农业农村部公告第628号-6-2022 转基因植物环境安全检测 外源杀虫蛋白对非靶标生物影响 第10部分：大型蚤.pdf

2022?12?19发布2023?03?01实施转基因植物环境安全检测外源杀虫蛋白对非靶标生物影响第10部分：大型蚤04中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准备案号：XXXX-XXXX65.020.01BThe detection of environmental safety of genetically modified plantsEffects of exogenous insecticidal protein on nontarget organismsPart 10:Daphnia magna中华人民共和国农业农村部发 布农业农村部公告第 628 号62022CCS农业农村部公告第 号 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由中华人民共和国农业农村部提出.本文件由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口.本文件起草单位:农业农村部科技发展中心、生态环境部南京环境科学研究所.本文件主要起草人:刘标、张旭冬、张莉、梁晋刚、刘来盘、沈文静、方志翔.农业农村部公告第 号 转基因植物环境安全检测外源杀虫蛋白对非靶标生物影响第 部分:大型蚤范围本文件规定了转基因植物外源基因表达的杀虫蛋白对大型蚤(D a p h n i am a g n a)影响的检测方法.本文件适用于转基因植物外源基因表达的杀虫蛋白对大型蚤潜在暴露毒性的检测.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.G B/T 水质物质对蚤类(大型蚤)急性毒性测定方法农业部 号公告 转基因生物及其产品食用安全检测外源基因异源表达蛋白质等同性分析导则术语和定义下列术语和定义适用于本文件.外源杀虫蛋白 e x o g e n o u s i n s e c t i c i d a l p r o t e i n转入植物的外源杀虫基因表达的杀虫蛋白.暴露 e x p o s u r e将大型蚤置于含有受试杀虫蛋白的培养液中.浓度 c o n c e n t r a t i o n受试杀虫蛋白在培养液中的剂量.用每升培养液中混入受试杀虫蛋白的质量(g)来表述.死亡率m o r t a l i t y死亡的受试生物个体数占总受试生物个体数的比率().新生幼蚤o f f s p r i n g测试期间试验蚤所产的子代蚤.半数致死浓度m e d i a nl e t h a l c o n c e n t r a t i o n,L C 暴露于受试化合物后,通过统计分析获得的预期能够引起受试生物死亡率为 的受试杀虫蛋白浓度(基于第 d大型蚤死亡率进行计算).最大耐受试验浓度m a x i m u mt o l e r a n c ec o n c e n t r a t i o n,MT C与阴性对照相比,受试杀虫蛋白不引起受试对象死亡率显著提高的最大浓度.原理按一定剂量(浓度)把转基因植物外源杀虫蛋白均匀混入大型蚤培养液中饲养大型蚤.以混入受试蛋农业农村部公告第 号 白溶剂的大型蚤培养液作为阴性对照,以混入已知对大型蚤有毒的有机或无机化合物的培养液为阳性对照.试验 d后观察计算大型蚤的死亡率和存活母蚤的平均新生幼蚤个数等生命参数,比较分析不同处理间大型蚤生命参数的差异,明确外源杀虫蛋白对大型蚤的潜在暴露毒性.试剂和材料 溶剂用于溶解受试杀虫蛋白的蒸馏水、磷酸盐缓冲液(P B S)或其他溶剂.如需要助溶剂,则助溶剂在大型蚤培养液中最大浓度不超过 m g/L,且需要确保含助溶剂的溶液对大型蚤的生长和繁殖没有显著不利影响.受试外源杀虫蛋白受试外源杀虫蛋白可直接从转基因植物中提取纯化获得,也可经微生物表达、提取、纯化获得,但需要确保所获得的杀虫蛋白与植物组织中表达的杀虫蛋白具有实质等同性,符合农业部 号公告 的要求.阳性对照化合物采用重铬酸钾(p o t a s s i u md i c h r o m a t e,KC rO)(分析纯)作为阳性对照化合物.为验证试验蚤的敏感性和检查试验步骤的统一性,每次进行评价试验时应先测定试验蚤敏感性,测试方法可按照G B/T 中 的规定执行.重铬酸钾的 h E C(半数抑制浓度)在 时应在 m g/L m g/L范围内.大型蚤的选择保持良好的培养条件,使大型蚤的繁殖处于孤雌生殖的状态(G B/T 中的附录A).随机选择实验室条件下培养代以上、遗传背景相同的h h幼蚤为试验蚤.大型蚤人工饵料推荐使用实验室培养的斜生栅藻(S c e n e d e s m u s o b l i g u u s)为大型蚤饵料,制备方法可按照G B/T 中的附录B的规定执行.大型蚤培养液大型蚤培养液见附录A.试验仪器 电子天平:感量为 m g.离心机.酶标仪.烧杯或结晶皿:mL mL.试验步骤 试验处理 阴性对照组:在大型蚤培养液中混入等质量受试杀虫蛋白的溶剂.阳性对照组:将重铬酸钾均匀混入大型蚤培养液中,浓度为 g/L.受试杀虫蛋白处理组:在大型蚤培养液中均匀混入受试外源杀虫蛋白,浓度要求为大型蚤在自然条件下可能暴露的受试杀虫蛋白最高浓度的 倍以上(可将大型蚤在自然生活的水体中所能测定到的受试杀虫蛋白的最高浓度作为受试大型蚤可能暴露的受试杀虫蛋白最高浓度).如果发现受试外源杀虫蛋白对大型蚤有显著不利影响,则需要进一步试验和计算出L C,试验浓度的设置可按照G B/T 中的附录C的规定执行;如果无法或不需要计算L C,则只需设个符合要求的浓度.各试验组材料准备农业农村部公告第 号 受试杀虫蛋白应先溶解或均匀悬浮于灭菌蒸馏水、P B S或其他溶剂中.如果需要助溶剂,应保证该含助溶剂的溶液对大型蚤没有不利影响,且要在对照培养液中加入等量该溶液.先将制备好的受试杀虫蛋白或对照化合物加入蛋白溶剂或助溶剂中,再与大型蚤培养液充分混匀.试验操作与记录 试验在光照培养箱或者人工气候室内进行,培养温度为(),光周期 hh(LD),培养液的适宜p H为(),溶解氧保持在m g/L以上.试验操作及试验过程中试验蚤不能离开培养液,转移操作过程不得对试验蚤造成损伤.随机选择的受试大型蚤单只置于 mL mL小烧杯或者结晶皿等适宜器皿中,每器皿添加 m L培养液.每个处理不少于个重复,每个重复 只大型蚤.测试过程中,每日添加斜生栅藻饵料至培养器皿中,使其在培养液中的浓度约为 个/L.每dd更换培养液.每天观察、记录试验蚤生长发育情况,如死亡头数、新生幼蚤数;新生幼蚤产出后,每天从试验器皿中移出.试验持续时间为 d.质量保证与控制 受试杀虫蛋白在大型蚤培养液中的稳定性检测在含受试杀虫蛋白的培养液提供给大型蚤前和 h后,分别取个个样品(每样品m L),于 冰箱中保存.可采用酶联免疫法(E L I S A)或其他蛋白测定方法检测样品中受试杀虫蛋白的含量.暴露于大型蚤饲养环境条件 h后的培养液中受试杀虫蛋白浓度应不低于新鲜培养液中受试杀虫蛋白浓度的;如果受试杀虫蛋白降解率超过,需要补加受试蛋白至初始浓度.试验体系合格性检测阴性对照组大型蚤的死亡率低于,存活母蚤的平均产新生幼蚤数大于 头,阳性对照组大型蚤死亡率显著高于阴性对照组,表明试验体系工作正常,可用于检测外源杀虫蛋白对大型蚤的潜在毒性;否则,需要查找原因,重新进行试验.结果分析与表述 数据处理根据试验记录计算大型蚤死亡率和存活母蚤的平均产新生幼蚤数.数据以表格的形式描述.死亡率用百分数描述,新生幼蚤数用平均值标准差(样本数n)描述.可用成对比较(p a i r w i s e)统计分析受试杀虫蛋白处理组与阳性对照组、阴性对照组的差异.如果受试杀虫蛋白处理组与阴性对照组具有显著性差异,并可求得受试杀虫蛋白的L C,则通过概率单位法(P r o b i ta n a l y s i s)、寇氏法(K o r b o r)或其他计算方法求得L C;如果无法求得L C,仅给出实际的统计分析数据即可.结果表述根据统计分析结果,评估转基因植物外源杀虫蛋白对大型蚤的潜在暴露毒性,结果表述为“与阴性对照组相比,受试杀虫蛋白处理组的试验蚤(死亡率、存活母蚤的平均产新生幼蚤数)增加(或减少),差异达(未达)显著(极显著)水平”.如果受试杀虫蛋白处理组与阴性对照组大型蚤死亡率有显著性差异,并可求得L C,结果表述为“受试杀虫蛋白对大型蚤的半数致死浓度为”;如果受试杀虫蛋白处理组与阴性对照组大型蚤死亡率没有显著性差异,结果表述为“大型蚤对该杀虫蛋白的暴露毒性最大耐受浓度(MT C)(最大试验浓度)”.农业农村部公告第 号 附录A(规范性)大型蚤培养液A 配方见表A .表A 大型蚤培养液储备液配方序号成分L蒸馏水中加入的量,gC a C l HO M g S O HO N a HC O K C l A 配置方法A 分别取序号、四种储备液溶液各 mL,充分混合,用蒸馏水稀释至L即为大型蚤培养液.新配制的培养液p H为(),硬度()m g/L(以C a C O计),C a M g比例接近,溶解氧浓度在空气饱和值的 以上,并尽可能检查培养液中不含有任何已知的对大型蚤有毒的物质.例如:氯、重金属、农药、氨或多氯联苯.A 必要时可用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节p H,使其稳定在().