(毕业论文)大蒜总黄酮的提取及纯化正文终稿.doc

长春工业大学学士学位论文摘 要大蒜在我国资源丰富，是我们常见的一种食物，也是重要的药用植物，其中含黄酮类化合物、大蒜素等多种活性成分。本实验以乙醇作为溶剂提取大蒜中的总黄酮，对其提取工艺条件进行研究。首先对水提取法、乙醇回流提取法以及超声波辅助乙醇回流提取法进行对比，确定了超声波辅助乙醇提取法为最佳提取方法；并通过单因素试验探讨超声波处理时间、提取次数、料液比、提取温度、乙醇浓度及提取时间对总黄酮得率的影响，然后又通过响应面分析确定了超声波辅助乙醇回流提取法的最佳工艺条件：料液比1:19，提取温度67，乙醇浓度为80%，总黄酮得率达到1.32%。然后采用AB-8大孔吸附树脂进行纯化，同时进行紫外光谱和红外光谱实验分析，初步确定了大蒜黄酮主要为橙酮类。最后进行抗氧化试验和抑菌试验，证明大蒜总黄酮有比较强的抗氧化活性和较好的抑菌效果。与研究比较多的大蒜素相比，大蒜黄酮没有刺激性气味，将来可以作为功能性食品的基础原料。关键词: 大蒜总黄酮；响应面；纯化；抗氧化；抑菌 Extraction and Purification of the Total Flavones in GarlicAbstractGarlic Allium is a rich resource in China. It is not only a kind of most common foods but also important medicinal plants. It contains flavonoids, allicin and other active ingredients. This experiment use ethanol as extractive solvent to extract the total flavonoids, and study the optimal extraction conditions. At first, compared water extraction, ethanol extraction and ultrasonic assisted ethanol extraction were to determine the optimum extraction method was ethanol extraction. Then the effection of extraction temperature, solid to liquid ratio, extraction times, and ethanol concentration on the yield of total flavonoids was investigated by single factor test and the optimum extraction conditions with ethanol as solvent was determined by a response surface analysis. The result was liquid ratio 1:19, extraction temperature 67, 82% ethanol, lavones extraction rate reached 1.32%. The AB-8 macro-porous resin was used to purify, UV and IR spectra analysis initially identified garlic flavonoids which was orange ketones. Finally, inhibitory effect of the total flavonoids in garlic was determined by the antibacterial test. The result proved that garlic had strong oxidation resistance and better antibacterial effects. Garlic flavonoids had no irritating odor compared with the allicin studied more and they could be used as the basic raw material in functional foods.Keywords: Garlic flavonoids; Response surface; Purification; Antioxidant activity; Antibacterial activity38 目 录摘 要IAbstractII1 文献综述11.1 大蒜的概述11.2 大蒜的主要化学成分11.2.1 黄酮类化合物21.2.2 有机硫化物21.2.3 类固醇皂苷21.2.4 氨基酸21.2.5 有机锗21.2.6 硒31.2.7 矿物元素31.3 大蒜的生理功能及作用31.3.1 防治心脑血管疾病31.3.2 预防癌症和抗癌作用31.3.3 抗衰老作用31.3.4 降血脂作用41.3.5 保护肝脏作用41.3.6 提高机体免疫力41.3.7 预防感冒41.4 大蒜的国内外的研究现状41.5 黄酮类化合物的概述51.5.1 黄酮类化合物的分类51.5.2 黄酮类化合物的提取61.5.3 黄酮类化合物的测定71.6 黄酮类化合物的生物活性81.6.1 抗氧化活性81.6.2 抗肿瘤活性81.6.3 抗炎、免疫调节活性91.6.4 抗病毒活性91.6.5 对心血管疾病的作用91.6.6 解毒护肝和细胞保护作用91.6.7 抗菌作用101.7 研究意义102 实验材料与方法122.1 实验材料122.1.1 实验原料122.1.2 实验试剂与设备与仪器122.3 实验方法132.3.1 原料预处理132.3.2 预实验132.3.3 大蒜总黄酮含量的测定142.3.4 大蒜总黄酮提取工艺的确定152.3.5 大蒜总黄酮的纯化工艺研究172.3.6 大蒜纯化样品的紫外光谱及红外光谱实验182.3.7 大蒜总黄酮的生物活性研究183 结果分析与讨论203.1 预实验结果分析203.1.1 大蒜中活性成分的鉴定结果203.1.2 提取方法选择结果203.2 大蒜总黄酮含量的测定203.3 大蒜总黄酮提取工艺确定结果分析223.3.1 单因素试验223.3.2 响应面实验分析结果263.4 大蒜总黄酮的纯化工艺研究303.4.1 大孔吸附树脂的选择结果分析303.4.2 乙醇浓度对解析效果的影响303.4.3 大蒜总黄酮得率的测定313.5 大蒜纯化样品的紫外光谱及红外光谱分析323.5.1 紫外吸收光谱图分析323.5.2 红外吸收光谱图分析323.6 大蒜总黄酮的生物活性研究333.6.1 大蒜总黄酮的抗氧化性分析333.6.2 大蒜中黄酮的抑菌效果分析34结 论35致 谢36参考文献371 文献综述1.1 大蒜的概述大蒜（Garlic），多年生草本植物，百合科葱属。地下鳞茎分瓣，按皮色不同分为紫皮种和白皮种。其辛辣，有刺激性气味，可食用或供调味，亦可入药。大蒜在西汉时从西域传入我国，经人工栽培繁育深受大众喜食。蒜以鳞茎入药，春、夏采收，悬挂通风处，阴干备用。蒜喜湿怕旱，宜选择疏松的沙质土壤、排水良好、有机质丰富的地块栽培。大蒜的品种很多，按照鳞茎外皮的色泽可分为紫皮蒜与白皮蒜两种。紫皮蒜的蒜瓣少而大，辛辣味浓，产量高，多分布在华北、西北与东北等地，耐寒力弱，多在春季播种，成熟期晚；白皮蒜有大瓣和小瓣两种，辛辣味较淡，比紫皮蒜耐寒，多秋季播种，成熟期略早。大蒜的成龄植株，是由叶身、假茎、鳞芽、花萼和茎盘组成鳞茎大形，具有6-10瓣，外包灰白色或淡紫色于膜质鳞被。叶基生，实心，扁平，线状披针形，宽约2.5厘米左右，基部呈鞘状。花茎直立，高约60厘米，种子黑色。花期夏季。大蒜不能产生种子，生产上采用营养繁殖的方法，所以它的生长动态与其它葱蒜类蔬菜都不相同。我国大蒜的主要产地：江苏省邳州市、射阳县、太仓市，山东省济宁市金乡县、莱芜市、商河县、苍山县（临沂市）、广饶县（东营市）、茌平县、成武县，潍坊市的安丘， 河北永年县、大名县北部，河南省杞县、中牟县贺兵马村，上海嘉定，安徽亳州市、来安县，四川温江县、彭州市，云南大理、陕西兴平市及新疆等地。它原产地在西亚和中亚，自汉代张骞出使西域，把大蒜带回国安家落户，至今已有两千多年的历史。本草经疏1记载：“入足阳明、太阴、厥阴经”。具有行滞气，暖脾胃，消症积，解毒。治饮食积滞，脘腹冷痛，水肿胀满，痈疽肿毒，白秃癣疮，蛇虫咬伤。 行气消积，杀虫解毒。用于感冒、菌痢、阿米巴痢疾、肠炎、饮食积滞、痈肿疮疡等功效。用法为煎汤，1.5-3钱；生食、煨食或捣泥为丸。外用：捣敷、作栓剂或切片灸。宜忌阴虚火旺者，以及目疾、口齿、喉、舌诸患和时行病后均忌食。1.2 大蒜的主要化学成分2大蒜中含有的有效成分为黄酮类化合物，另外大蒜中还含有大量的挥发油，其中含硫挥发物43种，硫化亚磺酸酯类13种、氨基酸9种、肽类8种、甙类12种、酶类11种。大蒜具有防治肿瘤和癌症、强力杀菌、降血压、降胆固醇、降血脂、抗衰老、抗疲劳、抗血栓形成、防治糖尿病、保护心血管等功能。1.2.1 黄酮类化合物黄酮类化合物具有多种生物活性，如抗肿瘤活性、抗氧化自由基活性、抗炎及镇痛活性、抗菌及抗病毒活性、抗心血管系统疾病3等。大量研究表明黄酮类化合物还具有降压、降血脂、抗衰老、提高机体免疫力、镇咳、祛痰等药理活性。1.2.2 有机硫化物大蒜有机硫化物分为挥发性化合物和非挥发性化合物。其中挥发性化合物包括脂溶性有机硫化物和硫代亚磺酸酯类等含硫化合物4；脂溶性有机硫化物按含硫原子数目分为一硫化物、二硫化物、三硫化物、四硫化物5。硫代亚磺酸酯类主要有二烯丙基硫代亚磺酸酯、甲基烯丙基硫代亚磺酸酯、烯丙基甲基硫代亚磺酸酯等4。非挥发性化合物包括水溶性有机硫化物，主要有S-烯丙基-L-半胱氨酸(SAC)、S-烯丙基巯基-L-半胱氨酸(SAMC)6。1.2.3 类固醇皂苷类固醇皂苷以其糖苷配基的分子结构为基础分为两大类：呋甾皂苷(Furostanol spooning)和螺甾皂苷(Spirostanol spooning)。呋甾皂苷主要有：Proto-eruboside-B7，Proto-iso-eruboside-B，Sativoside-B1，Proto-desgalactotigonin 。螺甾皂苷有：Eruboside-B ，Iso-eruboside-B 8，Sativoside-R1，Sativoside-R2 9。大蒜提取物中也分离出一系列的类固醇皂苷和皂苷配基。1.2.4 氨基酸大蒜中的氨基酸主要分为2类：一类是组成蛋白质的氨基酸，另一类是非蛋白质氨基酸。前者主要包括半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、胱氨酸和缬氨酸等，以前3种含量较高10。非蛋白质氨基酸主要有S-取代半胱氨酸，如蒜氨酸（S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜，SACS），还有脱氧蒜氨酸(S-烯丙基-L-半胱氨酸，SAC), (+)- S - (反-1-丙烯基) -L-半胱氨酸亚砜和S-烯丙巯基半胱氨酸等11。1.2.5 有机锗大蒜是有机锗含量极高的植物。人参中含有极高的有机锗，而蒜的有机锗含量是人参的3倍。有机锗能迅速吸收氧气，供给体内各器官，明显的抗癌作用，同时加强生命体的免疫机能及降低血压的功能。1.2.6 硒大蒜含有微量元素硒，能使人体产生大量谷胱甘肽。硒具有靶向性，通过增高细胞中环腺甘酸的水平，造成抑制癌细胞分裂和增殖的作用，并可以自动识别癌细胞，阻断能量供应，使其因能量枯竭而死亡，而对正常的细胞没有杀伤作用。因此，硒被世界卫生组织称为“抗癌之王”。另外大蒜中还有有机硒化物包括以硒半胱氨酸为活性中心的硒蛋白和其他形态的含硒化合物12。1.2.7 矿物元素大蒜中含有丰富的矿物质元素，其中含量以磷为最高，其次为镁、钙、铁、硅、铝和锌等18。1.3 大蒜的生理功能及作用1.3.1 防治心脑血管疾病大蒜可防止心脑血管中的脂肪沉积，诱导组织内部脂肪代谢，增加纤维蛋白溶解活性，降低胆固醇，抑制血小板的聚集，降低血浆浓度，增加微动脉的扩张度，促使血管舒张，调节血压，增加血管的通透性，从而抑制血栓的形成和预防动脉硬化。大蒜可帮助保持体内一种酶的适当数量而避免出现高血压。1.3.2 预防癌症和抗癌作用大蒜在现代医学中最早用作抗癌药物是20世纪50年代，发现大蒜中的硫代亚磺酸酯能够抑制肿瘤细胞生长13。近年来，有关大蒜防癌、抗癌作用的研究日益受到国内外学者的关注，对大蒜抑制肿瘤细胞生长和增殖(抗肿瘤作用)研究取得了显著的成果。大蒜可以减少各种组织和器官，如皮肤、乳房、结肠、结肠、食道、前列腺、膀胱、肺、肝及胃等患恶性肿瘤或癌症的风险14。1.3.3 抗衰老作用大蒜里的某些成份，有类似维生素E与维生素C的抗氧化，防衰老特性。研究发现大蒜中超氧化物歧化酶(SOD)含量丰富，大蒜的SOD活力为21.73（U/g）15。SOD是一种源于生物体的抗氧化、抗衰老的活性物质，能清除生物体在新陈代谢中产生的有害物质。所以大蒜具有良好的抗氧化、抗衰老的作用。1.3.4 降血脂作用徐彩菊16研究大蒜粗提物作为保健食品的降脂减肥作用。结果表明，大蒜粗提物 0.2、0.4 和1.2 g/kg剂量组能明显降低高血脂大鼠血清胆固醇（TC）含量；0.4、1.2 g/kg剂量组能明显降低血清甘油三酯（TG）含量，同时也明显降低肥胖大鼠的体重、增重和体内脂肪湿重；1.2 g/kg剂量组能明显降低肥胖大鼠的体脂比，其机制可能与调节机体脂质代谢有关。胡献国17指出，大蒜中的蒜素能够降低血液中有害胆固醇含量，能预防动脉硬化，降低血糖和血脂。美国科学家曾对400例冠状动脉硬化且发生过一次心肌梗死的患者进行试验，一半人每日服加大蒜汁的牛奶，另一半人服不加蒜汁的牛奶，3年后者死亡率较前者高一倍。加大蒜汁组既降低了血压，又减少了心脏病的发病率。1.3.5 保护肝脏作用大蒜具有提高肝脏解毒能力的作用，有助于进入人体内的重金属排出，防止汞、镉等被肠壁吸收。大蒜具有降低人体内转氨酶的作用，可以消除病毒性肝炎所引起的黄疸。大蒜中的微量元素硒，通过参与血液的有氧代谢，清除毒素，减轻肝脏的解毒负担，从而达到保护肝脏的目的。1.3.6 提高机体免疫力大蒜能激活人体巨噬细胞功能。研究发现，大蒜注射液对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬机能有明显促进作用，而且淋巴细胞转化率和玫瑰花瓣状反应均显著提高。大蒜中硒元素是谷胱甘肽过氧化酶的主要组成成分，其抗氧化能力比维生素E高500倍，对细胞膜有防护作用，参与辅酶A和辅酶Q的合成，从而提高机体免疫力。1.3.7 预防感冒大蒜制剂对预防感冒有明显效果。大蒜辣素对病原菌和寄生虫有良好杀灭作用，可预防感冒，减轻发烧、咳嗽、喉痛及鼻塞等感冒症状。日本研究人员对小鼠进行试验表明，大蒜具有阻止病原体侵入的作用，即使感染了感冒病毒，大蒜也有阻止发病的功能。1.4 大蒜的国内外的研究现状在古代就有许多关于大蒜的描述，在本草经疏中记载：“入足阳明、太阴、厥阴经”。在纲目有关大蒜的描述为“入太阴、阳明”。可以说大蒜的药用功效非常大。但是，大蒜含物质较多成分复杂，分离较难，对其各种有效成分研究相应较少，国内主要是对其综合价值的研究。国外的科学家们对大蒜的研究也给予了高度的重视，从药理、临床、应用等各个领域进行了比较深入系统的研究，获得了大量的研究成果，进一步证明了大蒜不仅是一种优良的保健食品，而且是一种具有广泛用途的天然药品。临床应用治疗感染性疾病。贾鹏应用大蒜素注射液静脉滴注，辅以中药灌肠治疗真菌性肠炎12例，结果痊愈10 例，好转2例，总有效率100。韩旭等应用大蒜素胶囊13服，配合中药冲洗坐浴，治疗念珠菌性外阴阴道炎618例。轻、中、重症有效率分别为100、93.8、70.83 。1.5 黄酮类化合物的概述黄酮类化合物是一类植物中分布很广且重要的天然产物，是具有2-苯基色原酮（flavone）结构的化合物。分子中含有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态（苷元）的形式存在。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及低于异物侵袭等方起重要的作用。有关黄酮类化合物的报道最早见著1962年，近几十年，又有许多关于黄酮类化合物的专著相继问世。由于黄酮类化合物具有广泛的药理作用，早在17世纪，黄酮得到广泛而深入的研究。1.5.1 黄酮类化合物的分类19(1) 黄酮和黄酮醇类黄酮和黄酮醇广发分布在各种植物中，是最典型的两类黄酮化合物。黄酮类是以2-苯基色原酮为基本母核，3位无氧取代基。而黄酮醇类以2-苯基色原酮为基本母核，3位有含氧取代基。黄酮类化合物种类繁多，其种类多样性的原因有以下三个因素：黄酮糖苷化的糖的种类不同；黄酮糖苷化的位点不同：单糖、双糖或者多糖取代。主要从各种植物的叶、枝、果实、干、心木和根等组织中分离得到。(2) 二氢黄酮二氢黄酮类化合物的主要特征：（1）黄酮的C2-C3双键消失；（2）C2是手性碳。在天然产物中，绝大部分二氢黄酮的B环都是朝向纸面内的，为构象。相反，朝向纸面外即为构象。主要分布于豆科，桑科等植物中。(3) 二氢黄酮醇二氢黄酮醇即3-羟基二氢黄酮，其结构变幻多样，是很多黄酮类化合物的植物主要成分。主要分布于豆科，菊科，桑科等植物中。(4) 花青素花青素是一类广泛存在于植物中的黄酮类化合物，与其他黄酮类化合物最大的不同之处是在其分子中含氧正离子。花青素被广泛的应用于饮料、糖果、果冻、果酱等食品工业。花青素的来源广泛，花瓣、果实、叶子、根茎等都可获得。(5) 查尔酮类查尔酮类化合物是黄酮类化合物的一个分支，可在细分为查尔酮类和二氢查尔酮类。查尔酮类化合物在大多数植物中都存在，尤其是在花中作用突出，有些查尔酮是花中色素的主要成分。(6) 橙酮类橙酮类是发现较晚的黄酮类化合物，由于橙酮母核的特点是结构中含有苯并呋喃环，存在共轭体系，所以橙酮本身也显黄色。(7) 异黄酮类化合物异黄酮类化合物主要来源于豆科植物，这类化合物的特点是B环取代在C3位上。异黄酮的基本骨架为三苯基色原酮，属于类黄酮化合物的一类次生代谢产物，可分为异黄酮、二氢异黄酮等。异黄酮类母体结构图 黄酮类母体结构图黄烷类结构母体图 黄酮醇类母体结构图1.5.2 黄酮类化合物的提取20（1）水提法顾名思义，水提法就是加水在一定温度下浸提。水提法的优点是成本低、安全性高,适于工业生产。缺点是总黄酮提取率较低,易将可溶于水的杂质如蛋白质、糖类提出,加大了进一步分离的困难,且易致霉变。此外,一些黄酮苷元难溶或不溶于水,不适于用水提法提取。（2）有机溶剂提取法对苷类和极性大的苷元如羟基黄酮、查耳酮、橙酮等，常用极性较大的溶剂如甲醇、乙醇或混合溶剂提取，对大多数苷元则用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等极性较小的溶剂提取。虽然有机溶剂对黄酮的提取率高，但缺点是大多有机溶剂都易燃易爆、多数有机溶剂具有强刺激性或有毒，会危害人体和污染环境、一般成本较高。（3）超声波法超声波提取技术的基本原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出。此外，超声波的次级效应，化学效应等也能加速提取成分的扩散释放，有利于提取。与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点。但超声波提取对容器壁的厚薄及容器放置要求较高，否则会影响药材的浸出效果，目前仍处于小规模实验阶段，要用于大规模生产，尚需进一步解决有关工程设备的问题。（4）微波提取法微波提取是利用不同结构的物质在微波场中吸收微波能力的差异，使基体物质中的某些区域或提取体系中的某些组分被选择性加热，从而使被提取物质从基体或体系中分离。此法的主要优点是可有效地保护药材中的功能成分，对提取物具有较高的选择性，提取率高、提取速度快、省时，溶剂用量少、安全、节能、设备简单，节省投资21。1.5.3 黄酮类化合物的测定19黄酮的测定依据主要是黄酮类化合物的结构和性质, 以及其颜色反应。定量测定方法主要有比色法和高效液相色谱法。（1） 黄酮类化合物的定性黄酮类化合物在其基本碳架上含有碱性氧原子, 而绝大多数都是带有酚性羟基的衍生物, 因而能与某些金属离子产生络合反应和与某些较强的还原剂发生颜色反应。因此, 可以根据黄酮类化合物的这一特性对其进行定性鉴定。主要颜色反应有: 紫外光下呈色反应。取该样品溶液点在滤纸上, 在可见光下呈灰黄色, 在紫外光下呈灰白色并有荧光斑点; 浓氨水反应。取该样品溶液点在滤纸上, 将滤纸在氨水上方熏0.5min, 立即在紫外光下观察, 呈极明显的灰绿色荧光斑点; 三氯化铝反应。取样品溶液点在滤纸上, 滴加1%三氯化铝乙醇溶液, 吹干。在可见光下呈灰黄色, 在紫外光下呈黄色荧光斑点; 乙酸镁反应。取样品溶液点在滤纸上, 滴加1%乙酸镁甲醇溶液, 吹干, 紫外光下呈黄色斑点; 盐酸一镁粉反应。取乙醇提取液lmL 于试管中加镁粉, 再加入浓的盐酸数滴( 1 次加入) , 在泡沫处呈紫红色; 纸层析。取样品溶液点在滤纸上。用正丁醇: 醋酸: 水=4: 1: 5 为展开剂, 上行展开5h, 取出晾干。喷1%氯化铝乙醇溶液, 吹干后于紫外光下, 可见荧光斑点。（2） 比色法比色法测定总黄酮的原理: 黄酮类化合物与铝离子在碱性与亚硝酸根存在条件下形成黄酮的铝络合物, 生产稳定的黄色。在一定范围内黄色的深浅与黄酮含量呈一定的比例关系, 以芦丁(对照品) 作标准, 于最大吸收波长处比色定量测定。（3） 高效液相色谱法此方法比较简单, 提取物质量一般, 测定方法一般采用比色法或液相色谱法, 比色法更为普遍。一些高效、方便快捷的提取新方法, 如微波萃取法、酶解法、超临界流体提取法, 以及准确、灵敏的检测方法, 如极谱法、气相色谱法、液相色谱与质谱联用法、毛细管电泳法等在大蒜黄酮研究中的应用有待进一步研究。1.6 黄酮类化合物的生物活性191.6.1 抗氧化活性人类心脑血管疾病、肿瘤、老年痴呆等疾病几乎都与氧自由基有关。据最新研究显示，黄酮类化合物清除自由基的作用机制主要与以下三个方面有关。（1）对体内酶的作用。体内许多氧化酶与自由基生成有关，而黄酮类化合物可特异地选择与氧化酶结合，影响酶的构象构型，从而抑制酶的活性。有研究发现，黄酮类化合物还可以通过增加体内抗氧化物酶活性而达到抗氧化的目的。（2）对金属离子的作用。从黄酮类化合物的分子结构来看，黄酮属于多酚羟基化合物，因此相邻的羟基或羰基上的氧原子可以作为配位原子同金属离子配合形成五元或六元化合物，能清除引发活性自由基产生的链反应中的催化剂。（3）终止自由基链反应。黄酮类化合物在抗化作用中，不仅可以清除活性自由基和起催化作用的金属离子，还可以抑制长生自由基的某些酶。更为重要的是，他可以通过酚羟基与自由基反应生成较稳定的半醌式自由基，从而终止自由基链反应，这被认为是黄酮类化合物抗氧化作用的最主要的机制之一。1.6.2 抗肿瘤活性抗肿瘤活性是黄酮类化合物药理作用的另一个研究热点。黄酮类化合物主要通过抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制癌基因表达等起到抗肿瘤的作用。抑制细胞在增值：主要表现在对肿瘤细胞具有细胞毒作用，而对正常细胞则无毒性和致突变作用，反而呈现抗氧化和正向免疫调节作用。诱导肿瘤细胞凋亡:关于黄酮类化合物促肿瘤细胞凋亡的机制，有研究报道异黄酮类化合物可以通过激活细胞内Ca2+诱导的细胞凋亡途径从而引发细胞凋亡。1.6.3 抗炎、免疫调节活性黄酮类化合物的抗炎、调节免疫系统活性主要表现在以下几方面。（1）对T细胞的作用。现普遍认为T细胞的增殖主要受酪氨酸蛋白激酶的调节。酪氨酸蛋白激酶可以催化细胞内酶作用底物的去磷酸化，继而促进T细胞的增殖。而黄酮类化合物主要通过抑制酪氨酸蛋白激酶的活性而抑制T细胞的增值，继而起到抗炎、调节免疫系统的作用(2)对B细胞的影响。黄酮类化合物可抑制B细胞的增值，而达到抗炎、调节免疫的目的。（3）对自然杀伤细胞的影响。（4）对巨噬细胞和单核细胞的的影响。（5）对肥大细胞和嗜碱性粒细胞的影响。证实黄酮类化合物可以有效地作用域动物的嗜碱性粒细胞，从而调节动物的免疫系统。（6）对中性粒细胞的影响。（7）对嗜酸性粒细胞的影响。黄酮类化合物不仅可以通过影响肥大细胞和嗜碱性粒细胞而达到抑制炎症因子分泌的目的，还可以抑制中性和酸性粒细胞溶酶体酶释放而抑制炎症因子分泌。1.6.4 抗病毒活性早在20世纪40年代，就有文献报道天然黄酮类化合物的抗病毒活性，但对于合成的或经结构改造后的黄酮类化合物的抗病毒活性在90年代后才有文献报道。譬如：槲皮素、芦丁、二氢槲皮素、芹菜素、儿茶素等黄酮类化合物据报道黄酮类化合物具有11众不同病毒活性。他们的病毒活性与其非糖苷复合物结构和C-3的羟基化作用密切相关。1.6.5 对心血管疾病的作用对冠状动脉疾病（LDL）的影响作用。LDL，特别是被氧化的LDL的增多被认为是冠状动脉疾病的危险信号。有研究发现其作用机理主要是通过抑制巨噬细胞诱导的脂质过氧化氢的增殖和保护脂蛋白中亲脂类抗氧化剂-生育酚的活性，从而达到降低发生冠心病的危险。胆固醇的增多也被认为是冠状动脉疾病的一个危险的信号。据文献报道，大豆异黄酮可以促进胆固醇的减少。1.6.6 解毒护肝和细胞保护作用肝脏易受到毒伞素、乙醇等物质的致命伤害。早有文献报道，黄酮类化合物水飞蓟素和水飞蓟宾具有明显的护肝作用。其护肝机理与黄酮类化合物的膜稳定作用有关，它能有限抑制机体内的脂质过氧化反应，而起到保肝的作用。目前，已有文献报道黄酮类化合物可以喝铁蛋白中的铁离子螯合，而减少铁蛋白中Fe2+和Fe3+的含量。1.6.7 抗菌作用关于黄酮类化合物的抗菌作用，早就有文献报道。其抗菌活性主要表现在其对真菌和细菌的抑制作用。（1）对细菌的抑制作用。据报道，黄酮类化合物具有抑制存在于鱼类中病原体的活性，蜂胶中富含的黄酮类化合物能有效抑制存在于口腔的各种病原体。但其具体抑菌活性作用机理尚未见相应的报道。（2）对真菌的抑制作用。1.7 研究意义大蒜这一被世界许多国家视为珍品的物产，在我国却一直未能被真正形成产业开发。我国大蒜基本上全部出口到世界各地，可进一步加工成系列产品，如保健食品、化妆品、饲料添加剂等可达几十种产品。目前, 已从桑叶、山楂叶、银杏叶、金银花、葛根、甘草、莽麦、大豆等多种植物中进行了黄酮类化合物的提取。研究表明，大蒜中含有黄酮类化合物，我国从大蒜中提取黄酮类物质的报道较少，且采用工业生产上常用的乙醇溶剂回流浸提的方法更为少见。该文研究了超声波辅助有机溶剂浸提大蒜黄酮的方法，以乙醇为溶剂，超声波辅助提取，以芦丁为标准品，采用分光光度法定量分析大蒜中总黄酮含量。为工业上生产大蒜黄酮提供理论依据，对于合理、充分利用丰富大蒜资源具有重要意义。与研究比较多的大蒜素相比，大蒜黄酮没有刺激性气味，将来可以作为功能性食品的基础原料。超声波提取技术的基本原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出。此外，超声波的次级效应，如机械振动、扩散、乳化、击碎、化学效应等也能加速提取成分的扩散释放，有利于提取。与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点18。黄酮类化合物是普遍存在于植物中天然物质。体内不能合成，只能从食物中摄取。对于调节生理机能， 提高生命运动质量，具有极其重要的意义。当人缺少黄酮类化合物时，容易导致大脑和心脏功能不全，血管硬化，脆性增强。因其分子小，易被人体吸收，能通过血管屏障，进入脂肪组织。所以对人体的健康有广泛的作用。黄酮的功效是多方面的，它是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基，如花青素、花色素可以抑制油脂性过氧化物的全阶段溢出，这种阻止氧化的能力是维生素E的十倍以上，这种抗氧化作用还可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生。黄酮类化合物可以降低胆固醇，可以改善血液循环，向天果中的黄酮还含有一种PAF抗凝因子，这些作用大大降低了心脑血管疾病的发病率，也可改善心脑血管疾病的症状。黄酮可以抑制炎性生物酶的渗出，可以增进伤口愈合和止痛，栎素由于具有强抗组织胺性，可以用于各类敏感症。目前，全国保健食品的开发呈现出欣欣向荣的形势。黄酮类化合物作为世界范围新兴的保健食品活性成分，以纯天然、见效快为特征，以人体补充黄酮的理论和严格的科学实验为基础， 为食用者带来实实在在的健康体验。黄酮类化合物在食品上的应用比较局限，主要以保健食品的形式存在。从产品形式上看，种类不多，基本是液态饮品。众多研究证实，黄酮类化合物具有保健功能，且已开发出多种保健食品。目前， 市售的生物类黄酮功能食品可谓琳琅满目，涉及到功能食品的许多方面，如防衰、防癌、提高免疫力、降脂、降压食品等，产品外观覆盖到液体、固体和半流体等多种形式。尽管食用大蒜对人类健康有利，但服用大蒜的有效剂量，大蒜中未知的生物活性化合物的种类以及生物学特性等仍待研究。大蒜产品的制作过程和功能成分的提取方法做进一步研究，尽可能保持大蒜及其制剂的高质量和其特殊的生物活性。希望未来利用大蒜生产的商品有所突破，对保健品以及药理作用有着重大意义。 2 实验材料与方法2.1 实验材料2.1.1 实验原料新鲜大蒜，购于吉林省长春市。2.1.2 实验试剂与设备与仪器芦丁， 标准品 上海友思生物技术有限公司；镁粉， 分析纯 天津光复精细化工研究所；盐酸， 分析纯 莱阳化工实验厂；硝酸铝 ， 分析纯 天津光复精细化工研究所；亚硝酸钠，分析纯 莱阳化工实验厂；氢氧化钠，分析纯 北京化工厂；无水乙醇，分析纯 天津富宇精细化工有限公司； 邻苯三酚，分析纯 沈阳市试剂五厂；牛肉浸膏，分析纯 沈阳市试剂五厂；蛋白胨， 分析纯 沈阳市试剂五厂；氯化钠， 分析纯 沈阳市试剂五厂；牛肉膏， 分析纯 沈阳市试剂五厂；酵母粉， 分析纯 沈阳市试剂五厂；氯化钠， 分析纯 沈阳市试剂五厂；甲醇， 色谱纯 美国Agilent公司；溴化钾， 光谱纯 天津市科器高新技术公司；AB-8大孔吸附树脂 天津市光复精细化工研究所；NAK-9大孔吸附树脂 天津市光复精细化工研究所；DB-101大孔吸附树脂 天津市光复精细化工研究所Jy3002电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SHB-循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海精密试验设备有限公司；RE52-98旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；DK-8D型电热恒温水浴锅 北京光明医疗仪器厂；高压灭菌锅 上海医用设备厂；UV754紫外可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司； 玻璃层析柱2cm50cm 上海青浦沪西仪器厂紫外分光光度计 Lambda 25型美国Perkin Elmer仪器公司红外光谱仪 Spectrum One FTIR型美国Perkin Elmer仪器公司2.3 实验方法2.3.1 原料预处理将新鲜的大蒜剥皮、切碎，在烘箱中55烘干，然后将大蒜进行粉碎备用。2.3.2 预实验3.3.2.1 大蒜化学成分的鉴定(1) 黄酮类化合物25盐酸镁粉反应：可能有黄酮类化合物存在的原因：加入镁粉几颗、滴入浓盐酸几滴的放在试管中的1mL乙醇提取液（必要时在沸水中加热3分钟）是否显红紫颜色。(2) 生物碱的检识改良碘化铋钾（Dragendorff）试剂：一般在棕色瓶内保存将由0.85g的碱式硝酸铋溶于10mL的乙酸和40mL水中得到的试剂一和0.8g碘化钾溶于20mL水中就得到的试剂二等量混合。用前各自取2mL上述的液体、4mL的乙酸与20mL水混合。若显橙红色表明提取液中存在有生物碱成分的。(3) 酚类成分的检识可能含有酚类的原因：取12滴1%三氯化铁试剂加在1mL乙醇提取液观察其呈蓝墨绿色或蓝紫色颜色变化的可直接进行检查的如为酸性的提取液，碱性的可加乙酸酸化后检查。(4) 糖及苷Molish反应：含有糖类或苷类的可能，观察产生紫红色环颜色的变化在浓硫酸的接触面的少量浓硫酸被沿试管壁慢慢的加入前加入23滴的5%的萘酚乙醇液前1mL的水提取液或乙醇提取液中摇匀后。(5) 甾体及萜类李伯曼反应（Liebermann-Burchard反应）：可能含有甾体皂苷元、甾醇或三萜类化合物，在试管中的颜色逐渐由黄红紫蓝墨绿变化因为分别加入使它充分溶解的1mL冰乙酸在将溶剂挥发出去的3mL的再加1mL乙酸酐和滴入1滴浓硫酸在乙醇提取液和残渣。显色反应：用新鲜配制的5%磷钼酸乙醇溶液喷洒在滤纸上挥去溶剂的乙醇提取液，在120烘到出颜色，正反应为显蓝蓝紫色斑点。(6) 有机酸是否有黄色斑点在蓝色背景下的观察在喷雾溴甲酚绿试剂的硅胶板上先点上适量的乙醇的提取液之后。2.3.2.2 大蒜总黄酮提取方法的选择（1）水提取法：取粉碎的大蒜粉末10g，加入50mL水，放在75水浴中提取2h，纱布过滤后减压抽滤，弃滤渣得到的黄色滤液为大蒜总黄酮提取液。用紫外分光光度计测定其吸光度。（2）乙醇回流提取法：取粉碎的大蒜粉末10g，加入160mL的75%乙醇溶液，于75下的水浴中回流提取2h，纱布过滤后减压抽滤，弃滤渣得到的黄色滤液为大蒜总黄酮提取液。用紫外分光光度计测定其吸光度。（3）超声波辅助乙醇提取