SNP及检测关键技术专业资料.doc

1定义：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），重要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起DNA序列多态性。它是人类可遗传变异中最常用一种。占所有已知多态性90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，预计其总数可达300万个甚至更多。SNP所体现多态性只涉及到单个碱基变异，这种变异可由单个碱基转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基插入或缺失所致。但普通所说SNP并不涉及后两种状况。单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸变异，涉及置换、颠换、缺失和插入。所谓转换是指同型碱基之间转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间替代;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间替代。从理论上来看每一种SNP 位点都可以有4 种不同变异形式，但事实上发生只有两种，即转换和颠换，两者之比为2：1。SNP 在CG序列上浮现最为频繁，并且多是C转换为T ，因素是CG中C 常为甲基化，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。普通而言，SNP 是指变异频率不不大于1 %单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一种SNP ，人类基因组上SNP 总量大概是3 106 个。根据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替代状况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换发生频率占多数,并且是C2T 转换为主,其因素是Cp GC 是甲基化,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T ，Cp G 也因而变为突变热点。理论上讲，SNP既也许是二等位多态性，也也许是3个或4个等位多态性，但事实上，后两者非常少见，几乎可以忽视。因而，普通所说SNP都是二等位多态性。这种变异也许是转换（C T，在其互补链上则为G A），也也许是颠换（C A，G T，C G，A T）。转换发生率总是明显高于其他几种变异，具备转换型变异SNP约占2/3，其他几种变异发生几率相似。Wang等研究也证明了这一点。转换几率高，也许是由于CpG二核苷酸上胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变位点，其中大多数是甲基化，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。SNP 在动物基因组中分布广泛,每一种核苷酸发生突变概率大概为10 - 9 。由于选取压力,SNP在单个基因、整个基因组中以及种群间分布是不均匀。SNP 在非编码区中要多于编码区,并且在编码区也是非同义突变(有氨基酸序列变化) 频率比其她方式突变频率低得多4 。而基因间,同一种基因中编码SNP (coding SNP ,cSNP) 数目也不相似,可从029 个不等。多项研究同步发现不同种族间SNPs 数目也是不同,非洲人群及非裔种族中SNPs 数量最多,而其她种群SNPs 要少得多,因而通过比较亚群间等位基因频率将有助于阐明种族构造和进化。在基因组DNA中，任何碱基均有也许发生变异，因而SNP既有也许在基因序列内，也有也许在基因以外非编码序列上。总来说，位于编码区内SNP（coding SNP,cSNP）比较少，由于在外显子内，其变异率仅及周边序列1/5.但它在遗传性疾病研究中却具备重要意义，因而cSNP研究更受关注。从对生物遗传性状影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP（synonymous cSNP），即SNP所致编码序列变化并不影响其所翻译蛋白质氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基含义相似；另一种是非同义cSNP（non-synonymous cSNP），指碱基序列变化可使以其为蓝本翻译蛋白质序列发生变化，从而影响了蛋白质功能。这种变化常是导致生物性状变化直接因素。cSNP中约有一半为非同义cSNP。先形成SNP在人群中常有更高频率，后形成SNP所占比率较低。各地各民族人群中特定SNP并非一定都存在，其所占比率也不尽相似，但大概有85%应是共通。2.SNP自身特性：1）SNP数量多，分布广泛。据预计，人类基因组中每1000个核苷酸就有一种SNP，人类30亿碱基中共有300万以上SNPs.SNP 遍及于整个人类基因组中，依照SNP在基因中位置，可分为基因编码区SNPs（Coding-region SNPs，cSNPs）、基因周边SNPs（Perigenic SNPs，pSNPs）以及基因间SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）等三类。2） SNP适于迅速、规模化筛查。构成DNA碱基虽然有4种，但SNP普通只有两种碱基构成，因此它是一种二态标记，即二等位基因（biallelic）。 由于SNP二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-分析，而不用分析片段长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。3） SNP等位基因频率容易预计。采用混和样本估算等位基因频率是种高效迅速方略。该方略原理是：一方面选取参照样本制作原则曲线，然后将待测混和样本与原则曲线进行比较，依照所得信号比例拟定混和样本中各种等位基因频率。4） 易于基因分型。SNPs 二态性，也有助于对其进行基因分型。对SNP进行基因分型涉及三方面内容：（1）鉴别基因型所采用化学反映，惯用技术手段涉及：DNA分子杂交、引物延伸、等位基因特异寡核苷酸连接反映、侧翼探针切割反映以及基于这些办法变通技术；（2）完毕这些化学反映所采用模式，涉及液相反映、固相支持物上进行反映以及两者皆有反映。（3）化学反映结束后，需要应用生物技术系统检测反映成果。绝大多数疾病发生与环境因素和遗传因素综合伙用关于，普通以为是在个体具备遗传易感性基本上，环境有害因素作用而导致疾病。不同群体和个体对疾病易感性、抵抗性以及其她生物学性状（如对药物反映性等）有差别，其遗传学基本是人类基因组DNA 序列变异性， 其中最常用是SNP.易感基因特点是基因变异自身并不直接导致疾病发生，而只导致机体患病潜在危险性增长，一旦外界有害因素介入， 即可导致疾病发生。此外在药物治疗中，易感基因变异导致药物对机体疗效和副作用不同。随着人类基因组筹划进展，人们愈来愈相信基因组中SNP 有助于解释个体表型差别、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病易感性以及对各种药物耐受性和对环境因子反映。因而， 寻找和研究SNP 已成为人类基因组筹划内容和目的之一。多态性与突变区别1、多态性是一种群体概念，多态性指这个差别占群体1%以上。否则就叫突变（不大于1%）2、SNP是多态性中一种，只是进一步限定了差别只是单碱基。3、SNP普通来说，是所有体细胞同样基因型（除开嵌合体）。4、突变普通不是一种个体所有细胞变化。5、如果突变发生在生殖细胞，则可以遗传，但是只要这个突变群没有达到总群体1%，它就只是一种突变株/系。达到了1%就是多态性了。惯用数据库：Human Gene Mutation Database (HGMD) / / The Genome Database (GD) / /Database of Single Nuleotide Polymorphisms (dbSNP) / /Human Genome Variation Database (HGVbase) / /The Snp Consortium， LTD.（TSC） / /.org3.SNP既有检测技术人们对SNP 研究办法进行了许多摸索和改进。SNP 分析技术按其研究对象重要分为两大类,即：对未知SNP 进行分析,即找寻未知SNP 或拟定某一未知SNP 与某遗传病关系。检测未知SNP 有许各种办法可以使用,如温度梯度凝胶电泳( TGGE) 、变性梯度凝胶电泳(DGGE) 、单链构象多态性(SSCP) 、变性高效液相色谱检测(DHPLC) 、限制性片段长度多态性(RFL P) 、随机扩增多态性DNA(RAPD) 等,但这些办法只能发现具有SNP DNA 链,不能确知突变位置和碱基类别,要想做到这一点,必要对那些具有SNP DNA 链进行测序。对已知SNP 进行分析,即对不同群体SNP遗传多样性检测或在临床上对已知致病基因遗传病进行基因诊断。筛查已知SNP 办法有等位基因特异寡核苷酸片段分析(ASO) 、突变错配扩增检查(MAMA) 、基因芯片技术(gene chips) 等。由于人类基因工程带动,许多物种都已开始了基因组项目,并建立了大量数据库,比较这些来自不同实验室不同个体序列，就可以检测到SNP。SNP位点信息已知状况下， 选取SNPGENOTYPING办法，重要依照你经费状况设计，我分别给你分析一下现状：A、普通实验室： 经费普通， 仪器不具备时， 最多用是如下两种办法：1、基于PCR办法，也叫AS-PCR， (ALLELE-SPECIFIC PCR)办法。 重要原理是运用引物在扩增时3端相对高BASE规定，进行设计。这个办法是最便宜， 不需要酶切， 一次PCR就可以得到GENOTYPING信息。缺陷： PCR对于3端特异性在不同退火温度时有出入， 因此退火温度摸索很核心，否则假阳性扩增是很容易。此外， 内参照设立也很重要，这个东西还是很故意思。 并且，所使用引物位置无法人为调节，只能放在SNP5段。2、基于酶切分型。 依托限制性内切酶忠贞性进行单SNP分型。 SNP突变与否， 也许影响某个酶辨认位点存在或消失。 通过酶切产物电泳条带，判断SNP突变状况， 即纯和， 野生纯和，和杂和子。当没有直接可运用酶切位点时，可以采用突变引物中个别BASE，从而凑成切点设计，也叫做RG-PCR， restriction site generation PCR。B、有经费实验室办法：这里我写几种自己曾经涉足过办法，可行性比较强， 但是需要相应经费支持和相应仪器，但是通量相对更高， 效率更好：1、直接测序， 基于PCR产物直接sequencing办法， 比对序列成果， 就可以进行SNP辨认和分析。2、分型质谱， 华大生物信息平台那边可以外接服务， 提供PCR产物即可。3、pyro-sequencing， 微测序， 中科院遗传所 王沥研究员那里有可以联系外接服务。4、D-HPLC， 变性高效液相色谱法。 北京可以去联系做地方不少， 北京大学生科院有机器， 此外北京大学肿瘤研究所也有机器， 国家人类基因组陈标那里也有一台， 需要做话， 拿着经费和她们联系就可以， 这个办法也很不错， 价钱可以商量。5、尚有些办法，如DNA芯片技术适合对于large scale SNP筛查， 普通用于组学领域， 也许不合用与您状况。 尚有许多如荧光共振能量转移等办法/探针杂交法等，并未在本领域中华人民共和国内推广， 就不一一简介了。1）测序 重要发现新SNP位点和比较集中SNP位点，如hla区域，但成本较高，工作量大，不适合大样本做疾病关联分析。2）taqman探针成果比较可靠，国外文章也大量应用，但是对于国内成本偏高，同类尚有snpshot技术，abi和贝克曼都相应试剂盒。成本和成功率都比taqman要低。3）snp芯片国外大规模筛查疾病关联分析惯用，illumina和affy均有不同密度成熟产品，单位点成本很低，但点较多，样本多时也会很高耗费，但成果精确，适合复杂疾病，有实力项目组普通大型机器点在384-群基因组可以订制，但成本会高；illumina开发了一台小芯片，极其适合1-384，可以订制，成本在2-5元/人点，但还没有很成熟流程，详细效果和成功率要进一步看。4）剩余就是老式办法如酶切，PCR-SSCP等，也有杂志接受，但普通需要测序验证。缺陷是工作量太大，成果不精确，不是所有位点都可以做，但成本很低。当前已有各种办法可用于SNP检测，如依照DNA列阵微测序法、动态等位基因特异杂交、寡聚核苷酸特异连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。但不论哪一种办法，一方面必要进行靶序列扩增，然后才干进行其他检测。老式SNP检测办法是采用某些已有成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异寡聚核苷酸杂交(ASO)等。这些技术虽在某种限度上能完毕对SNP检测，但由于它们必要通过凝胶电泳进行检测，因而，距迅速、高效、自动化目的还相差甚远。老式RFLP只能检测到SNP一某些，测序技术既费时费力，又不易实现自动化，并且DNA链二级构造还容易导致人工假相，使测序成果浮现偏差，不适当于SNP检测；SSCP则很难满足自动化需要，难以大规模开展工作。因而，这些办法均未被广泛采用。DNA芯片技术是近年来新开发一种DNA序列变异检测工具。DNA芯片(DNA chip),也称生物芯片(biochip),其大小与计算机上CPU芯片相似，约1 cm2或更大些，以玻璃、硅、聚丙烯等作为载体基片，芯片上铺了一层肉眼看不见DNA纤维“地毯”，即具备特定碱基序列探针。待测基因经提取后，被切成长短不一片段，经荧光化学物质标记后，注射到嵌有芯片载片上。由于DNA和探针杂交限度与荧光强度有关，因而通过激光扫描，即可依照荧光强弱测出被检测序列变异。当前已有多家公司开展了对芯片研究，例如美国Affymetrix公司、NEN生命科学公司等。前者曾开发出BRCA1(乳癌基因1号)芯片、p53芯片等，后者则在1张玻璃芯片上集成了多达2400个已知基因。此外，Research Genetics公司新近开发了1个集成有1500个SNPDNA芯片，它涵盖了人类基因组所有24条染色体，所提供信息量至少等于或优于当前惯用300400个微卫星标记图谱，检测时只需0.5gDNA样品就可进行1次全基因组扫描。此外Transgenomic公司WAVE核苷酸片段分析系统是高通量且较为精确可靠筛查未知、已知SNP新办法。运用Transgenomic公司WAVE核苷酸片段分析系统进行SNP检测平均每个样本费用为$0.5。 4. 当前SNP功能研究重要有如下几方面：SNP 分型技术可分为两个时代，一为凝胶时代，二为高通量时代。凝胶时代重要技术和办法涉及限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）、寡核苷酸连接分析（OLA）、等位基因特异聚合酶链反映分析（AS2PCR）、单链构象多态性分析（SSCP）、变性梯度凝胶电泳分析（DGGE），虽然这些技术与高通量时代技术原理大体同样，但是由于它不能进行自动化，只能进行小规模SNP分型测试，因此必然会被裁减。高通量时代SNP分型技术按其技术原理可分为:特异位点杂交（ASH）、特异位点引物延伸（ASPE）、单碱基延伸（SBCE）、特异位点切割（ASC）和特异位点连接（ASL）5 种办法。此外，采用特殊质谱法和高效液相层析法也可以大规模、迅速检出SNP 或进行SNP 初筛。近年来已经在晶体上用“光刻法”实现原位合成，直接合成高密度可控序列寡核苷酸，使DNA 芯片法显示出强大威力，对SNP 检测可以自动化、批量化，并已在建立SNP 图谱方面投入实际应用。DNA 芯片法有望在半晌之间评价整个人类基因组。1)报告基因转染技术：这一技术重要用于研究启动子SNP对于mRNA转录效率，是通过观测转录结局来判断SNP与否具备功能。2)EMSA技术：通过在体外合成含SNP位点寡核苷酸与转录因子特异性结合，观测结合强度和效率,但是该技术由于只人工合成较短长度寡核苷酸，没有考虑SNP周边遗传背景环境影响,因而在重复性和说服力上不强。3)ChiP技术：该技术通过超声将染色体碎片化,再将碎片化核酸与转录因子结合，最后通过PCR技术观测判断结合效率和强度，该技术克服了EMSA某些缺陷,当前做文献较多。5 SNP产生功能机制研究个人之所见1.对大多数SNP而言，都由于位于某些非编码区域而不产生明显功能性影响，此时做SNP功能意义不大。2.启动子SNP研究是做人最多，有关实验技术都比较成熟，其产生功能机制重要是影响TF与启动子结合能力，从而调控基因转录。3.编码区SNP有同义和非同义2种，非同义突变由于会导致氨基酸变化，从而影响蛋白质功能，特别是发生在构造功能区域SNP特别重要，可是这方面技术还存在瓶颈，做得相称少，据我所知要用什么诱导点突变办法再去评价蛋白质功能。至于非同义突变，虽然没有明显功能分子机制，但是在遗传学上也许由于与附近其他致病基因表达或者SNP连锁，因而在流行病学上形成阳性成果普通以此解释。4.内含子区域SNP产生功能分子机制普通是与附近其他基因SNP连锁或者也许影响mRNA剪接从而影响蛋白质功能诸多研究中做INTRON发既有阳性成果解释不了，并且大多只是猜测。PYRO测序用于SNP基因分型其实是一种段片段焦磷酸测序技术，在测序引物引导下，完毕段片段（含snp）测序，从而实现基因分型。缺陷：不能检测长片段，对于重复序列没有办法。原理简介1.测序引物与单链，PCR扩增DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育。2.四种dNTP之一被加入反映体系，如与模扳配对，此dNTP与引物末端形成共价键，dNTP焦磷酸基团（PPi）释放出来。并且释放出来Ppi量与和模板结合dNTP量成正比。3.ATP sulfurylase在adenosine 5 phosphosulfate存在状况下催化PPi形成ATP，ATP驱动luciferase介导Luciferin向oxyluciferin转化，oxyluciferin发出与ATP量成正比可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram反映为峰。每个光信号峰高与反映中掺入核苷酸数目成正比。4.TP和未掺入dNTP由Apyrase降解，淬灭光信号，并再生反映体系。5.然后加入下一种dNTP。最后待测序列顺序，即可从反映光强信号峰中读出。在此过程之中有几点值得注意是，在体系中使用是dATPS而非dATP，由于dATPS不是荧光素酶底物，并且DNA聚合酶对dATPS催化效率更高。并且在系统之中，底物浓度已经最佳化，使得dNTP降解速度慢于它掺入速度，ATP合成速度快于水解速度，其中三磷酸腺苷双磷酸酶特异浓度，可以保证降解完全，使系统复原。Real time PCR检测SNP办法是：针对目的基因片段突变位点，设计两条引物，这两条引物区别仅仅是末端1-2个碱基不同，分别与突变位点匹配。共同下游引物和探针。然后扩增。就可以得到不同CT值，依照CT值不同，来拟定基因类型。1 、把蛋白序列相应核酸序列找到。2 、依照核酸序列做BLAST （对dbSNP数据库）。3 、成果中，可以得到你序列上因此已知SNP。以编码5-hydroxytryptamine (serotonin) receptorHTR1A基由于例，先进入entrez，选取gene选项，在NCBI中搜HTR1A基因，到如下图界面，点基因缩略图，然后点graphics。点击后界面如下。这里已经很清晰地标明了SNP所在位置以及相应核酸与蛋白序列。但有一点要阐明，我注意到这个基因编码蛋白序列与swissprot序列有某些差别，很也许是收录版本不同，或是有些序列是NCBI直接依照orf形成.1，如果是检测基因所有已知SNP，那么一方面要去理解并查询到这些SNP位点，SNP位点可以通过查询dbSNP数据库（）和TSC（The SNP Consortium）数据库（），可以获知基因及上下游邻近序列SNP位点。2，至于挑选原则，可以简介一下Hap Map正规化原则：SNP Selection CriteriaCategory 1 verifiedThis contains all SNPs for which we have allele frequency or genotyping data. This includes SNPs from the TSC allele frequency project，as well as SNPs characterized by JSNP. These SNPs were generated from those rs clusters in which at least one of the SNPs in the cluster contains genotype or allele frequency data and the minor allele must have been seen in at least two individuals.Category 2 two-hitThese are true double-hit SNPs，produced in collaboration with Jim Mullikin and Sarah Hunt. A double-hit SNP must be seen twice，in two different DNA samples which must have produced two alleles. TSC trace data was only allowed to contribute one hit per allele because the individual source DNA for a trace could not be identified.Category 3 jsnp-verified/perlegen-verified”This category contains two groups：SNPs that JSNP certifies are likely to be real based on manual inspection of their data (but have not been genotyped)， and SNPs that Perlegen verified independently.Category 4 bac-overlapThese are SNPs from BAC overlaps that do not fall into category 1 or 2 above基因芯片与SNP分析基因芯片技术作为一种新兴生物技术，近年来得到迅速发展，其应用品有巨大潜力。单核苷酸多态性（SNP）作为新遗传标记对基因定位及有关疾病研究意义亦非常重大。本文重要简介了DNA 芯片技术原理和分类、单核苷酸多态性检测办法及DNA 芯片技术在单核苷酸多态性检测方面应用。生物芯片技术是90 年代初发展起来，集分子生物学、微电子技术、高分子化学合成技术和计算机科学等于一身一门新型技术。当前发展生物芯片种类繁多， 如蛋白质芯片、基因芯片、激素芯片、药物芯片等。但最初生物芯片重要用于对DNA 测序， 基因表达谱鉴定及基因突变体检测、分析等方面。迄今为止， 使用最多也是DNA 芯片。DNA 水平遗传多态性标记至今已经历了3 个阶段:限制性酶切片段长度多态性标记（RFLP）、DNA 重复序列多态性标记（涉及小卫星、微卫星DNA 重复序列）、单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymorphisms ， SNPs）。 SNP 具备数量多，分布广泛，易于迅速、规模化筛查，便于基因分型等特点。随着着SNP 检测和分析技术进一步发展，特别是与DNA 芯片等技术结合， SNPs 在基因定位中具备巨大优势和潜力， 并为DNA芯片应用于遗传作图提供了基本。由于基因芯片具备携带信息量大和检测以便特点，使得用DNA 芯片对SNP 进行分析具备辽阔前景。DNA 芯片和SNP 分析已日益成为研究功能基因组学工具。1 、基因芯片 基因芯片基本原理是应用已知核苷酸序列作为探针与标记靶核苷酸序列进行杂交，通过对信号检测进行定性与定量分析。基因芯片可在一微小基片（硅片、玻片等）表面集成大量分子辨认探针，可以在同一时间内平行分析大量基因，进行大信息量检测分析。基因芯片应用很广， 依照所用探针类型不同分为cDNA 微阵列（或cDNA微阵列芯片） 和寡核苷酸阵列（或芯片），依照应用领域不同而制备专用芯片如毒理学芯片（toxchip）、病毒检测芯片（如肝炎病毒检测芯片）、p53 基因检测芯片等。依照其作用可分为检测基因质和量芯片。量检测涉及:检测mRNA 水平、病原体有无及比较基因组基因拷贝数，既可用寡核苷酸芯片，又可用cDNA 芯片完毕，但cDNA 芯片更具优势。质检测涉及:DNA 测序及再测序、基因突变和SNP 检测等，重要用寡核苷酸芯片完毕。巢式PCR-RFLP技术 “巢式PCR-RFLP是针对任意基因分型技术，使任何位点最后都能进行常规限制性内切酶鉴定；同步该SNP分型技术运用巢式PCR技术，使得各种位点同步进行分析成为也许。虽然低浓度DNA也可以进行迅速精确分型工作。 与既有常规分型技术相比，其最大优势涉及：(一)所需DNA浓度低。1-2ng/uL也能完毕检测工作，而Taqman技术所需DNA含量至少5ng/uL。(二)价格低。由于不需要合成荧光探针，使得该技术比Taqman技术价格低，该优势在对各种位点同步进行分型时更明显。技术基本原理和实例采用巢式PCRRFLP分型技术，其基本本来是运用PCR引物3端，对SNP位点附近碱基进行人为改造，产生一种常规限制性内切酶辨认序列，如SNP rs1321425（rs1321425来自NCBIrefSNP数据库）C/G，其任何一种碱基和上下游碱基无法形成一种可直接被限制性内切酶辨认序列，于是咱们对SNP位点前上游碱基进行改造，通过对序列分析和PCR效果计算，咱们将原本四个碱基AGAT改成CTGC，结合后一种碱基A以及SNP位点G，形成CTGCAG（PstI）酶切辨认位点，经测序和序列对比，改导致功。又例如rs9309462和rs4646642，成功将2个碱基，3个碱基进行成功改造。rs1321425TCACAAAAAATAAAAAATTTTAATTTTAAAGGAGATA C/G ACAAGAAATGAGCATGTGTGAAAGCAC TTCTGTAAACTACATGCACTAAT与Taqman技术和普通技术详细对比 分型技术 PCR-RFLP技术 Taqman技术 普通PCR-RFLP技术最佳运用时机 200-600样本，任何DNA多态位点 样本量不不大于500人份 仅适合具有现成酶切位点多态位点分型 试剂投入 低 荧光探针，需3000-4000元。有也许实验失败需重新花钱设计荧光探针。 低 技术合用性 可适合任何多态位点分型 基本适合任何多态位点分型，但有时若干位点不能成功进行实验；当分型位点过于接近也不能用该办法。 仅适合具有现成酶切位点多态位点分型，有时浮现是某些稀有酶酶切位点，导致效率低下或费用昂贵； 成果判断 直观，明确，稳定 间接，每管反映必要加荧光参照ROX，否则成果判断不拟定 普通直观，明确；有时酶切位点出当前非主频等位基因上，导致成果判读困难 成果稳定性 稳定 普通 稳定 成果精确性 精确度高 普通 精确度高 样本消耗量 1-2ng 5-10ng 50100ng 实验耗时 2-3周 由于要定制MGB荧光探针，和预实验，也需要2-3周 2-3周操作流程1基本信息收集详细内容涉及客户信息、样本数(case,control)数、位点信息等。2 位点信息查询 重要涉及：2.1 位点上下游各300bp确切序列，基因频度;2.2 有无文献报道证明该位点多态存在于中华人民共和国人群;2.3 如无上述有关文献，在J-SNP数据库中查询该位点多态与否存在于东亚人群中。为了保证成果可靠，实验方案设计原则上应以野生型进行酶切鉴定，因而确认snp频度是非常重要。3样品质控从所有样品中取8%样品，即96个样品中取8个样品，用咱们一对特异PCR引物进行样品质控，以检测送来样品与否良好。由于客户样品质量是实验成功核心因素之一，只有客户提供样品质量可靠稳定，那么成果自然就好。4引物设计同步设计AB两套方案，分别以正链和负链为模板设计引物。5单管测试进行实验方案可行性尝试，一方面要在各种温度，各种Mg离子、各种添加剂加入状况下进行方案可行性测试，对于所有单管测试成果都送去测序，以保证序列对的性，在实验成果得到确认基本上，挑选稳定方案进入中试过程。6中试抽取8个样品做小规模批量实验，以模仿和检查批量PCR状况和酶切状况。7大规模实验准备将DNA模板按方案进行一次性分板(有冗余)，并引入阳性和阴性对照，同步将所有有关PCR体系进行一次性大规模分装，防止污染。8第一板数据先用一板模板进行一轮PCR和酶切，以检查体系和分板状况。9正式实验有关技术要点1实验设计必须保证野生型被限制性内切酶切开由于对于只有少量突变型SNP位点，如果突变型被切开，那么所得到实验成果就是大量没有被酶切开PCR产物，而这个成果与酶切实验失败成果非常类似，不易区别，对成果判读导致很大麻烦，因而保证了主频碱基被解开，从主线上保证了实验可靠性。2偏向性扩增解决。所谓偏向性扩增是由于SNP位点上会往往存在嘌吟和嘧啶替代，在PCR过程中，聚合反映对嘧啶(C或T)比较敏感，使得嘌吟(A或T)扩增非常少，而浮现偏向性扩增，这在SNP位点附近嘌吟含量较高时特别明显。为此，我司专门设计一种方案，用以克服偏向性扩增。3方案设计中内切酶选取虽然从理论上，咱们方案可以进行任意位点改造，但事实上在改造过程中会浮现一系列问题，涉及扩增效率，碱基划移等一系列问题，使得改造方案失败。对此，咱们公司专业开发了一种引物设计软件，通过运算获得最佳改造方案，同步通过在正向和反向序列上同步设计方案，以保证明验成功。4PCR产物污染问题在大规模PCR过程中，最严重问题是PCR产物污染，据咱们经验总结，80以上污染是由于接触式污染，剩余污染则涉及气溶胶污染等环境导致污染。对于PCR污染这个问题，我司制定了严格实验办法，详细涉及使用滤芯抢头、所有PCR体系全某些装、PCR体系与各类模板严格分离、配备体系人员与接触PCR产物人员严格分离等一系列办法，同步在解决PCR管，eppendorf管时也规定了详细操作过程。5关于质量控制问题在每板PCR过程中，咱们会放入两个阴性对照和一种重复对照，以确认PCR过程中不会产生污染和PCR成果的确可信。 RFLP技术一、材料 基因组DNA(不不大于50kb,分别来自不同材料)。 二、设备 电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸 ，eppendorf管(0.5ml)若干。 三、试剂： 1、限制性内切酶(BamH，EcoR，Hind，Xba)及10酶切缓冲液。 2、5TBE电泳缓冲液：配方见第一章。 3、变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。 4、中和液：1mol/LTrisCl，pH7.5/1.5mol/L NaCl 。 5、10SSC：配方见第九章。 6、其他试剂：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L TrisCl，pH7.5/2SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl 。 四. 操作环节 1. 基因组DNA酶解 (1) 大片断DNA提取详见基因组DNA提取实验,规定提取DNA分子量不不大于50kb，没有降解。(2) 在50l反映体系中,进行酶切反映:5g基因组DNA 5l 10酶切缓冲液 20单位（U）限制酶(任意一种) 加ddH2 O，至50l (3) 轻微振荡，离心,37反映过夜。(4) 取5l反映液,0.8琼脂糖电泳观测酶切与否彻底，这时不应有不不大于30kb明显亮带浮现。 注意 未酶切DNA要防止发生降解，酶切反映一定要彻底。 2. Southern转移 （1） 酶解DNA经0.8琼脂糖凝胶电泳(可18V过夜)后EB染色观测。 （2） 将凝胶块浸没于0.25mol/L HCl中脱嘌呤，10分钟。 （3） 取出胶块，蒸馏水漂洗，转至变性液变性45分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。 （4） 预先将尼龙膜,滤纸浸入水中,再浸入10SSC中,将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置,盖上尼龙膜,上覆二层滤纸,再加盖吸水纸,压上半公斤重物，以10SSC盐溶液吸印,维持18-24小时。也可用电转移或真空转移。 （5） 取下尼龙膜，0.4mol/L NaOH 30秒，迅速转至0.2mol/L TrisCl,pH7.5/2SSC,溶液中，5分钟。（6） 将膜夹于2层滤纸内，80真空干燥2小时。 （7） 探针制备和杂交见第九章分子杂交某些。注意 1、环节（2）中脱嘌呤时间不能过长。2、除环节（1）、（4）、（5）外，别的均在摇床上进行操作。3、环节（4）中,当尼龙膜覆于胶上时，绝对防止胶与膜之间有气泡发生，加盖滤时也不应有气泡发生。4、有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP差别，这时应当试用另一种酶PCR产物电泳检测时间普通为48h以内，有些最佳于当天电泳检测，不不大于48h后带型不规则甚致消失。一.假阴性，不浮现扩增条带PCR反映核心环节有模板核酸制备，引物质量与特异性，酶质量及活性 PCR循环条件。寻找因素亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中具有杂蛋白质，模板中具有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不浮现扩增带，极有也许是标本消化解决，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定消化解决液，其程序亦应固定不适当随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同步使用，以分析与否因酶活性丧失或不够而导致假阴性。需注意是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物浓度、两条引物浓度与否对称，是PCR失败或扩增条带不抱负、容易弥散常用因素。有些批号引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，导致低效率不对称扩增，对策为：选定一种好引物合成单位。引物浓度不但要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带浮现，并且两引物带亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有也许失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏某些，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可减少PCR扩增特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反映体积变化：普通进行PCR扩增采用体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是依照科研和临床检测不同目而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理因素：变性对PCR扩增来说相称重要，如变性温度低，变