。分离过程最佳在0~5℃的条件下进行；假如在室温下，要迅速分离和观测。
荧光显微术是运用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。某些物质在一定短波长的光{如紫外线}的照射下吸取光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光{如可见光}，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光{或直接荧光}，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料自身不发荧光，但它吸取荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光{或间接荧光}，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
运用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观测时应抓紧时间，有必要时立即拍照。此外，在制作荧光显微标本时最佳使用无荧光载片、盖片和无荧光油。
三、实验用品
（一）器材
1、 重要设备：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。
2、 小型器材：500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管10支，10ml刻度离心管20支，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。
（二）材料
新鲜菠菜。
（三）试剂
0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙{acridine orange}。
四、实验方法
（一） 叶绿体的分离和观测
1、 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。
2、 运用组织捣碎机低速{5000r/min}匀浆3~5min。
3、 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。
4、 去滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。
5、 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体{混有部分细胞核}。
6、将沉淀用0.35mol/L NaCl溶液悬浮.
7、取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观测。
①在普通光镜下观测。
②在荧光显微镜下观测。
③取叶绿体悬液一滴滴于载片上，再滴加一滴0.01吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观测。
（二）菠菜叶手切片观测
用剃须刀将新鲜的菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观测。
①在普通光镜下观测。
②在荧光显微镜下观测。
③用同样方法制片，但滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液染色1min，洗去余液，加盖片后即可在荧光显微镜下观测。
五、实验结果
（一）叶绿体的分离和观测
1、普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，在高倍镜下可看到叶绿体内部具有较深的绿色小颗粒，即基粒。
2、加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。
（二）菠菜叶手切片观测
1、在普通光镜下可看到三种细胞。
⑴表皮细胞：为边沿为锯齿形的鳞片状细胞。
⑵保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。
⑶叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞。
叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下可以看到绿色的基粒。
2、在荧光显微镜下，叶绿体发出红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则围绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。
3、用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光，气孔仍为绿色。