干旱胁迫下沙棘CMO基因的时空表达模式与蛋白结构预测.pdf

西北林学院学报2 0 2 4,3 9(2):2 1-2 7J o u r n a l o f N o r t h w e s t F o r e s t r y U n i v e r s i t y d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 1-7 4 6 1.2 0 2 4.0 2.0 3干旱胁迫下沙棘CMO基因的时空表达模式与蛋白结构预测 收稿日期:2 0 2 3-0 2-0 3 修回日期:2 0 2 3-0 4-0 4 基金项目:国家自然科学基金(3 1 6 6 0 0 7 1);青海省科技厅项目(2 0 1 7-Z J-7 3 4);青海省“高端创新人才千人计划”项目。第一作者:刘青青。研究方向:林木遗传育种,生态修复等。E-m a i l:2 9 9 4 5 7 3 4 2 3q q.c o m*通信作者:马玉花,博士,教授,硕士生导师。研究方向:森林培育理论与技术、植物资源开发利用。E-m a i l:q h x n m y h 1 6 3.c o m刘青青,马玉花*,董佳伟,冶贵生,张 丹,杨开宇(青海大学 农牧学院,青海 西宁 8 1 0 0 1 6)摘 要:CMO基因是沙棘体内甜菜碱合成过程中的关键性基因,对植物体抗旱起着重要作用。以青海野生中国沙棘的根、茎、叶为试验材料,对沙棘CMO基因及其全长序列进行克隆,并进行生物信息学分析,在此基础上对不同程度干旱胁迫下沙棘不同组织部位CMO基因的时空表达模式进行研究。结果表明,沙棘CMO基因全长1 5 6 6 b p,O R F长1 3 6 4 b p,编码4 5 4个氨基酸,分子量为5 1.4 1 k u,等电点为6.7 8;CMO蛋白亚细胞定位于叶绿体,无信号肽,蛋白二级结构主要为无规则卷曲;CMO蛋白具有多个多种类型的功能位点,为蛋白功能的实现提供了保障;此外CMO蛋白的亲水性较强,无跨膜螺旋区;CMO蛋白三维结构由螺旋、折叠和无规则卷曲互相盘绕而成;时空表达模式研究表明沙棘CMO基因的表达明显受到干旱胁迫的影响,CMO基因的表达量随胁迫时间的延长而整体呈逐步升高的趋势,直至胁迫末期或复水后才有所降低;CMO基因在沙棘不同组织部位中的表达有一定的差异,表达量大小为根叶茎。通过对沙棘CMO基因的研究分析,以期为提高沙棘抗旱性及植物CMO基因的深入研究提供参考意义。关键词:沙棘;干旱胁迫;CMO基因;蛋白质结构中图分类号:S 7 9 3.6 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 1-7 4 6 1(2 0 2 4)0 2-0 0 2 1-0 7S p a t i o t e m p o r a l E x p r e s s i o n P a t t e r n s a n d P r o t e i n S t r u c t u r e P r e d i c t i o n o f S e a b u c k t h o r n CMO G e n e U n d e r D r o u g h t S t r e s sL I U Q i n g-q i n g,MA Y u-h u a*,D O N G J i a-w e i,Y E G u i-s h e n g,Z H A N G D a n,Y A N G K a i-y u(C o l l e g e o f A g r i c u l t u r e a n d A n i m a l H u s b a n d r y,Q i n g h a i U n i v e r s i t y,X i n i n g 8 1 0 0 1 6,Q i n g h a i,C h i n a)A b s t r a c t:CMO g e n e i s a k e y g e n e f o r t h e s y n t h e s i s o f b e t a i n e i n H i p p o p h a e r h a m n o i d e s.I t p l a y s a n i m-p o r t a n t r o l e i n d r o u g h t r e s i s t a n c e o f p l a n t s.T a k e n t h e r o o t s,s t e m s a n d l e a v e s o f w i l d H.r h a m n o i d e s s u b-s p.s i n e n s i s R o u s i o c c u r r i n g i n Q i n g h a i a s t h e e x p e r i m e n t a l m a t e r i a l s,t h e CMO g e n e a n d i t s f u l l-l e n g t h s e-q u e n c e w e r e c l o n e d a n d b i o i n f o r m a t i c s w a s a n a l y z e d,t h e s p a t i o t e m p o r a l e x p r e s s i o n p a t t e r n s o f CMO g e n e s i n d i f f e r e n t t i s s u e p a r t s o f s e a b u c k t h o r n p l a n t u n d e r d i f f e r e n t d e g r e e s o f d r o u g h t s t r e s s w e r e s t u d i e d.T h e r e s u l t s w e r e r e p o r t e d a s f o l l o w s.T h e t o t a l l e n g t h o f CMO g e n e i s 1 5 6 6 b p,t h e O R F l e n g t h i s 1 3 6 4 b p,e n-c o d i n g 4 5 4 a m i n o a c i d s,t h e m o l e c u l a r w e i g h t i s 5 1.4 1 k u,t h e i s o e l e c t r i c p o i n t i s 6.7 8;CMO p r o t e i n s u b-c e l l s a r e l o c a l i z e d i n c h l o r o p l a s t s,n o s i g n a l p e p t i d e s,a n d t h e p r o t e i n s e c o n d a r y s t r u c t u r e i s m a i n l y i r r e g u l a r c u r l i n g;CMO p r o t e i n h a s a n u m b e r o f v a r i o u s t y p e s o f f u n c t i o n a l s i t e s,w h i c h p r o v i d e a g u a r a n t e e f o r t h e r e a l i z a t i o n o f p r o t e i n f u n c t i o n;i n a d d i t i o n,CMO p r o t e i n h a s s t r o n g h y d r o p h i l i c i t y a n d n o t r a n s m e m b r a n e h e l i x r e g i o n;t h e t h r e e-d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f CMO p r o t e i n c o n s i s t s o f h e l i x,s h e e t,a n d r a n d o m c o i l.T h e s p a t i o t e m p o r a l e x p r e s s i o n p a t t e r n s t u d y s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n o f CMO g e n e w a s o b v i o u s l y a f-f e c t e d b y d r o u g h t s t r e s s,a n d t h e e x p r e s s i o n o f CMO g e n e s h o w e d a g r a d u a l i n c r e a s e w i t h t h e e x t e n s i o n o f s t r e s s t i m e,a n d d i d n o t d e c r e a s e u n t i l t h e e n d o f s t r e s s o r a f t e r r e h y d r a t i o n.T h e e x p r e s s i o n o f CMO g e n e i n d i f f e r e n t t i s s u e p a r t s w a s d i f f e r e n t,a n d t h e e x p r e s s i o n s i z e w a s i n t h e o r d e r o f r o o t l e a f s t e m.T h i s s t u d y a n a l y z e s t h e CMO g e n e o f s e a b u c k t h o r n i n o r d e r t o p r o v i d e r e f e r e n c e s i g n i f i c a n c e f o r i m p r o v i n g t h e d r o u g h t r e s i s t a n c e o f H.r h a m n o i d e s a n d t h e i n-d e p t h s t u d y o f p l a n t CMO g e n e.K e y w o r d s:H i p p o p h a e r h a m n o i d e s s u b s p.s i n e n s i s;d r o u g h t s t r e s s;CMO g e n e;p r o t e i n s t r u c t u r e 沙棘(H i p p o p h a e r h a m n o i d e s)能适应高寒、炎热及干旱的环境,具有防风固沙,保持水土的生态功能1-3;其果实具有较高的营养价值和药用价值,是一种具备研究价值和开发价值的植物4-6。沙棘叶片细小且偏厚,使其具有较强的保水能力7;枝条坚硬且表面覆盖有蜡质层,能够抵挡强烈的日光直射,减少气孔水分蒸腾;另有部分小枝条变形成为枝刺,以利于其在不良环境下生长8。然而,沙棘的抗旱性不仅是由于生理形态上的特点决定的,更关键在于其内部物质的调控。因此,有必要对干旱胁迫下沙棘的内部物质调控进行研究。干旱环境下,植物为了应对干旱胁迫,植物细胞质内积累渗透调节剂以调节细胞内的渗透压,减少失水,维持植物体内水分平衡以适应胁迫环境,从而提高自身的抗旱性9。甜菜碱是其中最主要的渗透调节物质之一,在干旱、盐胁迫等逆境中起着重要的作用1 0。甜菜碱的积累能够保持细胞与外界环境的渗透压平衡,具有非常重要的调节功能1 1-1 2,如维持酶的活性、保护细胞内蛋白质、稳定细胞膜,因此能够提高植物对干旱胁迫的适应力1 3-1 4。甜菜碱是由胆碱作为底物的两步催化氧化形成的,即胆碱到甜菜碱醛再到甜菜碱1 5。在高等植物中,催化这两步反应的依次是胆碱单加氧酶(c h o-l i n e m o n o o x y g e n a s e CMO E.C.1.1.3.-)和甜菜碱醛脱氢酶(b e t a i n e a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e,B A DH E.C 1.2.1.8)1 6-1 7。其中,CMO催化的第一步反应是甜 菜 碱 生 物 合 成 的 限 速 步 骤1 8。因 此,提 高CMO基因的表达量,就能促进植物体内甜菜碱含量从而增强其抗旱能力1 9。沙棘具有极强的抗旱性,但目前为止有关沙棘CMO基因的表达模式及其蛋白结构的研究未见报道。研究发现,不同植物的CMO基因在干旱胁迫下诱导甘氨酸甜菜碱积累,从而提高植物抗逆性。如玉米(Z e a m a y s)2 0、西瓜(C i t r u l l u s l a n a t u s)1 7、甘菊(C h r y s a n t h e m u m l a v a n d u l i f o l i u m)2 1。然而也有一些逆境条件下不积累甜菜 碱的植物,如 番 茄(S o l a n u m l y c o p e r s i-c u m)、烟草(N i c o t i a n a t a b a c u m)、水稻(O r y z a s a-t i v a)等2 2,而沙棘在受到逆境胁迫时植物体内是否有甜菜碱的积累,及其CMO基因结构分析和表达模式却未见报道。因此,本研究对沙棘CMO基因及其全长序列进行了克隆,并进行了CMO蛋白的亚细胞定位、二级结构、三级结构等生物信息学分析,在此基础上对干旱胁迫下的沙棘CMO基因时空表达模式进行了研究,明确了CMO基因在沙棘抗旱过程中起到的作用及其随着在时间和空间上的变化规律,为沙棘抗旱机理的阐明及抗旱转基因作物育种提供依据。1 材料与方法1.1 供试材料以青海省西宁市大通县(3 7 1 4 4 5 N,1 0 1 3 0 1 5 E,海拔2 9 2 0 m)采集的中国沙棘(H i p p o p h a e r h a m n o i d e s s u b s p.s i n e n s i s R o u s i)种子为种植材料,播种于2 0 c m(高)2 5 c m(直径)花盆中(泥炭园土珍珠岩=4 03 03 0(体积%)。待沙棘苗长至2 02 5 c m时,选取生长良好且长势均匀的沙棘幼苗,进行干旱胁迫处理,其中一组为对照组(c o n t r o l,C K),另外一组为胁迫组(d r o u g h t s t r e s s,X P),对照组正常浇水,胁迫组停止浇水,在干旱胁迫处理的第0(C K)、2、4、7、1 1、1 5 d的上午采集沙棘的根、茎、叶,在第1 5天采样后对胁迫组进行复水,并于复水1 d后采集根、茎、叶,每个处理3次重复,采集的样品立刻投入液氮中速冻后带回实验室后放置于-8 0 备用。1.2 研究方法1.2.1 沙棘CMO基因的全长克隆 1.2.1.1 总R NA提取与c D NA第一链合成 总R NA的提取依照E A S Y s p i n P l u s植物R NA快速提取试剂盒(R N 3 8)说明书进行。反转录过程按P r i m e S c r i p t 1 s t S t r a n d c D NA S y n t h e s i s K i t试剂盒的说明书进行。1.2.1.2 CMO基 因 核 心 序 列 的 获 得 采 用D NA S T A R对已知植物CMO同源基因进行同源比对分析,根据保守区序列设计沙棘CMO基因的扩 增 引 物(C MO-F:5 -T G C A A T T G G A A G G T T T-T C T G Y G A Y A A Y T A-3,C MO-R:5 -G A T G C A G C-C A G C A A T G R A A R T G R T G N A-3),扩增CMO基因核心序列。P C R反应体系:模板c D NA 2 L,1 0P C R b u f f e r 5 L,M g C L2 3 L,d NT P 4 L,CMO-F 2 L,CMO-R 2 L,T a q 0.5 L,R N a s e-F r e e d d H2O 3 1.5 L。P C R反 应 条 件:9 4 5 m i n;9 4 1 m i n、6 0 1 m i n、7 2 1 m i n,3 5个循环;22西北林学院学报3 9卷 最后7 2 延伸1 0 m i n。1.2.1.3 CMO-3 端R A C E扩增 根据CMO核心片段序列设计3 端特异性引物P 1和P 2(P 1(外侧):5 -C AT GAT T AAT AG G T AT G G T C C AT G-GAT G-3;P 2(内 侧):5 -C T T GAAG C T G C T C T-T AAG GAT GA C AAAG-3),与 接 头 引 物T 1(5 -C G C G GAT C C A C T AG T GAT T T C A C T AT AG G-3)进行巢式P C R扩增3 -端内侧。外侧P C R反应条件:9 5 5 m i n;9 5 4 0 s、6 0 3 0 s、7 2 9 0 s,3 5个循环;7 2 1 0 m i n。巢式P C R反应条件:9 5 5 m i n;9 5 4 0 s、6 0 3 0 s、7 2 9 0 s,9 5 5 m i n;9 5 4 0 s,6 0 3 0 s,7 2 9 0 s,2 0个循环;7 2 1 0 m i n。1.2.1.4 CMO-5 端R A C E扩增 根据测序所得到的CMO核心片段序列,设计5 -端特异性引物P 3和P 4(P 3(外 侧):5 -A T C A T T G T A G A G T A G G A A T-C A A G C T T G A G A C-3;P 4(内侧):5 -G A G A C C C G A-T G C A A G G C C C T T A T-3),分 别与接头引 物T 2和T 3(5 -G G C C A C G C G T C G A C T A G T A C C C C C C C C C C-C C C C C-3 和5 -G G C C A C G C G T C G A C T A G T-3)进行巢式P C R扩增5 -端。外侧P C R反应条件:9 5 5 m i n;9 5 4 0 s、6 0 3 0 s、7 2 9 0 s,3 5个循环;7 2 1 0 m i n。巢式P C R反应条件:9 5 5 m i n;9 5 4 0 s、6 0 3 0 s、7 2 9 0 s,2 0个循环;7 2 1 0 m i n。1.2.2 序列测定及分析 将沙棘CMO基因核心片段,3 端和5 端P C R扩增回收产物送上海生工测序。D NA S T A R软件进行序列分析并预测蛋白的二级结构和亲水性,TMHMM进行蛋白跨膜螺旋区分析,P r e d i c t p r o t e i n进行细胞定位及蛋白修饰位点分析,I-T A S S E R在线服务器预测蛋白的三级结构,S i g n a l P 4.1对沙棘CMO蛋白是否存在信号肽进行预测,K y t e-D o o l i t t l e方法预测CMO蛋白亲水性分析。1.2.3 CMO基因的表达研究 根据沙棘CMO基因序列设计荧光定量P C R扩增引物CMO-D L-F和CMO-D L-R(CMO-D L-F:5 -C T AAAG G C AA C T-C GAAT AA C AG GAA-3,CMO-D L-R:5 -AGAA-GAA C AAAT G GA C C C C AAG-3),以-a c t i n(-a c-t i n-D L-F:5 -G G T C C T C T T C C AA C C AT C T C T C-3,-a c t i n-D L-R:5 -C T G T GAT C T C T T T G C T-C AT C C T G T-3)为内参进行沙棘CMO基因在不同程度干旱胁迫下的不同组织部位表达情况研究。P C R扩增参数为:9 5 3 0 s;9 5 5 s,5 5 3 0 s,7 2 3 0 s,3 5个循环;7 2 5 m i n。根据K.J.L i-v a k等2 3 的方法来计算基因的相对表达量。2 结果与分析2.1 沙棘CMO基因的序列分析将提取的沙棘总R NA经反转录合成c D NA后进行P C R扩增,所得CMO基因核心序列扩增的电泳鉴定结果见图1。对照M a r k e r条带比较分析,图1中的扩增产物条带大小约为5 0 0 b p,符合预期目的片段的大小。序列测定结果显示所得CMO基因核心区的核苷酸序列长度为4 9 6 b p。根据沙棘核心区序列和3 端接头序列设计引物进行巢式P C R获得沙棘CMO基因的3 端,并进行序列测定,得到1段长3 8 7 b p的片段(图2);根据沙棘核心区序列和5 端接头序列设计引物进行巢式P C R获得沙棘CMO基因的5 端,并进行序列测定,得到1段长9 1 3 b p的片段(图3)图1 CMO基因核心序列F i g.1 T h e p a r t f r a g m e n t o f CMO g e n e图2 CMO基因3 端F i g.2 3 e n d o f CMO g e n e2.2 沙棘CMO基因生物信息学分析2.2.1 沙棘CMO基因的全长c D NA的特征 沙棘CMO基因全长1 5 6 6 b p,O R F长1 3 6 4 b p,编码4 5 4个氨基酸。3 非翻译区(3 UT R)长1 8 0 b p,5 非翻 译 区(5 UT R)长2 1 b p。推 测 分 子 量 为5 1.4 1 k u,等电点为6.7 8。2.2.2 CMO蛋白亚细胞定位 沙棘CMO蛋白用p r e d i c t p r o t e i n进行蛋白的亚细胞定位,预测结果(图4)可见沙棘CMO蛋白亚细胞定位于叶绿体中。2.2.3 CMO蛋白结构预测 预测的二级结构结32第2期刘青青 等:干旱胁迫下沙棘CMO基因的时空表达模式与蛋白结构预测图3 CMO基因5 端F i g.3 5 e n d o f CMO g e n e果显 示 沙 棘C蛋 白 二 级 结 构 主 要 为螺 旋 占1 7.1 8%,折 叠 占2 2.0 3%,无 规 则 卷 曲 占6 0.7 9%。可见,无规则卷曲是沙棘CMO蛋白二级结构的主要构成元件。在蛋白质二级结构的基础图4 沙棘CMO蛋白亚细胞定位F i g.4 P r o t e i n s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f CMO p r o t e i n上,采用I-T A S S E R在线软件对沙棘CMO蛋白进行蛋白质三维结构的预测(图5)。预测结果显示,5个得分最高的CMO蛋白三维结构均主要由螺旋、折叠和无规则卷曲互相盘绕而成。其中模型1的C-s c o r e到了-2.1 2,说明所建模型可信度较高。同时,TMHMM预测中国沙棘CMO基因跨膜区结果显示,CMO蛋白不含跨膜螺旋的结构。图5 沙棘CMO蛋白三维结构的预测F i g.5 P r e d i c t e d 3 D s t r u c t u r e o f CMO p r o t e i n 对CMO进行功能位点预测的结果表明,CMO具有8个蛋白激酶C磷酸化位点,分别为35位的T R R,2 93 1位的S N R,4 54 7位的T T K,7 27 4位的T F K,1 4 91 5 1位 的T G R,2 4 12 4 3位 的T KK,4 0 14 0 3位的S L K,4 5 14 5 3位的S L K;4个酪蛋白激酶磷酸化位点,分别为2 1 92 2 2位的S VN D,2 4 12 4 4位 的T KK E,2 5 92 6 2位 的S S S E,4 0 14 0 4位的S L K D;2个络氨酸激酶磷酸化位点,分别为3 4 33 4 9位的R L G S E A L Y,4 2 14 2 7位的R G L E S P AY;7个N-端豆蔻酰化位点,分别为1 6 51 7 0位的GNVHA F,1 7 81 8 3位的G S-V L A C,1 8 61 9 1位 的GQK S C F,2 0 12 0 6位 的G L D GA L,2 6 82 7 3位的GV D S S L,3 0 73 1 2位的G L A S G L,4 1 83 1 2位的GVQ R G L。K y t e-D o o l i t t l e方法预测蛋白亲水性结果显示(图6),CMO蛋白的疏水性较弱,分布区域较少,而其亲水性较强,具有多个连续亲水区域。S i g n a l P 4.1对沙棘CMO蛋白测试结果如图7所示。x轴为氨基酸,y轴为C值计分(s c o r e),其表示信号肽剪切点的记分,图7中用红色显示;S-s c o r e表示信号肽记分,用绿色显示,最高记分点所对应氨基酸位于信号肽部位;Y-s c o r e是C值和S值的综合记分值,用蓝色显示,Y-m a x通常被视为最理 想 的 剪 切 位 点。通 过 上 述 数 据 推 测,沙 棘CMO蛋白无信号肽,属于非分泌蛋白,该蛋白不含信号肽。图6 沙棘CMO蛋白亲水性分析F i g.6 H y d r o p h i l i c i t y p l o t o f CMO p r o t e i n2.3 沙棘CMO基因的表达模式分析分别以 对 照 和 干 旱 胁 迫 处 理2 d(d s 1)、4 d(d s 2)、7 d(d s 3)、1 1 d(d s 4)、1 5 d(d s 5)及复水2 4 h后(f s)的沙棘根、茎、叶c D NA为模板进行R e-a l-T i m e P C R,以对照各组织部位CMO基因的表达量为1,研究根、茎、叶CMO基因的表达情况,结果42西北林学院学报3 9卷 分别见图8-图1 0。2.3.1 沙棘根中CMO基因的表达分析 由图8可见在沙棘根中,胁迫前1 1 d CMO基因的表达量随着胁迫程度的加剧而逐渐上升,在第1 1天达到最大值,是对照的9.5 5倍,而在胁迫第1 5天相对第1 1天表达量急剧降低,是对照的5.0 8倍,复水后沙棘根中CMO基因的表达量迅速下降,但仍高于对照,是对照的1.9 3倍。图7 沙棘CMO蛋白信号肽预测F i g.7 S i g n a l p e p t i d e p r e d i c t i o n o f CMO p r o t e i n图8 不同干旱胁迫下沙棘根中CMO基因的表达情况F i g.8 E x p r e s s i o n o f CMO g e n e i n r o o t o f H.r h a m n o i d e s u n d e r d r o u g h t s t r e s s2.3.2 沙棘茎中CMO基因的表达分析 由图9可见,沙棘茎中CMO基因的表达在胁迫第2天相对对照略有降低,随后持续增加,但在第1 1天以前均低于对照的表达量,CMO基因的表达量在胁迫第1 5天达到最大值,是对照的3.2 1倍;复水后表达量降低(1.9 1),但仍高于对照组的表达量。2.3.3 沙棘叶中C MO基因的表达分析 C MO基因在沙棘叶中的表达情况见图1 0。由图1 0可见,在干旱胁迫初期,沙棘叶中的C MO基因的表达量变化不大,随着干旱胁迫的逐步增强,C MO基因的表达量急剧增加,在胁迫第1 1天达到最大值(3.4 8);胁迫1 5 d时表达量又降低(1.9 6);复水后表达量相对胁迫最后一天略有增加,为对照的2.8 6倍。2.3.4 沙棘CMO基因的表达分析 CMO基因在整个沙棘植株中的表达情况见图1 1。由图1 1 A可见,除在干旱胁迫第2天的CMO基因表达量低于对照组,其余处理均高于对照水平。同时随着干旱胁迫的增强,CMO基因的表达量呈现出先升高后降低的趋势,在胁迫第1 1天达到最大值(1 4.8 3);胁迫1 5 d时表达量又降低(1 0.2 5);复水后表达量有所降低,但比对照组高。由图1 1 B可见,不同处理下,沙棘根的CMO基因表达量总和最高(2 6.1 5),茎次 之(1 0.3 1),叶 最 低(1 3.0 0)。说 明 沙 棘 的CMO基因在根中的表达水平高,在叶中的表达水平最低。图9 不同干旱胁迫下沙棘茎中CMO基因的表达情况F i g.9 E x p r e s s i o n o f CMO g e n e i n s t e m o f H.r h a m n o i d e s u n d e r d i f f e r e n t d r o u g h t s t r e s s图1 0 不同干旱胁迫下沙棘叶中CMO基因的表达情况F i g.1 0 E x p r e s s i o n o f C MO g e n e i n l e a v e o f H.r h a m n o i d e s u n d e r d i f f e r e n t d r o u g h t s t r e s s3 结论与讨论本研究通过对中国沙棘CMO蛋白的研究,发现中国沙棘CMO蛋白定位于叶绿体中,二级结构预测显示无规则卷曲为中国沙棘CMO蛋白二级结构的主要构成元件,三维结构均主要由螺旋、折叠和无规则卷曲互相盘绕而成。N u c c i o等2 4发现菠菜(S p i n a c i a o l e r a c e a)CMO基因表达产物定位于叶绿体基质中,与本研究结论一致。同时发现,中国沙棘 的CMO基 因 与 马 玉 花 等2 5得 出 的 梭 梭(H a l o x y l o n a mm o d e n d r o n)CMO基因大小及蛋白结构相似。而徐晟等2 6通过对石蒜(L y c o r i s r a d i-a t a)的研究发现,石蒜 CMO的氨基酸序列与海枣(P h o e n i x d a c t y l i f e r a)、香蕉(M u s a p a r a d i s i a c a)等植物CMO氨基酸序列的一致性在7 0%以上。与本研究结论一致。表明 CMO基因编码的氨基酸与52第2期刘青青 等:干旱胁迫下沙棘CMO基因的时空表达模式与蛋白结构预测图1 1 不同干旱胁迫下沙棘叶中CMO基因的表达情况F i g.1 1 E x p r e s s i o n o f CMO g e n e i n H.r h a m n o i d e s l e a v e s u n d e r d i f f e r e n t d r o u g h t s t r e s s e s其他植物CMO蛋白具有较高的一致性,CMO基因具有较高的保守性。蛋白质的磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后的修饰方式。一般来说,多肽链中的氨基酸潜在的磷酸化位点越多,发挥更多功能的可能性就越大2 7。本研究中,功能位点预测显示中国沙棘的CMO包含8个蛋白激酶C磷酸化位点、4个酪蛋白激酶磷酸化位点、2个络氨酸激酶磷酸化位点及7个N-端豆蔻酰化位点,可以看出C磷酸化在该蛋白中占主导地位,推测C磷酸化可能在CMO蛋白行使功能的过程中发挥重要作用。庞宁宁等2 8对能有 效 应 对 自 然 胁 迫 的 黄 瓜(C u c u m i s s a t i v u s)P P 2-A 1蛋白进行研究时,也发现P P 2-A 1蛋白有4个丝氨酸位点、4个苏氨酸位点、1 个酪氨酸位点,说明磷酸化位点可能与应对胁迫相关的基因、蛋白有关。这些磷酸化位点为今后基因表达调控、蛋白修饰提供了参考位点。此外中国沙棘CMO基因还包括了7个N-端豆蔻酰化位点。相关研究发现豆蔻酰化蛋白是调节细胞生长发育、参与信号传导、肿瘤发生和病毒 复制组装 等过程 的 重 要 功 能 性 蛋白 2 9,一些蛋白的生物学活性极大程度地依赖于其N-端豆蔻酰化3 0,所以植物信号传导可能与豆蔻酰化与蛋白息息相关,这些位点为CMO执行催化功能合成甜菜碱醛提供了活化位点及催化位点。中国农业大学杨淑华揭示的蛋白激酶O S T 1被低温激活的分子机制,也表明豆蔻酰开关可能参与了植物对低温信号的感知与转导3 1。由此可见,中国沙棘的CMO基因与其抵御外界胁迫息息相关。不同干旱胁迫程度下沙棘CMO基因的表达情况研究结果表明,沙棘CMO基因表达量随处理时间的延长,基本呈逐渐增长的趋势,直至胁迫末期或者复水 后才有所降 低,接近正常 水平的对 照组。R u s s e l l3 2发现甜菜(B e t a v u l g a r i s)受到干旱胁迫时,CMO基因的转录水平性提高了5倍,当恢复正常生长条件时,CMO基因的表达量也随之降低到原来的水平。本研究中,随着胁迫时间的增加,根茎叶中的CMO基因的表达量均有增加,与R u s s e l l的试验结果一致。佟少明等3 3对辽宁碱蓬(S u a e d a l i a o t u n g e n s i s)S I CMO研究时也表明根是植物感受土壤环境的第一器官,并发现CMO对盐胁迫的最早响应在根中,与本研究中首先增加的是根中的CMO表达量结果一致。出现这种现象可能是由于此时根中已经做出应答反应,而茎和叶还未能及时做出反应。而随着胁迫的逐步增强,根系已经无法提供足量的水分,叶片中的水分逐渐丧失,因此到后期,叶片的CMO基因表达量剧增维持叶部原有水分,这与吕笑言等3 4对甜菜CMO基因在盐胁迫下的表达的研究相同。本研究中胁迫后期CMO的表达量又回落到之前的状态。可能是由于此时沙棘已处于极度失水状态,能量AT P及相关物质的合成均无法满足后续的高表达量。而复水初期叶片仍处于失水状态,同时能量AT P等物质的合成也随着水分的提供增加,因此CMO的表达量较复水前仍有所增加。根、茎、叶中基因的表达特征说明不同组织中沙棘CMO基因表达存在差异,这可能与沙棘所处的生长环境与生理期有关。本研究通过对青海旱生中国沙棘CMO基因的克隆、序列分析及结构预测,在此基础上对干旱胁迫下的沙棘CMO基因时空表达模式进行了研究。将为沙棘CMO基因的表达特性研究奠定基础,并为沙棘抗逆分子机制的阐明提供依据。参考文献:1 C AO Z,L I T,L I G,e t a l.M o d u l a r g r o w t h a n d c l o n a l p r o p a g a-t i o n o f H i p p o p h a e r h a m n o i d e s s u b s p.s i n e n s i s i n r e s p o n s e t o i r r i g a t i o n i n t e n s i t yJ.J o u r n a l o f F o r e s t r y R e s e a r c h,2 0 1 6,2 7(5):1 0 1 9-1 0 2 8.2 胡杜娟,胡建忠,魏学智.不同沙棘品种的抗旱性比较J.北方园艺,2 0 1 7,(7):2 7-3 0.3 樊梦颖,张明明,张情,等.不同月份沙棘根瘤细菌群落结构特征的分析对比J.西北林学院学报,2 0 2 0,3 5(6):1 6 0-1 6 7.F A N M Y,Z HA N G M M,Z HA N G Q,e t a l.A n a l y s i s