含铀凋落物腐解前后微生物群落结构特征及多样性分析_陈宇翔.pdf

第 37 卷第 2 期2023 年 4 月南华大学学报(自然科学版)Journal of University of South China(Science and Technology)Vol.37 No.2Apr.2023收稿日期:20221130基金项目:湖南省自然科学基金资助项目(2018JJ2330);湖南省教育厅科学研究项目(16B223)作者简介:陈宇翔(1997)，男，硕士研究生，主要从事土壤污染防控理论与技术方面的研究。E-mail:1045791195qqcom。*通信作者:邓钦文(1981)，男，副教授，博士，主要从事环境修复理论与技术方面的研究。E-mail:dengqw usceducnDOI:10.19431/ki.16730062.2023.02.003含铀凋落物腐解前后微生物群落结构特征及多样性分析陈宇翔1，2，3，周天豪1，2，3，张豪杰1，2，3，李珂淼3，吴同3，谭劲龙1，2，3，邓钦文1，2，3*，杨帆4(1南华大学 铀矿冶生物技术国防重点学科实验室，湖南 衡阳 421001;2南华大学 衡阳市土壤污染控制与修复重点实验室，湖南 衡阳 421001;3南华大学 资源环境与安全工程学院，湖南 衡阳 421001;4衡阳市生态环境局衡南分局，湖南 衡阳 421001)摘要:采集含铀凋落物腐解前后土壤样本，通过 Illumina Miseq 高通量测序技术研究腐解前后土壤微生物的多样性及群落结构，解析含铀凋落物腐解前后土壤微生物群落结构特征及其变化规律，为发掘潜在含铀生物质降解菌种提供理论基础。通过高通量测序，分别获得 158 781 条细菌和 242 198 条真菌的有效序列，菌群 Alpha 分析显示，腐解后细菌的多样性和丰富度增加，真菌的多样性和丰富度减少。通过微生物群落结构解析，发现腐解前后门水平上始终存在的优势菌群，细菌中为绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和变形菌门(Pro-teobacteria);真菌中为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、unclassified_Fungi 和被孢囊门(Mortierellomycota)。结果表明，含铀凋落物腐解后，凋落物内的铀被释放到土壤中，改变了土壤微生物群落结构。腐解后土壤中可识别的优势菌群功能主要集中在对纤维素、半纤维素、木质素的降解和铀的浸出。热酸菌属(Acidother-mus)和软盘菌属(Mollisia)可能是降解凋落物和浸出铀较好的微生物组合。关键词:铀;凋落物;腐解;高通量测序;微生物群落结构中图分类号:X53文献标志码:A文章编号:16730062(2023)02001808Analysis of Structural Characteristics and Diversity of MicrobialCommunities Before and After Decomposition of Uranium-Containing LitterCHEN Yuxiang1，2，3，ZHOU Tianhao1，2，3，ZHANG Haojie1，2，3，LI Kemiao3，WU Tong3，TAN Jinlong1，2，3，DENG Qinwen1，2，3*，YANG Fan4(1Key Discipline Laboratory for National Defense for Biotechnology in Uranium Mining andHydrometallurgy，University of South China，Hengyang，Hunan 421001，China;2Hengyang Key81第 37 卷第 2 期陈宇翔等:含铀凋落物腐解前后微生物群落结构特征及多样性分析2023 年 4 月Laboratory of Soil Pollution Control and emediation，University of South China，Hengyang，Hunan 421001，China;3School of esources Environment and Safety Engineering，University of South China，Hengyang，Hunan 421001，China;4Hengnan Branch of HengyangEcological and Environmental Bureau，Hengyang，Hunan 421001，China)Abstract:Soil samples were collected before and after decomposition of uranium-containingapoplast，and the diversity and community structure of soil microorganisms before and afterdecomposition were studied by Illumina Miseq high-throughput sequencing technology toanalyze the structural characteristics of soil microbial communities before and after decom-position of uranium-containing apoplast and their change patterns，and to provide a theo-retical basis for the discovery of potential uranium-containing biomass degrading speciesHigh-throughput sequencing was performed to obtain 158 781 bacterial and 242 198 fungalsequences Alpha analysis of the bacterial community showed that the diversity and abun-dance of bacteria increased and that of fungi decreased after decomposition Microbial com-munity structure analysis revealed that the dominant groups consistently present at the phy-lum level before and after decay were Chloroflexi，Actinobacteria，Acidobacteria and Pro-teobacteria in bacteria，and Ascomycota，Basidiomycota，unclassified_Fungi，and Mor-tierellomycota in fungi The results showed that with the decomposition of uranium-contai-ning apoplast，uranium within the apoplast was released into the soil and changed the soilmicrobial community structure The functions of the dominant group of identifiable bacteriain the soil after decomposition were mainly focused on the degradation of cellulose，hemi-cellulose and lignin，and leaching of uranium Acidothermus spp and Mollisia spp may bethe better microbial assemblages for degradation of litter matter and leaching of uraniumkey words:uranium;plant residues;decay;high-throughput sequencing;microbial commu-nity structure0引言铀是一种放射性核素，会引起许多有害影响，是一种严重的环境污染物，因其化学毒性和放射性毒性对植物、动物和微生物造成重大损害，并通过食物链累积对人类健康造成严重危害而引起了广泛关注1。近年来，植物修复因其能高效、低成本地去除或稳定重金属，降低重金属毒性而受到广泛关注。但是植物修复会产生大量含重金属的生物质，这些受污染植物的处置是植物修复广泛应用的限制因素之一2，如果处置不当，势必会对环境造成二次污染。正在使用几种富含重金属的生物质的处理方法，包括热解、焚烧、堆肥和压实，他们虽然有效，但大多存在成本过高且不安全的问题3。其中通过微生物处理进行含重金属生物质的降解和污染控制，具有成本低、绿色环保等特点，在研究中受到广泛地重视。微生物处理法是一种通过微生物稳定化和有机物腐殖化处理生物质的技术4。使用微生物对生物质或有机物的生物降解是一种常见方法，已有多年报道。据报道，白腐(white-rot)真菌通过矿化木质素，对木质素降解5。黑曲霉(Asper-gillus niger)是许多植物的危险病原体，它是植物组织破坏、腐烂和分解的主要原因之一6。此外，变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chlo-roflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)都是与凋落物分解密切相关的菌群7。细菌和真菌群落已被证明参与了凋落物分解中的一系列演替过程。LHJing 等8 研究了8 种不同微生物从富含铀的植物中降解和释放铀的能力，通过在铀胁迫下的生长来评估他们降解生物质的能力，发现真菌的降解能力优于细菌，而细菌的金属浸出能力更好。以上研究表明，通过分析微生物群落结构及变化，有助于发掘有降解生物质和除铀功能的微生物，从而控制环境污染。但目前国内尚缺少对91第 37 卷第 2 期南华大学学报(自然科学版)2023 年 4 月含铀生物质腐解前后土壤中微生物群落深入分析的报道。因此，本研究通过高通量测序技术，探究含铀凋落物分解前后微生物群落特征的变化和多样性，将有助于更好地了解在微生物协同处理含铀凋落物时，各优势菌群的降解能力和铀释放能力，以期发掘潜在含铀生物质降解菌种。1材料与方法11样品采集与处理本试验土壤取于南华大学校内西山山脚，土壤采集后经干燥、过筛等前处理以供土壤基本理化性质分析，土壤基本理化性质见表 1。试验在南华大学温室大棚中进行，大棚温度维持在 25 左右，试验植物选用南华大学植物大棚中经铀富集试验后的合果芋，铀质量比为 43.12 mg/kg。将采集后的植物用去离子水冲洗净后，置于通风处风干，在装袋前将其切成 510 cm左右的小段，取风干后的植物 10 g 装入 15 cm15 cm 的 0.165mm孔径尼龙网袋中，并往网袋中添加 100 g土壤混合均匀，埋入土壤中，于 21 d 后取出网袋对土壤进行微生物群落的测试。通过电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spec-trometry，ICP-MS)测定凋落物和水样中的铀质量浓度。表 1土壤理化性质Table 1Physical and chemical properties of soil参数值pH685有机质/%511碱解氮/(mgkg1)8715速效磷/(mgkg1)50912DNA 提取、PC 扩增和高通量测序采用 Omega 公司的 Mag-bind soil DNA kit 试剂盒提取土壤总 DNA，同时采用 Nanodrop 对DNA 进行定量，并通过质量浓度为 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 提取质量。细菌引物为:338F-806(5-ACTCCTACGGGAGGCACAGG-3);真菌 引 物 为:SSU0817F-1196(5-TTAGCATG-GAATAATAATAGGA-3)。并添加样本特异性Barcode 序 列，从 而 对 核 糖 体 NA(ribosomalNA，rNA)基因可变区或特定基因片段进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PC)扩增。之后进行扩增产物的荧光定量，并且根据荧光定量的结果，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例混合，并振荡均匀。测序文库制备后，梯度稀释合格的文库，根据所需测序量按相应比例混合，并变性为单链后使用 MiSeq 测序仪进行双端测序。将 4 个微生物测序所得的序列上传到国家微生物科学数据中心，获得接受号分别为 NMDC40025391、NMDC40025392、NMDC40025393和 NMDC40025394。13生物信息学和统计分析首先根据序列质量对测序所得的原始下机数据进行初步筛查，重测、补测问题样本。把测序所得的 eads 通过分析软件 QIIME2(20194)中进行处理。得到特征序列后，对形成的特征表构建稀疏 曲 线，并 计 算 Chao1、Observed _ species、Simpson、Shannon 和 Good s coverage 这 5 种常用的 Alpha 多样性指数。同时对每个扩增子序列变体(amplicon sequence variants，ASV)的特征序列进行物种注释。其中细菌的 16S rNA 基因，选用Greengenes 数据库。真菌 ITS 序列，选用 UNITE数据库。对参考序列缺少准确的物种信息，以unidentified 标记;对因测序读长的限制，具体的种、属之间无法鉴别分开的，以 unclassified 标记。统计各样本在门和属水平上的物种组成信息，并绘制门水平上微生物的群落构成图和属水平的群落聚类热图。2结果与讨论21样本序列信息及微生物构成含铀凋落物经过 21 d 的腐解，凋落物内的铀被释放出来，导致土壤铀质量比从 0 mg/kg 上升为 4.96 mg/kg。通过对土壤样品的 DNA 进行MiSeq 高通量测序，4 个样品原始序列量共 546 757个，使用 DADA2 方法对原始序列进行分析，经过质控、去噪、拼接、去嵌合体后，获得高质量序列量共 403 090 个，最后去除 2 111 个 single-tons ASV(在全体样本中，序列总数仅为 1 的ASV)得到 400 979 个有效序列(表 2)。对于每个ASV 的特征序列，在 QIIME2 软件中使用预先训练好的 Naive Bayes 分类器进物种注释，细菌分类为 24 个门、58 个纲、122 个目、191 个科、308 个属、558 个种;真菌分类为 11 个门、31 个纲、64 个目、128 个科、166 个属、203 个种。02第 37 卷第 2 期陈宇翔等:含铀凋落物腐解前后微生物群落结构特征及多样性分析2023 年 4 月表 2细菌与真菌高通量测序结果Table 2Bacterial and fungal high-throughputsequencing resultsSample ID原始序列量高质量序列量 非单例序列量B0132 00278 98077 913B21132 47381 91280 868F0135 723114 084114 084F21146 559128 114128 114注:B0 为含铀凋落物腐解前的细菌组;B21 为含铀凋落物腐解后的细菌组;F0 为含铀凋落物腐解前的真菌组;F21 为含铀凋落物腐解后的真菌组。选用稀疏曲线可以预测样本在一系列给定的测序深度下，所可能包含的物种总数及其中每个物种的相对丰富度。曲线的平缓程度反映了测序深度对于观测样本多样性的影响大小，曲线越平缓，表明测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性，继续增加测序深度已无法检测到大量的尚未发现的新 ASV;反之，则表明 alpha 多样性尚未接近饱和。如图 1 所示，4 个组的稀疏曲线均呈先直线上升随后均趋于平坦，并且样本的测序覆盖度均在 99%以上(见表 3)，说明样本中未被检测出的物种所占的比例很少，本次测序结果能较好地反映样品中微生物的真实情况。图 1含铀凋落物腐解前后土壤微生物的稀疏曲线Fig1Sparsity curves of soil microorganisms before and after decomposition of uranium-containing decay22微生物 Alpha 多样性分析通过单样本分析得出微生物群落的丰富度和多样性的总体结论是生物科学中被广泛接受的做法，包括一系列多样性指数(Chao、ACE、Simpson、coverage)估计群落环境的物种丰富度和多样性9。其中 Chao1 和 Observed_species 指数均表征群落中物种的丰富度，指数越大，群落的丰富度越高。Shannon 和 Simpson 指数均表征微生物群落的多样性，指数值越高，群落的多样性越高。其中 Shannon 指数更适用于复杂群落;而 Simpson 指数更适用于简单群落。本试验中，B21 组的 4 个指数均大于 B0 组，而 F21 组的 4 个指数均小于 F0 组(表 3)，可以得出在腐解后，细菌的物种丰富度和多样性也在增加，而真菌的却在减少，并且细菌的物种丰富度和多样性都比真菌要高，说明细菌可能是微生物在含铀凋落物腐解过程中的主要组成部分。研究结果表示，含铀凋落物腐解后，凋落物体内的铀被释放到土壤中，同时土壤微生物群落丰富度和多样性均发生明显变化(表 3)。这可能是由于土壤微生物群落在铀胁迫下，对铀毒性敏感的微生物显著减少，而耐性微生物能很快适应环境的变化10。同时也有凋落物在腐解过程中改变了土壤理化性质，进而对微生物群落造成影响的原因11。与本研究相似，王志方等12 研究发现，在植物的自然腐解后，细菌群落多样性增加。乔天长13 研究发现高浓度腐解液会导致土壤细菌数量增加，真菌和放线菌数量减少。肖诗琦10 通过模拟不同浓度铀污染土壤环境，发现土壤受铀胁迫后，会降低其真菌菌群多样性。安毅夫等14 研究发现长期处于放射性环境下的土壤微生物多样性比正常环境下的土壤微生物多样性低。这可能由于在凋落物和铀的共同影响下，微生物对其的响应程度不同，与细菌群落组成相比，真菌群落组12第 37 卷第 2 期南华大学学报(自然科学版)2023 年 4 月成受环境条件的影响更加明显。表 3细菌和真菌 Alpha 多样性指数Table 3Bacterial and fungal Alpha diversity indexSampleGoods_coverageChao1Observed_speciesSimpsonShannonB00996 7372 451822 4070991 8518739 87B210995 9672 998042 9240997 0529886 22F00999 981501095010953 6685719 57F210999 962195011940898 6164503 2723微生物群落组成解析微生物在门水平上物种丰富度大于 1%的群落构成如图 2 所示，可知两样本间门水平上优势菌群组成类似，细菌群落中绿弯菌门(Chloroflexi，45.00%50.85%)丰富度最高，其次为放线菌门(Actinobacteria，17.94%27.88%)、酸 杆 菌 门(Acidobacteria，11.58%16.95%)和变形菌门(Proteobacteria，8.85%11.01%)。这 与 P KDhal 等15 的研究相似，这四类菌群是印度铀矿尾矿和矿井水沉积物中的优势菌门。T T Zeng等16 研究了铀暴露后的厌氧颗粒污泥的细菌群落，观察到铀暴露后，Chloroflexi 和 Proteobacteria的丰富度显著增加。BSutcliffe 等17 在研究铀浓度变化时的沉积物微生物群落结构中，发现了铀浓度升高会导致 Chloroflexi 的富集。这说明这四类微生物在一定程度上对铀耐受，可以从中筛选出对铀有修复效果的菌群。同时刘欣7 研究了凋落物分解对土壤碳库和微生物群落的影响，发现土壤细菌在土壤碳库的动态变化过程中起着直接调控作用，其中变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)都是与凋落物分解密切相关的菌群。同时这四种菌门均为重金属污染土壤中主要优势菌门18。图 2门水平上微生物的群落构成(物种丰富度1%)Fig2Community composition of microorganisms at the phylum level(species abundance 1%)真菌群落中子囊菌门(Ascomycota，36.28%45.90%)丰富度最高，其次为未被分类的真菌门(unclassified_Fungi，16.36%36.19%)、担子菌门(Basidiomycota，7.56%31.25%)和 被 孢 囊 门(Mortierellomycota，3.31%3.95%)。A Z Ma等19 通过研究秸秆残渣降解过程中土壤真菌群落构成的发展情况，发现子囊菌门在分解中的占主导地位，这与本研究的结果一致，表明子囊菌门22第 37 卷第 2 期陈宇翔等:含铀凋落物腐解前后微生物群落结构特征及多样性分析2023 年 4 月可能是铀胁迫下土壤凋落物降解的关键驱动因素。贾彤等20 研究了重金属质量浓度对植物叶际和根际真菌群落的影响，发现子囊菌门(Asco-mycota)和担子菌门(Basidiomycota)在植物根际和叶际区域均为优势菌门。同时真菌群落中未被分类的真菌门也占较大比例，因此对含铀凋落物腐解中真菌类群库的完善是土壤真菌鉴定及多样性研究深入的关键。这些研究表明，不同环境和铀浓度下微生物在门水平的群落组成相似，但丰富度存在不同。本研究表明凋落物腐解后，细菌中绿弯菌门和酸杆菌门丰富度下降，而放线菌门、变形菌门和 WPS-2 菌门丰富度升高。真菌中子囊菌门、担子菌门和被孢霉门丰富度均下降，这与许洪扬21 发现子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和被孢囊门(Mortierellomycota)在重污染情况下相对丰富度有所减少结果一致。此外，未分类和真菌在土壤中占有一定比例，并在腐解后，在土壤中比例显著上升，因此未知真菌在含铀凋落物腐解过程中具有重要意义。这些结果表明，在含铀凋落物腐解过程中，土壤微生物群落结构发生了变化。这可能是一定程度的铀污染和凋落物释放的营养物质改变了原有群落内部种群之间的竞争关系，导致原始种群失去了优势，而耐铀微生物和有降解功能的微生物丰富度增加，并且某些微生物耐受铀和降解凋落物的过程形成的产物保护了其他种群的微生物，从而使土壤的优势菌群发生了明显改变22。为了进一步比较样本间的物种组成差异，实现对各样本的物种丰富度分布趋势的展示，在属水平统计各样本丰富度大于 1%的菌属丰富度数据，绘制聚类热图(图 3)。比较腐解前后样本的群落结构，发现在细菌群落中，AD3 菌属下降幅度最大，从25.06%下降到5.33%。AD3 属于一种寡营养细菌23，曾在切尔诺贝利废物处理沟的土壤样品中检测出较高丰富度，该菌属能够降解木质纤维素材料，同时可以耐受铀的放射性24。本试验中该菌属的大幅下降可能受到土壤 pH 值和有机 碳 的 影 响25。G12-WMSP1、BacC-u-018、FCPS473、1921-3、1921-2 和 JG30a-KF-32 均属于Chloroflexi 门，对铀有较强的适应性16。HMAb-dulla 等26 研究植物分解中的放线菌发现，放线菌门下的 Nocardioides 分离物能够有效降解植物碎片，致重量显著减轻 50%至 61%，是植物分解中土壤的关键细菌群落之一27。但在本研究中，以上菌属的丰富度在含铀凋落物腐解后降低。图 3属水平上的丰富度热图Fig3Heat map of abundance at the genus levelUncultured 菌属丰富度上升幅度最大，从腐解前的 12.09%到腐解后的 20.21%，说明 Uncul-tured 菌属在含铀凋落物腐解过程中具有重要意义，但是由于各种因素的制约，目前能成功分离培养的微生物仅占微生物总量的 0.1%1.0%，自然界中仍有丰富的微生物资源有待开发利用28。TVetrovsky 等29 沿着重金属污染梯度分析草地土壤中的群落组成发现，Acidothermus 丰富度随着金属质量浓度的增加而增加，同时能高效降解纤维素。这与本研究中 Acidothermus 丰富度在含铀凋落物腐解后上升一致。在真菌群落中，Saitozyma 菌属丰富度下降幅度最大。Saitozyma 是一种含油酵母，具有从植物衍生的木质纤维素成分中生长和生产生化物质的先天能力30。曾在巴西某铁矿区土壤中作为优势菌属被发现，该物种的变化和环境中的重金属质量浓度密切相关31。Trichodermaressei 多年来一直作为工业菌株生产用于分解不同植物材料的酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等8。Monilinia 属的霉菌感染被认为是果实在储存和运输过程中腐烂的主要原因32。同时Monilinia sp也曾被用于多环芳烃污染土壤的生物修复33。LZhang 等34 通过非靶向代谢组学揭示了含纤维素酶的 Penicillium 对铀的应激反32第 37 卷第 2 期南华大学学报(自然科学版)2023 年 4 月应，发现该菌属对铀耐受，同时也可降解植物组织，是一种降解铀超富集植物的理想菌属。QZhang 等35 通过 DNA 稳定同位素探测鉴定同化水稻根渣衍生碳的真菌种群，发现 Staphylotrichum和 Penicillium 属的真菌是土壤中新鲜碳利用的关键微生物。HBYang 等36 利用 Fusarium sp详细研究了铀(VI)的积累，根据被测真菌负载铀(VI)前后的傅里叶变换红外光谱，发现羟基和羧基在吸附过程中都起重要作用。Fusarium 广泛分布于土壤、动植物有机体中，有些可以生活在极端环境中。Fusarium 属可以降解植物残体并具有较高的木质纤维素分解活性37。Mollisia 是温带地区的腐烂植物组织上常见的腐生菌38。在本试验中，该菌属上升幅度最大。3结论1)参与含铀凋落物腐解过程的微生物种类繁多，腐解后的优势菌群对铀有一定耐性，同时发现菌群的功能主要集中在对纤维素、半纤维素、木质素的降解、铀的浸出以及固氮作用。2)热酸菌属(Acidothermus)和软盘菌属(Mol-lisia)可能是降解植物和浸出铀较好的微生物组合。3)与细菌相比，真菌在凋落物的腐解过程中起重要作用，而细菌对铀的浸出效果更好。因此有必要继续研究含铀凋落物中的微生物群落，探讨细菌、真菌群落之间的协同作用，为建立能够同时有效降解富含铀的植物和从植物中浸出铀的微生物组合提供基础数据。参考文献:1CHEN L，LIU J，ZHANG W X，et alUranium(u)source，speciation，uptake，toxicity and bioremediationstrategies in soil-plant system:A reviewJ Journal ofhazardous materials，2021，413(580):125319 2杜娟重金属富集植物后处理及重金属的稳定化研究 D 陕西:西北农林科技大学，2020:2-5 3王敏捷，盛光遥，王锐土壤重金属污染修复植物处置技术进展J 农业资源与环境学报，2021，38(2):151-159 4LIU Z C，TAN K QA review on disposal and utilization ofphytoremediation plants containing heavy metals J Eco-toxicology and environmental safety，2021，226:112821 5吴桐，贾锐鱼，路强强，等白腐菌在木质纤维素酶解中的研究进展J 江苏农业科学，2021，49(5):38-45 6TAWFIK E，ALQUASHI M，ALOUFI S，et alCharac-terization of mutant aspergillus niger and the impact oncertain plants J Sustainability，2022，14(3):1936 7刘欣水情驱动下鄱阳湖湿地植物分解对土壤碳库的影响及土壤细菌的响应D 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