细菌内毒素与热原检查法.ppt

细菌内毒素与热原检查法基基础础知知识识热原：注入人体后可引热原：注入人体后可引起发热反应的物质。起发热反应的物质。1 材料的致热性。材料的致热性。2 因微生物污染造成的热原反应。因微生物污染造成的热原反应。热原的检查方法l体内热原检查法兔温法（PT)l是一种体内的、全热原的检查方法。1942年USP12版第一次收载。各国药典至今仍在使用。l体外热原检查法（ITP)l是一种体外的利用人血细胞反应的全热原检查法。尚未有药典收载，欧洲药典将会收载。l细菌内毒素检查法（BET)l医药工业普遍接受控制内毒素等于控制热原。热原分类按检查法分l内毒素热原l革兰氏阴性细菌细胞壁的组分l非内毒素热原l除内毒素外的热原热原检查法（家兔法）可用于检测热原检查法（家兔法）可用于检测上述两种原因产生的热原反应。上述两种原因产生的热原反应。细菌内毒素检查法只检测产品的细细菌内毒素检查法只检测产品的细菌内毒素含量。菌内毒素含量。试验验证未发现输液器材料的致热试验验证未发现输液器材料的致热性，临床发生的热原反应均为细菌内毒性，临床发生的热原反应均为细菌内毒素污染造成的。因此对输液器成品可采素污染造成的。因此对输液器成品可采用细菌内毒素检查法进行热原初试。用细菌内毒素检查法进行热原初试。热原通常是指能够致热的微生物的尸热原通常是指能够致热的微生物的尸体及代谢产物，主要是细菌的内毒素。体及代谢产物，主要是细菌的内毒素。细菌内毒素：主要存在于革兰氏阴性细菌内毒素：主要存在于革兰氏阴性细菌的细胞壁内，菌体裂解时释放出来。细菌的细胞壁内，菌体裂解时释放出来。是磷脂，脂多糖和蛋白质组成的复合物，是磷脂，脂多糖和蛋白质组成的复合物，复合物中的脂多糖是内毒素的主要成分，复合物中的脂多糖是内毒素的主要成分，具有特别强的热原活性。具有特别强的热原活性。热原的致热机理：细菌内毒素，热原的致热机理：细菌内毒素，病毒，细菌及其他微生物，类固醇或病毒，细菌及其他微生物，类固醇或某些材料释放热原质，作用于动物体某些材料释放热原质，作用于动物体单核细胞，巨噬细胞等靶细胞后，促单核细胞，巨噬细胞等靶细胞后，促使其产生内生性热原，作用于下丘脑使其产生内生性热原，作用于下丘脑体温调节中枢，结果使动物体温升高。体温调节中枢，结果使动物体温升高。热原反应给临床治疗带来极大的危害，热原反应给临床治疗带来极大的危害，一般热原进入人体后数分钟至一般热原进入人体后数分钟至1小时内，即小时内，即会出现高热症状，反应严重者会造成死亡，会出现高热症状，反应严重者会造成死亡，故必须严格控制。故必须严格控制。细菌内毒素的理化性质细菌内毒素的理化性质1 耐热性：耐热性：180200摄氏度摄氏度2小时干热可小时干热可完全破坏。（药典为完全破坏。（药典为250摄氏度至少摄氏度至少1小时。）小时。）2 滤过性：体积极小，可通过普通滤器。滤过性：体积极小，可通过普通滤器。3 水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水冲洗以除去热原。冲洗以除去热原。4 不挥发性不挥发性5 被吸附性：可被树脂等吸附除去。被吸附性：可被树脂等吸附除去。6 被酸碱破坏被酸碱破坏7 被氧化剂破坏：被氧化剂破坏：30%双氧水浸泡双氧水浸泡4小时，小时，可完全破坏。可完全破坏。细菌内毒素生物活性l致热性l致死性l引起血液白细胞中的粒细胞下降l激活凝血系统l血压下降l诱导机体对内毒素的耐受l引起淋巴细胞的有丝分裂l诱导抗感染的非特异性l杀死肿瘤细胞l及鲎试剂反应细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法概述：概述：1968年发现并创造了鲎试验，至今年发现并创造了鲎试验，至今仍是国际上通用检测细菌内毒素的最简便有效仍是国际上通用检测细菌内毒素的最简便有效的方法，其优点在于：的方法，其优点在于：1 科学性：有生物化学的理论基础。科学性：有生物化学的理论基础。2 准确性：是酶的分子生化反应，专属性准确性：是酶的分子生化反应，专属性高，重现性强。高，重现性强。3 灵敏性：鲎试剂和细菌内毒素的反应灵灵敏性：鲎试剂和细菌内毒素的反应灵敏度极高，敏度极高，当内毒素量低到当内毒素量低到10-10g/ml浓度，它们浓度，它们都能起凝胶反应，至今未发现一种物质对都能起凝胶反应，至今未发现一种物质对鲎试剂的反应比细菌内毒素更灵敏。鲎试剂的反应比细菌内毒素更灵敏。4 实用性：方法快速，操作简单，无实用性：方法快速，操作简单，无需特殊仪器设备，经济实用。需特殊仪器设备，经济实用。由于细菌内毒素检查法的优越性，已由于细菌内毒素检查法的优越性，已被广泛应用于临床检验。被广泛应用于临床检验。实验目的：实验目的：据鲎试剂及细菌内毒素产生凝集据鲎试剂及细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断医疗器械或其浸反应的机理，以判断医疗器械或其浸提液中细菌内毒素的限量是否符合规提液中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，医疗器械定的一种方法，医疗器械/材料须经热材料须经热原实验评价证实无材料致热性，同时原实验评价证实无材料致热性，同时经测定证实样品对细菌内毒素试验无经测定证实样品对细菌内毒素试验无干扰作用后，才能采用该方法。干扰作用后，才能采用该方法。实验原理细菌内毒素在钙离子，镁离子参及细菌内毒素在钙离子，镁离子参及下，激活鲎试剂中下，激活鲎试剂中c因子，活化的因子，活化的c因子因子激活激活b因子，活化的因子，活化的b因子激活凝固酶原因子激活凝固酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成凝固生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成凝固蛋白，在支联酶作用下形成凝胶。蛋白，在支联酶作用下形成凝胶。内毒素内毒素C因子因子活化活化c因子因子B因子因子活化活化b因子因子凝固酶元凝固酶元凝固酶凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白原凝固蛋白凝固蛋白凝胶凝胶某些非热原物某些非热原物质质G因子因子活化活化g因子因子实验试剂：实验试剂：鲎试剂：是从栖生于海洋的无脊椎动物鲎试剂：是从栖生于海洋的无脊椎动物“鲎鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而成的生物制剂。鲎试剂低温冷冻干燥精制而成的生物制剂。鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示。效浓度表示。鲎试剂的灵敏度是用细菌内毒素来标定的，鲎试剂的灵敏度是用细菌内毒素来标定的，因此标定鲎试剂灵敏度所用的细菌内毒素必因此标定鲎试剂灵敏度所用的细菌内毒素必须是统一且标准的。须是统一且标准的。实实验验试试剂剂l细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制得到的内毒素，单位：提取精制得到的内毒素，单位：EU.l用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。仲裁鲎试剂灵敏度。l细菌内毒素工作标准品：以细菌内毒素细菌内毒素工作标准品：以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定其效国家标准品为基准进行标定，确定其效价。具备均一性和稳定性。价。具备均一性和稳定性。细菌内毒素检查用水：细菌内毒素检查用水：指及灵敏度为指及灵敏度为0.03EU/ML或更高灵敏度或更高灵敏度的鲎试剂在的鲎试剂在371条件下条件下24小时不产生小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。凝集反应的灭菌注射用水。实验用具 移移液液管管（或或刻刻度度吸吸管管，定定量量移移液液器器）、凝凝集集管管（1075mm1075mm）、三三角角瓶瓶、小小试试管管（16100mm16100mm）、试试管管架架、洗洗耳耳球球、封封口口膜膜或或金金属属试试管管帽帽、时时钟钟、脱脱脂脂棉棉、吸吸水水纸纸、剪剪刀刀砂砂轮轮。所所有有玻玻璃璃器器皿皿须须经经180180干干烤烤至至少少2 2小小时时。塑塑料料用用具具应应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。使用其它适宜的除细菌内毒素方法。试剂 l75%75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。操作方法 l试验准备试验准备l洗洗液液的的配配备备配配制制铬铬酸酸洗洗液液或或其其他他适适宜宜的细菌内毒素灭活剂。的细菌内毒素灭活剂。l玻玻璃璃器器皿皿的的洗洗涤涤将将洗洗涤涤的的玻玻璃璃器器皿皿用用洗洗涤涤剂剂和和自自来来水水洗洗净净并并空空干干水水分分后后置置洗洗液液中中浸浸泡泡4 4小小时时，取取出出，用用自自来来水水将将残残余余的的洗洗液液洗洗净净，再再用用新新鲜鲜蒸蒸馏馏水水冲冲洗洗干干燥燥后置适宜的密闭金属容器中，置烤箱。后置适宜的密闭金属容器中，置烤箱。除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素，玻璃器皿置箱后将烤箱调至180，待烤箱温度升到设定的温度后开始记时，须干烤至少2小时。达到时间后，关断电源。待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可两周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。塑料制品清洗干净后在30双氧水中浸泡4 h，再用无热原水充分冲洗后在60烘箱中烘干备用。鲎试剂灵敏度复核 l内毒素标准溶液的制备内毒素标准溶液的制备l取取NSENSE或或WSEWSE一一支支，轻轻弹弹瓶瓶壁壁，使使粉粉末末落落入入瓶瓶底底，再再用用砂砂轮轮在在瓶瓶颈颈上上部部轻轻轻轻划划痕痕，75%75%酒酒精精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。l按按标标准准品品使使用用说说明明书书用用移移液液管管加加入入规规定定量量的的BETBET水水溶溶解解其其内内容容物物，用用封封口口膜膜将将瓶瓶口口封封严严。置置旋旋涡涡混混合合器器上上混混合合1515分分钟钟，然然后后制制备备成成所所需需浓浓度度的的细细菌菌内内毒毒素素标标准准溶溶液液即即2.02.0、1.0 1.0,0.5,0.5,0.250.25（为为所所复复核核鲎鲎试试剂剂的的标标示示灵灵敏敏度度），每每稀稀释释一一步步均均应应在在旋旋涡涡混混合合器器上上混合混合3030秒（详细过程请参见使用说明书）。秒（详细过程请参见使用说明书）。示例l例例如如使使用用NSE(NSE(内内毒毒素素含含量量为为9000EU/9000EU/支支)时时的的方方法如下：法如下：l溶溶解解：准准确确吸吸取取BETBET水水1ml1ml加加入入NSENSE的的安安瓿瓿内内，用用封封口口膜膜将将瓶瓶口口封封严严，置置旋旋涡涡混混合合器器混混合合1515分钟，即为分钟，即为9000EU/ml9000EU/ml内毒素标准溶液。内毒素标准溶液。l稀稀释释：取取0.3ml0.3ml内内毒毒素素标标准准溶溶液液加加上上2.7ml 2.7ml BETBET水水即即为为110110稀稀释释液液，得得到到900EU/ml900EU/ml内内毒毒素素标标准溶液。准溶液。取取0.3mL 1100.3mL 110稀释液，加上稀释液，加上2.7mL 2.7mL BETBET水即为水即为11001100稀释液，得到稀释液，得到90EU/ml90EU/ml内毒素标准溶液。往后依次类推。也可内毒素标准溶液。往后依次类推。也可写成下列格式：写成下列格式：l9000EU/ml 900EU/ml 90EU/ml 9EU/ml 1EU/ml 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.0625EU/mll在上述稀释过程中，每稀释一步，均须旋涡混合器上混合30秒钟。0.3ml2.7ml2.4ml0.3ml1ml1ml待复核鲎试剂的准备 l在在制制备备内内毒毒素素标标准准溶溶液液的的同同时时，取取0.1ml/0.1ml/支支的的鲎鲎试试剂剂1818支支轻轻弹弹瓶瓶壁壁，使使粉粉末末落落入入瓶瓶底底。用用砂砂轮轮在在瓶瓶颈颈处处轻轻轻轻划划痕痕，75%75%乙乙醇醇棉棉球球擦擦拭拭后后启启开开备备用用，加加入入0.1mlBET0.1mlBET水水，使使鲎鲎试试剂剂充充分分溶溶解解，避避免免产生气泡。产生气泡。l若若待待复复核核鲎鲎试试剂剂的的规规格格不不是是0.1ml/0.1ml/支支时时，按按标标示示量量加加入入BETBET水水溶溶解解，将将溶溶解解后后的的鲎鲎试试剂剂溶溶液液混混匀匀后后每每0.1ml0.1ml分分配配到到1075mm1075mm凝凝聚聚管管中中，要要求求至至少分配少分配1818管备用。管备用。加样将将已已充充分分溶溶解解的的待待复复核核鲎鲎试试剂剂1818支支(管管)放放在在试试管管架架上上，排排成成5 5列列，其其中中4 4支支(管管)4)4列列分分别别加加入入2.02.0、1.01.0、0.50.5、0.250.25的的内内毒毒素素标标准准溶溶液液；2 2支支(管管)1)1列列分分别别加加入入 BETBET水水，作作为为阴阴性性对对照照。内内毒毒素素标标准准溶溶液液和和BETBET水加样量均为水加样量均为0.1ml/0.1ml/支。支。加样结束后，用封口膜封加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入连同试管架放入3737摄氏度水浴摄氏度水浴中，试管架保持水平状态，保中，试管架保持水平状态，保温温602602分钟分钟.结果判定：结果判定：将将试试管管从从水水浴浴中中轻轻轻轻取取出出，缓缓缓缓倒倒转转180180时时，管管内内凝凝胶胶不不变变形形，不不从从管管壁壁滑滑脱脱者者为为阳阳性性，记记录录为为（）；凝凝胶胶不不能能保保持持完完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（）。整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（）。鲎试剂灵敏度复核如最大如最大2.02.0浓度管均为阳性，最低浓度浓度管均为阳性，最低浓度0.2540.254管均为阴性，阴性对照为阴性，管均为阴性，阴性对照为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（c）。clg-1(X/4)式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后四个呈阳性的结果浓度。结果记录举例计算举例计算lX=2.10721l=lg-1(-2.10721/4)=0.297l测定值在标示值的测定值在标示值的50%200%之之间，所标示灵敏度可被确认，此批间，所标示灵敏度可被确认，此批鲎试剂可用于供试品的细菌内毒素鲎试剂可用于供试品的细菌内毒素检查。检查。l内毒素限值的确定内毒素限值的确定l一次性使用输液器内毒素限值为一次性使用输液器内毒素限值为20EU/套套（GB/T14233.2-2005)供试品细菌内毒素的检查 供试品细菌内毒素的检查 l供试品溶液的制备供试品溶液的制备l每每批批输输液液器器取取3套套，管管内内腔腔注注入入细细菌菌内内毒毒素素检检查查用用水水10mL，反反复复荡荡洗洗5次次后后，两两端端封封闭闭，置置37 下下 2h，将将腔腔内内的的液液体体倒倒入一无菌无热原玻璃容入一无菌无热原玻璃容 器内。器内。l举例：所用鲎试剂标示灵敏度为举例：所用鲎试剂标示灵敏度为0.25EU/ml,则阳性对照溶液的细菌内毒素则阳性对照溶液的细菌内毒素浓度为浓度为0.5EU/ml.l阳性对照溶液的制备用细菌内毒素检阳性对照溶液的制备用细菌内毒素检查用水制成查用水制成2浓度的细菌内毒素溶液。浓度的细菌内毒素溶液。试剂制备l鲎试剂制备鲎试剂制备l在在制制备备供供试试品品溶溶液液、内内毒毒素素标标准准溶溶液液的的同同时时，取取0.1ml/支支的的鲎鲎试试剂剂6支支，手手指指轻轻弹弹瓶瓶壁壁，使使颈颈部部瓶瓶壁壁上上的的粉粉末末落落入入瓶瓶内内，用用砂砂轮轮在在瓶瓶颈颈轻轻轻轻划划痕痕，75%乙乙醇醇棉棉球球擦擦拭拭后后启启开开备备用用，防防止止玻玻璃璃屑屑落落入入瓶瓶内内，加加入入0.1ml/支支水水溶溶解解，轻轻轻轻转转动动瓶瓶壁壁，使使内容物充分溶解，避免产生气泡。内容物充分溶解，避免产生气泡。l若若使使用用的的鲎鲎试试剂剂的的规规格格不不是是0.1ml/支支时时，按按标标示示量量加加入入BET水水复复溶溶，将将溶溶解解后后的的鲎鲎试试剂剂液液混混匀匀后后每每0.1ml分分配配到到1075m m凝集管中，要求至少分配凝集管中，要求至少分配6管备用。管备用。供试液的稀释l使用鲎试剂的灵敏度标示值小于供试品使用鲎试剂的灵敏度标示值小于供试品的细菌内毒素限量时，用检查用水将供的细菌内毒素限量时，用检查用水将供试液稀释后进行试验，公式如下：试液稀释后进行试验，公式如下：l供试液稀释倍数供试液稀释倍数=X/=X/lXX供试品的细菌内毒素限量供试品的细菌内毒素限量l使用鲎试剂的灵敏度标示值使用鲎试剂的灵敏度标示值加样 l取装有取装有0.1ml鲎试剂溶液的鲎试剂溶液的1075mm试管或复试管或复溶后的溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿支规格的鲎试剂原安瓿8支。支。l2支加入支加入0.1ml按最大有效稀释倍数稀释的供试按最大有效稀释倍数稀释的供试品溶液作为供试品试管。品溶液作为供试品试管。l 2支加入支加入0.1ml 2浓度的内毒素溶液作为阳性对浓度的内毒素溶液作为阳性对照。照。l2支加入支加入0.1ml BET水作为阴性对照。水作为阴性对照。l2支加入支加入0.1ml 含含2浓度的内毒素的供试品溶液浓度的内毒素的供试品溶液作为供试品阳性对照作为供试品阳性对照加样注：注：A为供试品溶液；为供试品溶液；B为供试品阳性为供试品阳性对照；对照；C为阳性对照；为阳性对照；D为阴性对照为阴性对照l将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入闭管口，垂直放入371水浴或适宜恒水浴或适宜恒温器中，试管保持水平状态保温温器中，试管保持水平状态保温602分分钟。保温和拿取试管过程应避免震动。钟。保温和拿取试管过程应避免震动。结果判断l将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转180时，管内凝胶不变形，不从管壁滑时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（）；凝胶不能脱者为阳性，记录为（）；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（）。为（）。结果判定l阳性对照阳性对照2管应均为（），管应均为（），l供试品阳性对照供试品阳性对照2管应均为（），管应均为（），l阴性对照阴性对照2管应均为（）。管应均为（）。l否则实验无效。否则实验无效。结果判定l供试品供试品2管均为管均为(),判定该批产品符合本法判定该批产品符合本法规定。规定。l供试品供试品2管均为（），则判定该批产品不符管均为（），则判定该批产品不符合本法规定，或再进行热原检查法试验。合本法规定，或再进行热原检查法试验。l如只有一管为阳性则按上述方法另取四支供如只有一管为阳性则按上述方法另取四支供试品管复试，四支中有一支为阳性则不符合试品管复试，四支中有一支为阳性则不符合规定，或再进行热原检查法试验。规定，或再进行热原检查法试验。医学资料仅供参考,用药方面谨遵医嘱