罗非鱼肠系脂滴及相关蛋白提取过程分析_李劼.pdf

DOI:10.12131/20220285文章编号：2095 0780（2023）03 0119 10罗非鱼肠系脂滴及相关蛋白提取过程分析李 劼1,2，黄 卉2，相 欢2，岑剑伟2，魏 涯2，赵永强2，郝淑贤2，李来好21.上海海洋大学 食品学院，上海 2013062.中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部水产品加工重点实验室/国家水产品加工技术研发中心，广东 广州 510300摘要：动植物中的脂质以脂滴(Lipid droplet,LD)的形式存在。掌握脂滴及脂滴相关蛋白(Lipid droplet related protein,LDRP)的提纯方法，对解析鱼类脂质变化及影响机制，寻求适宜的调控途径至关重要。以罗非鱼(Oreochromis niloticus)的肠系脂肪组织为原料，利用离心、重悬及增溶等处理手段分离纯化脂滴及LDRP，并结合SDS-PAGE和质量浓度变化分析提纯效果。结果表明，肠系脂肪组织经3次离心和3次重悬可有效去除杂质，获得较为纯净的脂滴。虽然溶解剂增溶提取的LDRP蛋白浓度较高，但电泳条带存在明显拖尾现象，说明脂质脱除效果不佳，影响了LDRP提取纯度。脱脂增溶需经4组有机溶剂联合处理才可获得纯度高、复溶效果好的LDRP提取样品。离心、干燥方式及脂滴冷冻对LDRP增溶影响差异不显著。关键词：罗非鱼；脂滴；脂滴相关蛋白；提取中图分类号：S 985.1+9文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Extraction process of intestinal lipid droplets and lipid droplet-relatedproteins from tilapiaLI Jie1,2,HUANG Hui2,XIANG Huan2,CEN Jianwei2,WEI Ya2,ZHAO Yongqiang2,HAO Shuxian2,LI Laihao21.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China2.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture and Rural Affairs/National R&D Center for Aquatic Product Processing,Guangzhou 510300,ChinaAbstract:Lipids in animals and plants exist in the form of lipid droplet(LD).It is very important to master the purificationmethods of lipid droplet and lipid droplet related protein(LDRP)for understanding the lipid changes and influence mecha-nisms of fish,and seeking appropriate regulatory approaches.In this paper,the lipid droplet and LDRP were separated and puri-fied through centrifugation,resuspension and solubilization by using Oreochromis niloticus intestinal tissues as raw material.The re-sults show that the intestinal adipose tissues were effectively removed by three times of centrifugation and three times of resus-pension to obtain the pure lipid droplet.Although the concentration of LDRP protein extracted by solubilization was higher,theelectrophoretic bands showed an obvious trailing phenomenon,indicating that the effect of lipid removal was poor,which af-fected the purity of LDRP extraction.Delipidation and solubilization need to be combined with four groups of organic solventsto obtain the LDRP extracted samples with high purity and good re-solubilization effects.The effects of centrifugation drying第 19 卷第 3 期南 方 水 产 科 学Vol.19，No.32023 年 6 月South China Fisheries ScienceJun.，2023收稿日期：2022-11-01；修回日期：2022-12-18基金项目：国家现代农业产业技术体系(CARS-46)；广东省重点领域研发计划项目(2019B020225001)；中国水产科学研究院基本科研业务费专项资金(2020TD69)；中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助(2020CY03,2021SD06)作者简介：李劼(1998)，女，硕士研究生，研究方向为水产品加工与质量安全。E-mail:通信作者：郝淑贤(1972)，女，研究员，博士，研究方向为水产品加工与质量安全。E-mail:李来好(1963)，男，研究员，博士，研究方向为水产品加工与质量安全。E-mail:method and lipid droplet freezing on LDRP solubilization were not significantly different.Keywords:Oreochromis niloticus;Lipid droplet;Lipid droplet-related protein;Extraction水产品在加工和贮藏过程中，其脂质变化显著。脂质通过水解、氧化等反应，一般会生成风味物质，但也会产生大量不良物质，而这些物质可作为评价水产品营养和安全的指标1-2。以往对于水产品脂质的研究多基于整体脂质和脂肪酸的组成和含量3-4。近期大量研究发现脂质以脂滴(Lipiddroplet,LD)的形式存在。脂滴不再是人们传统认知的惰性细胞器，而是一种高度复杂、进化稳定，几乎存在于所有动植物当中的动态细胞器。脂滴在细胞内有维持细胞能量稳定、保护细胞不受脂毒性物质侵害等作用5。同时，脂滴与其他细胞器也有密切的相互作用6-7，如脂滴和线粒体的紧密接触便于疏水性脂肪酸从脂滴转运到线粒体8，内质网合成模型显示脂滴在内质网小叶上合成9-10。脂滴是细胞中常见的重要细胞器，脂滴包被的单层磷脂膜上镶嵌着多种蛋白，如“PAT”家族蛋白5,11，脂滴的中性脂质核心也存在许多蛋白12。在脂滴表面和内部的蛋白被统称为脂滴相关蛋白(Lipid droplet-related protein,LDRP)。不同 LDRP之间的差异会影响脂滴在细胞中的功能13，脂滴的完整性对脂质代谢具有重要意义14。脂滴出现聚集或者是数量变化，与脂质的合成或吸收有密切关系15；脂质成分在降解之前，LDRP 发生降解16-17。目前关于脂滴的研究主要集中在微生物、植物及畜禽类动物6,18-20。密度梯度离心法是脂滴提取的常用方法，其原理是先通过低速离心去除颗粒较大的杂质，使脂滴聚集；再利用不同密度缓冲液进行高速离心，使脂滴和杂质彻底分离。通常依据离心次数分为两步离心法21-22和三步离心法23-24，二者均在最后一次离心中加入不同密度的缓冲液，利用高速离心使脂滴和杂质彻底分离。不同物种提取脂滴的条件不同，需要针对样品种类和特性进行调整25。目前，关于水产动物脂滴的研究较少，分析脂滴提取过程和影响因素的研究尚未见报道。罗非鱼是我国主要的经济鱼类，其脂质在加工及贮藏过程中的变化一直是加工企业及科研工作者关注的焦点。掌握鱼类脂滴及 LDRP 提纯方法，对解析鱼类脂质变化及影响机制，寻求适宜的调控途径至关重要。1 材料与方法 1.1 材料与试剂鲜活罗非鱼(400600 g)购自广州超市。三甲基甘氨酸(Tricine)、4%(体积分数)多聚甲醛通用型固定液购自兰杰柯科技有限公司；Bradford 蛋白浓度测定试剂、Bradford 蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5)、考马斯亮蓝染色液、BeyoColor彩色预染蛋白(10170 kD)购于上海碧云天生物技术有限公司；NUPAGE 12%(体积分数)Bis-Tris 蛋白预制梯度胶板(厚 1.0 mm、15 孔)、NUPAGE MES SDS 缓冲液(20)购于英潍捷基(上海)贸易有限公司；二甲基亚砜、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、苯甲烷磺酰氟(PMSF)、十二烷基磺酸钠(SDS)购于北京索莱宝科技有限公司。二甲苯、中性树胶购于国药集团化学试剂有限公司；环保脱蜡液、HE 染液、油红染液、苏木素染液分化液、返蓝液、甘油明胶封片剂 购于武汉赛维尔生物科技有限公司。其他均为实验室常用试剂。1.2 试剂配制配制磷酸盐缓冲液(PBS)、蔗糖溶液(2.5molL1)。苯甲基磺酰氟(PMSF)(0.2 molL1)：将 0.35 gPMSF 溶解于 10 mL 二甲基亚砜，20 下避光保存。缓冲液 A(Buff A)：1.79 g Tricine 用 400 mL 去离子水溶解，用氢氧化钾(KOH)调 pH 至 7.8；加入 50 mL 蔗糖溶液(2.5 molL1)，定容至 500 mL。缓冲液 B(Buff B)：0.95 g HEPES、1.49 g 氯化钾(KCl)和 0.038 g 氯化镁(MgCl2)，用 180 mL 去离子水溶解，用 KOH 调 pH 至 7.4，定容至 200 mL。1.3 仪器与设备H1850R 冷冻离心机(湖南湘仪公司)；IKA-T25 均质机(德国 IKA 公司)；D1008E 掌上离心机 大龙兴创实验仪器(北京)股份公司；SYN-ERGY/H1 酶标仪(美国伯腾公司)；Alpha1-4 冷冻干燥机(德国 Christ 公司)；DYY-6C 型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；Mini Gel TankPAGE 电泳系统、CRYOSTAR NX5O 冰冻切片机(美国赛默飞科技公司)；J-12J 脱水机、JB-P5 包埋机、JB-L5 冻台(武汉俊杰电子有限公司)；RM2016120南 方 水 产 科 学第 19 卷病理切片机、LEICA 819 切片刀(上海徕卡仪器有限公司)；KD-P 组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；Nikon Eclipse E100 正置光学显微镜、NIKON DS-U3 成像系统(日本尼康)；其他均为实验室常用设备。1.4 方法1.4.1肠系脂肪样品处理参考 Tian 等23的方法并稍加改动。取罗非鱼肠系脂肪，用 PBS 洗涤 3 次，沥干水分，备用。1.4.2肠系脂肪 H&E 染色与观察参考 Tian 等23和崔留娟26的方法并进行调整。取肠系脂肪用 4%(质量分数)多聚甲醛固定48 h，用 75%95%(体积分数)乙醇进行梯度脱水，二甲苯进行透明处理，石蜡固定、切片。切片样品经二甲苯脱蜡、无水乙醇脱水后，进行苏木素染色、分化液分化、返蓝液返蓝、伊红染色，再进行脱水和透明处理，用中性树胶封片。显微镜进行观察与分析。1.4.3肠系脂滴提取参考 Tian 等23、Ding 等25和 Mirza 等27的方法，提取过程见图 1。取 3 g 脂肪样品置于离心管中，加入 10 mL Buff A 和 0.2 mL PMSF 均质，冰浴放置 20 min，匀浆液为全细胞裂解液(Whole celllysate,WCL)。将匀浆液于 4 条件下进行二次离心，首次离心(1 000g)后取上层液(Supernatant,S)进行再次离心(3 000g)，2 次离心时间均为 10 min，经 2 次离心后获得的上清液为去核上清液 1(Post-nuclear supernatant 1,PNS1)。将 PNS1 与 Buff B(5 mL)混合，离心(45 min,4,10 200g)，收集粗脂滴。将粗脂滴用 5 mL Buff B 混合充分后进行重悬处理(10 min,4,10 200g)，脂滴重悬步骤重复 3 次。肠系脂肪样品Intestinal adipose samples均质 Homogenization粗脂滴、上层液 Rough LD,S粗脂滴 Rough LD细胞浆Cyto重悬 Resuspend沉淀 Sediment离心 Centrifugation沉淀(弃)Sediment(Discard)离心 Centrifugation离心 Centrifugation离心 Centrifugation重悬 Resuspend重悬 Resuspend重悬 Resuspend全细胞裂解液 WCL粗脂滴、去核上清液1 Rough LD,PNS1沉淀(弃)Sediment(Discard)沉淀(弃)Sediment(Discard)沉淀(弃)Sediment(Discard)沉淀(弃)Sediment(Discard)沉淀(弃)Sediment(Discard)沉淀(弃)Sediment(Discard)去核上清液2 PNS2 去核上清液3 PNS3 脂滴 LD脂滴 LD脂滴 LD去核上清液4 PNS4 去核上清液5 PNS5 总膜蛋白TM图1 肠系脂肪组织脂滴提取过程Fig.1 Extraction process of lipid droplet in intestinal adipose tissue第 3 期李 劼等:罗非鱼肠系脂滴及相关蛋白提取过程分析1211.4.4脂滴相关蛋白(LDRP)增溶1)溶解剂增溶。参考 Brasaemle 和 Wolins28的方法并进行调整。取 0.1 g 脂滴，加入 1 mL 10%(质量分数)SDS 超声水浴孵化 1 h，期间每隔 10min 将样品用涡流搅拌器搅拌 5 s。孵化结束后常温离心 10 min(10 200g)，收集下层清液。2)脱脂增溶。参考闫峻等24、Brasaemle 和Wolins28及郭玉29的方法并调整。取 0.1 g 脂滴，加入80 预冷的丙酮 1 mL，20 孵育过夜后，4 离心(10 200g)60 min 去上清。沉淀先后经 1 mL 丙酮、丙酮-乙醚混合溶剂(VV=11)及乙醚溶解后进行离心处理，3 次离心温度均为 4，低速长时离心参数为 4 300g，30 min，高速短时离心参数为 10 200g，10 min。干燥后的样品加 100 L 去离子水复溶进行分析。1.4.5蛋白质含量测定一般样品用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒测定。溶解增溶后的蛋白质溶液稀释 10 倍后，用Bradford 蛋白浓度测定试剂盒(去垢兼容型)测定浓度。1.4.6SDS-PAGE 凝胶电泳参考郭玉29、闫峻等24和 Huang 等30的方法并调整，用 12%(质量分数)的预制凝胶进行 SDS-PAGE 分析。取 20 L 蛋白样品溶液与 5 L 的上样缓冲液(5)混合，98 变性 5 min，上样量为10 g 或 10 L。120 V 恒压 90 min，电泳结束用考马斯亮蓝染液进行染色和脱染色。条带的相对分子量与标准蛋白 Maker(10170 kD)进行比较确定。1.5 数据分析实验重复 3 次，使用 SPSS 22.0 软件对数据进行单因素方差分析和差异显著性(P0.05)分析，采用 Origin 2021b 软件绘图。2 结果 2.1 肠系脂肪细胞特点由图 2 可见，肠系脂肪细胞排列紧密，形状呈圆形或椭圆形。大量的脂质空泡说明肠系脂肪细胞含量丰富，其他细胞器含量低。王雅文31和林婉玲等32认为鱼类肠系脂肪在代谢方面表现比较不活跃，主要的功能是储能，所以脂质沉积更多。2.2 脂滴的提取过程如图 3-a 所示，经过细胞裂解步骤，最初的混合溶液(I)浑浊呈橘粉色，粗脂滴分布不均，部分脂质黏附在试管壁上。经过初步离心分离后(II)，裂解液分层，脂滴上浮，下层溶液浑浊，底部有未破碎的肠脂组织薄膜33。经过二次离心(III)，脂滴上浮，溶液明显分层，说明细胞核、细胞碎片和未破碎的细胞除去较为彻底23,25。经过 10 200g 离心分离后(IV)，分为 4 个部分，由上至下依次为黄色油状物、微黄色脂滴、透明溶液和沉淀物。取脂滴层进行 3 次重悬之后(VVII)，脂滴从微黄色变成乳白色，下层溶液基本无沉淀。初步判断经过以上步骤可以获得较为纯净的脂滴。为进一步判断肠系脂肪组织脂滴提取过程中杂质的去除情况，收集脂滴提取过程中各步骤的样品，分别为 WCL、S、PNS1-5、Cyto 和 TM，用SDS-PAGE 进行分析，结果如图 3-b 所示。WCL和 S 条带相似，说明 WCL 经 1 000g 离心仅去除了少量质量较大的未破碎的肠系脂肪组织外膜，其上层液 S 与 WCL 蛋白组成未发生明显变化。PNS1的蛋白质条带颜色变深，因为 3 000 g 离心将更多的杂质沉淀分离出来，所以条带丰度明显增加34-35；PNS1 在 100 kD 附近的条带比 WCL 和 S 要明显，PNS2 与 PNS1 相比 100 kD 附近的条带减弱，说明脂滴得到进一步纯化。Cyto 和 TM 的条带组成类似，35 kD 附近出现了 WCL 和 S 没有的蛋白质条带，说明通过 3 次离心能将破碎细胞膜等杂质充分沉淀。经过重悬处理后 PNS3PNS5 的电泳条带几乎消失，表明脂滴纯化基本完成。闫骏等24、Jolivet 等36和 Ding 等37均认为离心和重悬操作有利于脂滴提纯。肠系脂肪经过提取纯化后，脂滴的提取率约为 55%。2.3 脂滴蛋白的增溶脂滴由疏水核心和磷脂单分子层组成，疏水核脂肪细胞空泡Adipocyte vacuoles肠系脂肪细胞壁Intestinal adipocyte wall 100图2 肠系脂肪组织学观察Fig.2 Histological observation of tilapiasmesenteric adipose tissue122南 方 水 产 科 学第 19 卷心中最主要的物质是三酰基甘油38。有研究表明，LDRP 可能通过两亲性螺旋的疏水侧与磷脂单分子层紧密结合39，通过一般的离心步骤无法将LDRP 与脂质部分很好地分开。因此，需要将LDRP 增溶，使 LDRP 与脂质分离。增溶方式主要分为溶解剂增溶和脱脂增溶 2 种。2.3.1溶解剂增溶本实验在 SDS 与超声的共同作用下，将 LDRP从脂滴上洗脱下来，经过离心后得到含 LDRP 清液。离心后上层不溶于水的白色物质为脂质层，下层微浑浊的溶液为 LDRP。王丽娜等40研究认为脂质被表面活性剂完全溶解后下层溶液呈澄清透明状，而本实验的下层溶液微浑浊，推测脂滴未能完全增溶。取 LDRP 清液进行 SDS-PAGE 分析。图 4-b 结果显示 LDRP 清液蛋白质条带少、颜色浅且有拖尾的现象，说明溶解剂增溶的效果不理想。这可能是由于 LDRP 堆积在电泳孔道中，不能充分迁移到凝胶中28；也可能是高浓度 SDS 溶液使 LDRP 构象改变40-41。2.3.2脱脂增溶脱脂增溶结果如图 5 所示，增溶后蛋白质条IIIIIIIVVVIVIIWCLSPNS1PNS2PNS3PNS4PNS5粗脂滴Rough LD脂滴LDMWCLPNS5PNS1PNS4PNS3PNS2Cyto TMS17013010070554535251510(a)脂滴提取过程 LD extraction process(b)提取效果鉴定；I.混合溶液；II.1 000g 分离；III.3 000g 分离；IV.10 200g 分离；V.1 次重悬；VI.2 次重悬；VII.3 次重悬。WCL.Whole cell lysate;S.Supernatant;PNS1PNS5.Postnuclear supernatant 15;Cyto.Cytosol;TM.Total membrane;M.Marker;I.Mixed solution;II.1 000g separation;III.3 000g separation;IV.10 200g separation;V.1 time resuspension;VI.2 times resuspension;VII.3 times resuspension.kDWCL.全细胞裂解液；S.上层液；PNS1PNS5.去核上清液15Cyto.细胞浆；TM.总膜蛋白；M.Marker；图3 脂滴提取过程Fig.3 Extraction process of lipid droplet第 3 期李 劼等:罗非鱼肠系脂滴及相关蛋白提取过程分析123带多且清晰、丰度高，说明脱脂增溶的效果较理想。2.3.3溶解剂增溶与脱脂增溶的比较图 6 为两种增溶处理后样品蛋白含量分析结果。由图可知溶解剂增溶提取的 LDRP 蛋白浓度高，但电泳时蛋白质条带少、拖尾明显，说明溶解剂增溶对脂质的脱除效果不理想。2.3.4影响脱脂增溶的因素1)增溶步骤对增溶效果的影响。脂滴样品先后经低温丙酮、常温丙酮、丙酮-乙醚混合溶剂(VV=11)及乙醚处理，分析各步骤处理对LDRP 的增溶效果，结果见图 7-a。经过冷冻丙酮增溶后，复溶时试管壁上有大量附着物，复溶溶液呈浑浊状，说明单一丙酮增溶脂质去除效果差；经常温丙酮二次增溶处理后，增溶样品复溶效果略好于单一冷冻丙酮处理，虽然仍存在脂滴附壁现象，但部分溶解液澄清透明(见黑框透明三角形区域)；经过丙酮-乙醚混合溶剂脱脂后，试管壁有少量点状附着物存在(见黑框方形区域)；经过乙醚再次增溶后，试管壁几乎无附着物残留，增溶样品能完全溶于水中。对脱脂增溶得到的 LDRP 进行 SDS-PAGE 和蛋白浓度分析，见图 7-b 和图 7-c。由结果可知冷冻丙酮脱脂增溶后得到的 LDRP 质量浓度最低，且蛋白条带丰度低，25 kD 以下的小分子量蛋白质缺失；随着脱脂步骤的增加，LDRP 蛋白质量浓度变化差异不明显(P0.05)，结合复溶效果选择 4 组溶解剂协同处理。2)离心和干燥的方式对增溶效果的影响。离心和干燥是增溶过程中必不可少的步骤。根据现有研究报道，离心方式分为低速长时离心(4 300g,30 min)和高速短时离心(10 200g,10 min)。干燥可采用氮吹、冻干、自然风干。离心和干燥方式对 LDRP 增溶的影响结果见图 8。SDS-PAGE 电泳图表明不同离心和干燥方式的 LDRP 蛋白条带基本一致(图 8-a)，蛋白丰度也无显著变化；蛋白浓度分析也表明离心和干燥方式对增溶的 LDRP 含量影响差异不显著(P0.05，图 8-b)。说明离心方式和干燥方式不会影响 LDRP 提取增溶效果，研究中可根据条件进行选择。3)冷冻对于脱脂增溶的影响。为分析提取后脂滴存放是否会影响后续 LDRP 增溶，以新鲜脂滴LDRP 清液LDRP solutionM17013010070554535251510Process of solubiliser solubilization(b)SDS-PAGE分析SDS-PAGE analysiskD(a)溶解剂增溶过程图4 溶解剂增溶Fig.4 Solubilization by solubiliser17013010070554535251510MkD图5 脱脂增溶的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of delipidation and solubilizationIII00.51.01.52.0LDRP 质量浓度Mass concentration of LDRP/(mgmL1)溶解剂增溶；II.脱脂增溶。I.Solubilization by solubiliser;II.Delipidation andsolubilization.I.图6 溶解剂增溶和脱脂增溶的LDRP质量浓度Fig.6 LDRPs mass concentration of solubilization by solubili-ser and delipidation and solubilization124南 方 水 产 科 学第 19 卷样品和冷冻脂滴样品(20,7 d)为原料，经上述增溶处理提取 LDRP。由结果可知新鲜脂滴样品和冷冻脂滴样品的 LDRP 条带无显著性差异(图 9-a)，样品间 LDRP 浓度无显著性差异(图 9-b)，说明脂滴在20 冷冻储藏 7 d 不会影响后续 LDRP的增溶。有报道称冷冻脂滴进行增溶处理后，得到的 LDRP 回收率低23,28，与本实验结果略有差异，这可能与实验冷冻时间有关。本实验发现冷冻脂滴样品试管底部出现少量水分，这可能是由于冷冻贮藏过程中，脂滴之间发生聚集所致42-44。IIIIIIIV(a)LDRP 的复溶 Resolvation of LDRPbaaaIIIIIIIV0.20.40.60.81.01.21.41.6LDRP 质量浓度Mass concentration of LDRP/(mgmL1)(b)SDS-PAGE 分析 SDS-PAGE analysisM17013010070554535251510I.低温丙酮；II.常温丙酮；III.丙酮-乙醚混合溶剂；IV.乙醚。I.Low-temperature acetone;II.Room-temperature acetone;III.Acetone/ether solvent mix;IV.Ether.IIIIIIIVkD(c)LDRP 浓度分析 Analysis of LDRPs concentration图7 脱脂增溶过程分析Fig.7 Analysis of process of delipidation and solubilizationMIIIIIIIVV17013010070554535251510aaaaaIIIIIIIVV00.20.40.60.81.01.21.41.6LDRP 质量浓度Mass concentration of LDRP/(mgmL1)(a)LDRP的SDS-PAGE分析SDS-PAGE analysis of LDRP(b)LDRP浓度分析Analysis of LDRPs concentrationI.低速长时；II.高速长时；III.氮吹；IV.冻干；V.自然干。I.Low speed and long time;II.High speed and long time;III.Nitrogen blowing;IV.Freeze-drying;V.Natural drying.kD图8 离心和干燥方式对脱脂增溶的影响Fig.8 Effects of centrifuge and drying method on delipidation and solubilization第 3 期李 劼等:罗非鱼肠系脂滴及相关蛋白提取过程分析1253 讨论 3.1 脂滴提取脂滴几乎存在于所有动植物中，但不同物种、部位所含脂滴量不同32，提取方法也有差异。鱼类脂滴存储位点主要有肠系脂肪组织、肝胰脏、腹部两侧脂肪块45。故本文选择脂滴丰富的肠系脂肪组织作为研究对象。提取脂滴是利用脂滴中性酯密度小的特征46，通过离心和重悬等操作，使脂滴能够浮于水溶液顶部。为保护细胞器，提取中会使用含有蔗糖的 BuffA 进行均质；为保护脂滴和 LDRP 不被酶解，加入 PMSF 防止蛋白酶进行分解47-48；通过梯度离心后，脂滴得以悬浮在液面顶部，这时得到的脂滴仍然有杂质的存在。向脂滴中加入 Buff B 进行洗涤，3 次重悬后，脂滴中的杂质多数被去除。离心过程保留了绝大部分脂滴，但有部分尺寸特小和特大的脂滴丢失25。3.2 LDRP 的增溶SDS 溶液是常用的蛋白质提取增溶剂，其增溶原理是利用 SDS 的表面活性剂特征49，溶解磷脂，使生物膜的通透性增大，实现蛋白增溶的目的50。有研究表明 SDS 可抑制内源蛋白酶对蛋白质的酶解，从而在蛋白质提取过程中起到保护作用51。本研究在溶解增溶过程中，经孵化后的样品溶液浑浊，有大量泡沫产生(图 3-a)。这是由于SDS 作为两亲性化合物本身就具有起泡性52，在孵化过程中经超声及涡旋处理产生大量泡沫。脱脂增溶的原理是利用有机溶剂溶解脂质，使蛋白质沉淀析出53。LDRP 与脂质结合比较牢固，不易溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用丙酮和乙醚等有机溶剂进行增溶54。脱脂增溶是目前研究较为常用的方法26,30，脂滴经过脱脂增溶后，得到白色 LDRP 粉末。与溶解剂增溶的方式相比，脱脂增溶得到的 LDRP 含量虽然较低，但条带多且清晰，适宜用作 LDRP 的提取分析。有研究指出 LDRP 的提取受离心方式的影响28,30。本研究发现离心方式不会影响 LDRP 的提取效果，说明低速长时和高速短时的离心条件下，LDRP 均能实现沉降，与有机溶剂很好地分离。同时，干燥方式也不会影响 LDRP，这可能是由于有机溶剂易挥发、干燥时间短，所以 LDRP 不易发生变性。虽然冷冻过后 LDRP 回收率低，但蛋白质条带无显著差异，说明脂滴性质仍然稳定，短时间内(7 d)可将脂滴置于20 冰箱中储藏，而长时间储藏则需置于80 冰箱中。4 结论肠系脂肪细胞脂质丰富，适合作为研究脂滴提取方法的模板。经过 3 次离心、3 次重悬后能得到较为纯净的脂滴。对 LDRP 进行分析的重要手段是 SDS-PAGE 凝胶电泳，不同的增溶方式对于LDRP 的增溶有截然不同的效果，溶解剂增溶后的LDRP 蛋白质浓度高，有脂质残留；脱脂增溶后的LDRP 条带多但蛋白质浓度低。离心方式、干燥方式和冷冻贮藏对于 LDRP 提取无显著性差异。参考文献：林剑军,赵文红,刘巧瑜,等.脂质水解氧化对干腌鱼制品风味影响的研究进展 J.食品工业,2021,42(9):206-210.1OKPALA C O R,BONO G.Lipid autoxidation in fishery productspostharvest:is cold to freezing oxygen-free packaged storage thebetter remedy?J.Lipid Technol,2016,28(7):122-125.2韩迎雪,林婉玲,杨少玲,等.15 种淡水鱼肌肉脂肪含量及脂肪酸组成分析 J.食品工业科技,2018,39(20):217-222.3柯欢,李慧,熊伟,等.白乌鱼与罗非鱼肉的营养物质比较分析J.农产品加工,2020(1):47-49.4庞永佳,翟桂影,李瑞,等.脂滴包被蛋白的结构、功能及其与脂类疾病关联的研究进展 J.中国畜牧杂志,2021,57(6):59-67.517013010070554535151025MIIIIII00.20.40.60.81.01.21.41.6LDRP 质量浓度Mass concentration of LDRP/(mgmL1)(a)SDS-PAGE 分析SDS-PAGE analysis(b)LDRP 浓度分析Analysis of LDRPs concentrationI.新鲜样品；II.冷冻样品。I.Fresh samples;II.Frozen samples.kD图9 冷冻对脱脂增溶的影响Fig.9 Effect of freezing on delipidation and solubilization126南 方 水 产 科 学第 19 卷彭玥晗,徐磊,许金蔓,等.脂滴包被蛋白基因对猪肌肉发育的影响 J.畜牧兽医杂志,2019,38(3):28-30.6SHIVAIAH K K,SUSANTO F A,DEVADASU E,et 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