茶树CsNCED2启动子互...筛选及在非生物胁迫中的响应_李佳思.pdf

茶叶科学 2023，43（3）：325334 Journal of Tea Science www.tea- 收稿日期：2023-02-12 修订日期：2023-04-03 基金项目：大学生创新创业训练项目（202110712028）、国家茶叶产业技术体系（CARS-19）、陕西省农业科技创新驱动项目（NYKJ-2022-YL(XN)37）、西北农林科技大学推广模式专项（TGZX2022-25）作者简介：李佳思，女，在读本科生，。*通信作者： 茶树 CsNCED2 启动子互作转录因子筛选及 在非生物胁迫中的响应 李佳思，刘迎庆，张永恒，张迎澳，肖烨子，刘露，余有本*西北农林科技大学园艺学院，陕西 杨凌 712100 摘要：9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是脱落酸（ABA）合成过程中的关键限速酶，广泛参与植物的生长发育及非生物胁迫响应过程。茶树中 CsNCED2 参与响应盐胁迫和干旱胁迫，但其转录调控机制尚不明确。通过酵母单杂交文库筛选技术，获得 2 个结合茶树 CsNCED2 启动子的转录因子 CsDof5.4 和 CsERF38，亚细胞定位、酵母自激活检测及荧光素酶试验表明，它们都定位于细胞核并能激活 CsNCED2 的表达。RT-qPCR结果表明，在盐胁迫下，CsERF38 和 CsDof5.4 的表达均与 CsNCED2 的表达呈显著正相关；干旱胁迫下，只有 CsERF38与 CsNCED2的表达呈正相关。本研究筛选出 2个与茶树 CsNCED2 启动子互作的转录因子 CsDof5.4和 CsERF38，而干旱、盐胁迫均能诱导 CsNCED2 基因上调表达，从而参与茶树非生物胁迫响应过程。关键词：茶树；CsNCED2；转录调控；表达分析 中图分类号：S571.1，Q52 文献标识码：A 文章编号：1000-369X(2023)03-325-10 Identification of Transcription Factors Interacting with CsNCED2 Promoter and Their Response to Abiotic Stress LI Jiasi,LIU Yingqing,ZHANG Yongheng,ZHANG Yingao,XIAO Yezi,LIU Lu,YU Youben*College of Horticulture,Northwest A&F University,Yangling 712100,China Abstract:Nine cis epoxide carotenoid dioxygenase(NCED)is a key rate-limiting enzyme in abscisic acid(ABA)synthesis and widely involved in plant growth and development as well as abiotic stress response.CsNCED2 is involved in the response to drought and salt stress in tea plants,while the transcriptional regulation mechanism involved is still unclear.In this study,two transcription factors,CsDof5.4 and CsERF38,which binded to the CsNCED2 promoter were identified by yeast single hybrid(Y1H)library screening.Subcellular localization,yeast self-activation and luciferase(LUC)assay show that they were located in the cell nucleus and could activate the expression of CsNCED2.RT-qPCR results show that the expressions of CsERF38 and CsDof5.4 were highly correlated with CsNCED2 under salt stress.While under drought stress,only the expression of CsERF38was highly correlated with that of CsNCED2.In this study,two transcription factors(CsDof5.4 and CsERF38)binding to the CsNCED2 promoter were identified.Both drought and salt stresses could induce the expression of CsNCED2,thus participate in the abiotic stress response in tea plants.Keywords:tea plant,CsNCED2,transcriptional regulation,expression analysis DOI:10.13305/ki.jts.2023.03.007326 茶 叶 科 学 43 卷 脱落酸（Abscisic acid，ABA）是一种重要的植物激素，在植物种子休眠、萌发、生长、开花、果实成熟等生理活动中发挥关键作用1-5。同时，ABA 也是植物中的关键抗逆因子，参与了植物对多种逆境胁迫的响应过程，如植物在遭受干旱6、低温7、盐害8、病害9等胁迫时，植物体内会迅速积累 ABA，从而诱导一系列依赖于 ABA 信号的抗逆基因上调表达，引起植物抗逆性的增加10。近年来，大量的研究揭示了植物体内 ABA 的合成途径，其 中，9-顺 式-环 氧 类 胡 萝 卜 素 双 加 氧 酶（NCED）被鉴定为 ABA 合成过程中的关键限速酶，它的表达往往受到逆境胁迫诱导并与植物抗逆性相关11-12。水稻中的研究表明，干旱胁迫能诱导 OsNCED5 的表达，从而促进ABA 合成，增加了水稻的抗旱性13。而抑制GhNCED1 会导致棉花体内的 ABA 含量降低，增加了棉花对干旱和盐胁迫的敏感度12。研究表明，转录因子可以介导胁迫所诱导的 NCED 转录水平变化，一些转录因子通过激活 NCED 的表达来增加植物的抗逆性，也有一些转录因子通过抑制其表达从而降低植物的抗逆性。例如，拟南芥 AtWRKY57 通过结合到 AtNCED3 的启动子并激活其表达，促进 ABA 的积累，提高拟南芥的抗旱性14。在盐胁迫下，水稻 OsERF19 可以通过激活 OsNCED5的表达，进而影响水稻体内的 ABA 含量和耐盐性15。番茄中，bHLH 类转录因子 SlBZR1通过直接激活 SlNCED1 的表达来增加番茄中的 ABA 含量以提升番茄的抗寒能力16。也有一些转录因子通过抑制 NCED 的表达从而在植物应对逆境胁迫过程中发挥负面作用，如水稻 OsWRKY67 能抑制 OsNCED3 和 OsNCED4的表达，过量表达 OsWRKY67，导致水稻的抗旱性降低17。茶树中鉴定了 5 个 NCED 基因，它们的表达量在茶叶加工过程中会发生显著变化18-19。此外，茶树 NCED 成员在茶树对低温20和干旱胁迫21-22的响应过程中也发挥着重要作用，但茶树中 NCED 响应胁迫条件的转录调控机制 还 有 待 进 一 步 研 究。本 研 究 通 过 对CsNCED2 上游调控因子进行挖掘，并探究它们在不同胁迫下的表达模式，以期为进一步了解 CsNCED2 响应胁迫的转录机制奠定基础。1 材料与方法材料与方法 1.1 试验材料与处理方法 试验材料为一年生龙井长叶无性系水培苗，培养于西北农林科技大学科研温室。培养条件为白天 25，晚上 22，自然光照；选取健康且长势一致的茶苗进行不同胁迫处理。盐、干旱处理：将茶苗根部用水洗净后移入配制好的 NaCl（200 mmolL-1）和 20%PEG 6000溶液中分别进行高盐和干旱胁迫；低温处理：使用光照培养箱进行 4 低温胁迫。3 个处理均在处理后 0、1、4、6、8、12、24、48 h 剪取幼嫩叶片，用液氮快速冷冻后保存于80 冰箱用于提取 RNA，每个时间点的样品均设置 3 个生物学重复。1.2 酵母单杂交文库筛选 用课题组前期克隆的 CsNCED2 的启动子做模板，将836 至1415 区域构建至 pABAi载体上获得诱饵载体（引物见表 1）。用限制性内切酶 BstbI 线性化诱饵载体并转化至Y1HGold 酵母中，涂布于 SD/-Ura 培养基，30 培养 3 d。挑取单克隆用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 进行菌落 PCR 鉴定，获得诱饵菌株 Y1H-pAbAi-proCsNCED2。取适量 Y1H-pAbAi-proCsNCED2 涂布于含有不同金担子素 A（Aureobasidin A，AbA）浓度的 SD/-Ura 培养基上，30 倒置培养 3 d，观察菌落的生长情况，以确定能够完全抑制Y1H-pAbAi-proCsNCED2 自激活的 AbA 浓度。按照 SK2400 经典酵母转化试剂盒（酷来搏，北京）说明书制作 Y1H-pAbAi-proCsNCED2感受态细胞，并转化本实验室前期构建的茶树叶片文库质粒，转化后的菌涂布于 SD/-Leu3 期 李佳思，等：茶树 CsNCED2 启动子互作转录因子筛选及在非生物胁迫中的响应 327 （100 ngmL-1 AbA）培养基上，30 倒置培养 3 d 后，挑取单克隆进行 PCR 扩增，并对PCR 产物进行测序鉴定。1.3 酵母单杂交点对点验证互作蛋白 测序信息提交到 NCBI进行 BLASTx比对后，根据候选转录因子 CsDof5.4（GenBank登 录 号XP_028116390.1）和CsERF38（GenBank 登录号 XP_028084536.1）序列信息设计特异引物（表 1），以龙井长叶 cDNA为模板将它们的编码序列（CDS）构建至pGADT7(AD)载 体 上，形 成 AD-Dof5.4 和AD-ERF38重 组 载 体，并 转 化 至Y1H-pAbAi-proCsNCED2 感受态细胞中，涂布于 SD/-Leu（100 ngmL-1 AbA）培养基上，30 培养 3 d，观察菌斑生长状况，AD 空载体转化 Y1H-pAbAi-proNCED2 菌株为阴性对照。1.4 转录活性鉴定 设计特异引物（表 1）将 CsDof5.4 与CsERF38 的 CDS 序列构建至 pGBKT7(BD)载体，获得 BD-Dof5.4 与 BD-ERF38 重组载体，并将它们分别转化入 Y2HGold 酵母感受态细胞中，涂布于 SD/-Trp 培养基，30 培养 3 d，将长出的单克隆转移至SD/-Trp-His-Ade(X-a-gal)培养基上，30 条件下进行培养，观察它们的生长状态及颜色变化。转化有 BD 空载体的 Y2HGold 酵母菌作为阴性对照。1.5 亚细胞定位分析 设 计 特 异 引 物（表1）构 建35S:CsDof5.4-GFP 和 35S:CsERF38-GFP 用于亚细胞定位试验。将 35S:CsDof5.4-GFP、35S:CsERF38-GFP 和 35S:GFP 分别转化至根癌农杆菌 GV3101 中，在 28 分别培养至浑浊后，3 000 rmin-1离心 5 min，弃去培养基，用侵染液（10 mmolL-1 MgCl2，10 mmolL-1 MES，120 molL-1 AS，pH=5.7）分别重悬菌体至 OD600为 0.8 后注射到烟草叶片中，48 h后使用荧光显微镜 BX63（奥林巴斯，日本）对注射区域进行 GFP 信号的观察。1.6 双荧光素酶（Dual-LUC）试验 用 实 验 室 前 期 保 存 含 有 的CsNCED2pro:LUC 的 GV3101（pSoup）作为报 告 菌 株，转 化 有35S:CsDof5.4-GFP、35S:CsERF38-GFP 和 35S:GFP 的根癌农杆菌GV3101 作为效应菌株。用侵染液分别将它们的 OD600调整至 0.8，报告菌株和相应的效应菌株按照体积比为 11 的比例混匀后注射至烟 草 叶 片 中，注 射48 h后 按 照Double-Luciferase Reporter Assay Kit（全式金，北京）试剂盒说明书进行萤火虫荧光素酶（LUC）和海肾萤光素酶（REN）活性测定。1.7 RNA 提取和实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）分析 茶树 RNA提取根据多糖多酚植物总 RNA提取试剂盒（天根，北京）说明书进行。根据CsNCED2，CsDof5.4 和 CsERF38 基因序列信息设计特异定量引物（表 1）用于 qRT-PCR试 验，茶 树 GADPH 基 因 作 为 内 参 基 因（TEA003029）。使用 ChamQ SYBR qPCR Master Mix 试 剂 盒（诺 维 赞，南 京）在Lightcycler480 型 定 量PCR仪 进 行qRT-PCR。设置 3 个生物学重复，用TC-2法计算基因的相对表达量，并利用 GraphPad Prism 8 作图。1.8 数据统计与分析 用 Excel 软件进行数据统计，IBM SPSS 19 软件进行 Students t 检验，P0.05 被认为有统计学意义。2 结果与分析结果与分析 2.1 CsNCED2 启动子互作蛋白筛选 诱饵载体 pAbAi-proNCED2 用限制性内切酶 Bstb线性化后转化 Y1HGold 酵母感受328 茶 叶 科 学 43 卷 态细胞，涂布于 SD/-Ura 培养基上 30 培养3 d，挑 取 单 菌 落 进 行 PCR 鉴 定，获 得Y1H-pAbAi-proCsNCED2 诱饵菌株，将其涂布于 SD/-Ura 培养基上，AbA 质量浓度分别为0、50、100、150 ngmL-1。结果显示，诱饵菌株在不含 AbA 的 SD/-Ura 培养基上生长良好（图 1A），而在含 50 ngmL-1 AbA 的 SD/-Ura培养基上不能生长（图 1B），因此选择质量浓度为 50 ngmL-1的 AbA 作为 CsNCED2 启动子酵母单杂交的工作浓度。文库质粒转化至诱饵菌株后，筛选到 17 个单克隆能在 50 ngmL-1 AbA 的 SD/-Leu 培养基上生长（图 1C），对它们分别进行菌落 PCR 鉴定后得到 16 个条带大小为 1 0002 000 bp 的 PCR 产物（图 1D）。表 1 本研究所用引物 Table 1 Primers used in this study 引物名称 Primer name 引物序列（5-3）Primer sequence(5-3)用途 Usage pAbAi-CsNCED2 F：GAATTCGAGCTCGGTACCCACTGAATTGATTGAGATTAACTCAC R：CAGAGCACATGCCTCGAGGAGATTGTTCAACACTCACAAAAAG 构建诱饵载体 Dof5.4-AD F：GCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGCAAGATATACATTCGATTGGAG R：CAGCTCGAGCTCGATGGATCCTGGGAGATAAAGATGGTGATCGCTG 构建 AD 载体 ERF38-AD F：GCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGGATGGTAGCTACATAGATGAG R：CAGCTCGAGCTCGATGGATCCCAGAGCCCCAATTATCCTTTGTTTC Dof5.4-BD F：ATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGCAAGATATACATTCGATTGGAG R：CCGCTGCAGGTCGACGGATCCTGGGAGATAAAGATGGTGATCGCTG 构建 BD 载体 ERF38-BD F：ATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGATGGTAGCTACATAGATGAG R：CCGCTGCAGGTCGACGGATCCCAGAGCCCCAATTATCCTTTGTTTC Dof5.4-GFP F：ATTTGGAGAGGACAGGGTACCATGCAAGATATACATTCGATTGGAG R：TCCTCCTCCTCTAGAGGATCCTGGGAGATAAAGATGGTGATCGCTG 构建 GFP 标签载体 ERF38-GFP F：ATTTGGAGAGGACAGGGTACCATGGATGGTAGCTACATAGATGAG R：TCCTCCTCCTCTAGAGGATCCCAGAGCCCCAATTATCCTTTGTTTC qDof5.4 F：GTGGTGATTCATTCAAGAGTTGCAGAGCC R：CTTGCAGAAGTGGCGGGGCTGAGAGAGG qRT-PCR 分析 qERF38 F：CCAGCCTTCCATCAAACCCAACTCAAAC R：GCTCGTTCCGCTCCCGACTCGACATAGG qNCED2 F：CCATGGCTTCTTCAGCTACTGCAACAGC R：GTGGCAGCGATAATGGCAATAACAGGAG qGADPH F：TTGGCATCGTTGAGGGTCTCATGAC R：CATCGACAGTGGGAACACGGAAAGCC 图 1 CsNCED2 启动子酵母单杂交文库筛选结果 Fig.1 Yeast single hybrid library screening results of CsNECD2 promoter A B CD 2000 bp 1000 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17注：A 为 Y1H-pAbAi-proCsNCED2 在 SD/-Ura（0 ngmL-1 AbA）上的生长情况，B 为Y1H-pAbAi-proCsNCED2 在 SD/-Ura（50 ngmL-1 AbA）上的生长情况。C 为文库筛选得到的单克隆。D 为菌落 PCR 结果 Note:A,the growth situation of Y1H-pAbAi-proCsNCED2 on SD/-Ura(0 ngmL-1 AbA).B,the growth situation of Y1H-pAbAi-proCsNCED2 on SD/-Ura(50 ngmL-1 AbA).C,monoclone obtained by library screening.D,results of colony PCR3 期 李佳思，等：茶树 CsNCED2 启动子互作转录因子筛选及在非生物胁迫中的响应 329 2.2 EST 序列的功能注释 将 16 个 PCR 产物测序得到的 EST 序列提交到 NCBI 网站（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov）进行 BLAST 比对和注释，如表 2 所示，多个EST 编码的蛋白参与胁迫响应过程，如与植物病虫害免疫相关的 GDSL 酯酶/脂肪酶23（EST5），与干旱、盐胁迫相关的水通道蛋白24 （EST11），脱落酸、胁迫、成熟诱导蛋白ASR25（EST10）和甘油-3-磷酸酰基转移酶26（EST13）等。同时，EST6 被注释为 AP2/ERF转录因子，EST15 被注释为 Dof 转录因子，说明它们可能直接参与了 CsNCED2 的转录调控。根据他们与其他植物的同源蛋白的进化关系（图 2）将它们分别命名为 CsERF38 和CsDof5.4。表 2 EST 序列对比结果 Table 2 Comparison of EST sequence EST 序列 EST sequence 同源基因 Homologous gene 长度/bp Length 期望值 Expected value 相似性/%Identity 1 NADH 脱氢酶泛素铁硫蛋白 4（XP_028111338.1）951 7e-109 100.00 2 叶绿素 a-b 结合蛋白 CP29.2（XP_028086654.1）1 203 1e-130 100.00 3 含组氨酸磷转移蛋白 1-like（XP_028073440.1）915 3e-86 98.00 4 富谷氨酸蛋白样亚型 X2（XP_028111616.1）940 2e-44 98.15 5 GDSL 酯酶/脂肪酶 At5g45910（XP_028094960.1）1 179 0.0 100.00 6 类筋素阿拉伯半乳糖蛋白 12（XP_028082861.1）1 000 7e-116 100.00 7 AP2/ERF 和 B3 结构域转录因子（XP_028084536.1）926 5e-103 97.67 8 丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶 VPS15（XP_028058674.1）1 146 2e-51 98.91 9 光系统 I 反应中心亚基 II（XP_028086127.1）1 061 5e-135 100.00 10 脱落酸、胁迫、成熟诱导蛋白 ASR（AHJ09608.1）1 032 3e-25 98.67 11 水通道蛋白 PIP2-2（XP_028057188.1）1 134 0.0 99.26 12 鞘氨醇-1-磷酸裂解酶 X3 亚型（XP_028078326.1）859 2e-124 96.76 13 甘油-3-磷酸酰基转移酶 8（XP_028081769.1）1 061 5e-179 93.98 14 腺苷同型半胱氨酸酶（XP_028127148.1）1 191 0.0 99.35 15 dof 锌指蛋白 DOF5.4（XP_028116390.1）892 3e-41 100.00 16 重金属相关异戊二烯化植物蛋白 39（XP_028052750.1）1 015 2e-55 100.00 AtERF7 AtERF3 VvERF10-cArERF9 AtERF38 CsERF38ArERF38 ArERF11 CsDof1.4 VvDof1.4 CsDof5.3 VvDof1.1 CsDof5.4VvDof5.4 AtDof5.6 CsDof5.6 AtDof5.3 CsDof2.1 VvDof2.1 100 100 97 35 96 A B100839751100100100100注：A 为 CsERF38（EST6）与其他植物同源蛋白的进化分析。B 为 CsDof5.4（EST15）与其他植物同源蛋白的进化分析Note:A,phylogenetic analysis of CsERF38(EST6)and homologous proteins in other plant species.B,phylogenetic analysis ofCsDof5.4(EST15)and homologous proteins in other plant species 图 2 转录因子进化分析 Fig.2 Phylogenetic analysis of transcription factors 330 茶 叶 科 学 43 卷 2.3 CsDof5.4 和 CsERF38 转录激活鉴定和亚细胞定位分析 CsDof5.4 和 CsERF38 的 CDS 构建至 BD载体上用于转录活性分析，结果如图 3A 所示，在 SD/-Trp-His-Ade(X-a-gal)培养基上转化有BD 空载体的 Y2HGold 菌株不能生长，而转化有 BD-CsDof5.4 和 BD-CsERF38 的 Y2HGold能激活报告基因 HIS3、ADE2 和 MEL1的表达，从而正常生长并显示蓝色，说明 CsDof5.4 和CsERF38 均具有转录激活的作用。烟草叶片中的亚细胞定位显示 35S:CsDof5.4-GFP 和35S:CsERF38-GFP 的荧光均只在细胞核中观察到，说明 CsDof5.4 和 CsERF38 均定位于细胞核（图 3B）。2.4 CsDof5.4 和 CsERF38 对 CsNCED2 的表达调控 为了进一步分析 CsDof5.4 和 CsERF38 与CsNCED2 启动子结合情况，将 CsDof5.4 和CsERF38 的全长 CDS 分别构建至 AD 载体并转化至诱饵菌株进行验证。如图 4A 所示，转化 有 AD-ERF38 和 AD-Dof5.4 的 菌 株 在SD/-Leu（100 ngmL-1 AbA）培养基上能正常生长，而转化 AD 空载体质粒的菌株则不能，说明 CsDof5.4 和 CsERF38 能结合 CsNCED2的启动子。同时，在烟草叶片进行荧光素酶试验来验证 CsDof5.4 和 CsERF38 对 CsNCED2表达的调控，结果如图 4B 所示，在烟草叶片中表达 CsDof5.4 和 CsERF38 都显著增强了CsNCED2 启动子驱动的 LUC 信号，说明CsDof5.4 和 CsERF38 都能激活 CsNCED2 的表达。2.5 CsNCED2、CsERF38 和 CsDof5.4 在胁迫下的表达分析 利用 qRT-PCR 分别检测了 CsNCED2、CsERF38 和 CsDof5.4 对盐、干旱和低温胁迫的响应，结果如图 5 所示，CsNCED2 的表达量在盐胁迫和干旱胁迫下上升，而在低温处理下没有显著变化。同样地，盐胁迫和干旱胁迫也诱导了 CsERF38 的表达，且在盐胁迫和干旱胁迫下 CsERF38 表达水平的变化趋势与CsNCED2 表达水平的变化趋势相关性分别为0.79 和 0.77。CsDof5.4 的表达水平不受干旱胁迫和低温胁迫的影响，但在盐胁迫下逐渐上升，且在盐胁迫下 CsDof5.4 表达水平的变化趋势与 CsNCED2 表达水平的变化趋势相关性高达 0.85。3 讨论讨论 酵母单杂交技术库筛文选能高效的鉴定到与目的基因启动子互作的转录因子，因此被广泛运用到葡萄27、香蕉28、桃29等多种植物的研究中。本研究通过酵母单杂交技术鉴定到 CsERF38 和 CsDof5.4 能结合 CsNCED2 的启动子，同时，通过 CsERF38 和 CsDof5.4 的亚细胞定位分析、转录活性鉴定及在烟草中的荧光素酶试验进一步证实了 CsERF38 和CsDof5.4 可以直接激活 CsNCED2 的表达，表明它们在茶树在 CsNCED2 转录调控中发挥重要作用。NCED 基因的表达能响应逆境胁迫并调控内源 ABA 的含量水平，从而提高植物的抗性30-31。同样地，茶树中的研究发现，ABA含量在干旱胁迫下快速上升，导致气孔关闭以减少水分散失22；Wan 等32研究表明，ABA信号在茶树对盐胁迫响应过程中也发挥重要作用。本研究发现，CsNCED2 的表达量在干旱和盐胁迫下上升，表明它在茶树中参与了干旱和盐胁迫导致的 ABA 积累过程。另外，Ni等33研究表明低温胁迫增强了茶树叶片中ABA 的合成过程，王赞等20的研究证实了 1个茶树 NCED 基因参与了低温诱导的 ABA 合成过程，而本研究结果表明 CsNCED2 的表达不受低温胁迫诱导。综上所述，茶树不同NCED 基因成员在响应胁迫过程存在差异，CsNCED2 主要参与了茶树对干旱和盐胁迫的响应过程。3 期 李佳思，等：茶树 CsNCED2 启动子互作转录因子筛选及在非生物胁迫中的响应 331 绿色荧光GFP 明场 Bright 融合 Merged 35S:CsERF38-GFP35S:CsDof5.4-GFP35S:GFPBA BDBD-CsDof5.4BD-CsERF38SD/-Trp SD/-Trp-His-Ade(X-a-gal)图 3 CsDof5.4 和 CsERF38 的转录活性鉴定和亚细胞定位分析 Fig.3 Transcriptional activity identification and subcellular localization analysis of CsDof5.4 and CsERF38 注：A 为 BD-CsDof5.4 和 BD-CsERF38 的转录活性鉴定。B 为 BD-CsDof5.4 和 BD-CsERF38 的亚细胞定位分析Note:A,transcriptional activity identification of BD-CsDof5.4 and BD-CsERF38.B,subcellular localization analysisof BD-CsDof5.4 and BD-CsERF38 A B 注：A 为 AD-CsDof5.4 和 AD-CsERF38 转化 Y1H-pAbAi-proCsNCED2 诱饵菌株后在 SD/-Leu 和 SD/-Leu/AbA（100 ngmL-1）培养基上的生长情况。B 为 CsDof5.4和 CsERF38 调控 CsNCED2 启动子活性的分析 Note:A,the growth situation ofAD-CsDof5.4 and AD-CsERF38transformed Y1H-pAbAi-proCsNCED2bait strain on SD/-Leu andSD/-Leu/AbA(100 ngmL-1)medium.B,the analysis of promoter activity ofCsNCED2 regulated by CsDof5.4 andCsERF38 图 4 酵母单杂交验证 CsDof5.4 和 CsERF38 与 CsNCED2 启动子结合 Fig.4 Y1H verification of CsDof5.4 and CsERF38 binding to CsNCED2 promoter 332 茶 叶 科 学 43 卷 已有大量研究表明，植物中的转录因子通过调控 NCED 的表达来响应胁迫环境34-35。本研究证实，CsERF38 和 CsDof5.4 参与了茶树对盐胁迫的响应过程，同时 CsERF38 参与了茶树对干旱胁迫的响应过程。尽管它们在茶树响应盐胁迫和干旱胁迫过程中的具体功能图 5 盐、干旱和低温胁迫下的表型及 CsNCED2，CsERF38 和 CsDof5.4 的表达分析 Fig.5 Phenotype and expression analysis of CsNCED2,CsERF38 and CsDof5.4 under salt,drought and low temperature stresses CK NaClPEG4 胁迫处理 0 h Stress treatment 0 h 胁迫处理 48 h Stress treatment 48 h A B 0 1 6 12 48 相对表达量 Relative expression 151050时间 Time/h NaCl 0 4 8 24 48相对表达量 Relative expression 151050时间 Time/hPEG0 1 6 12 24 48相对表达量 Relative expression 151050时间 Time/hCsNCED2CsDof5.4CsERF384 注：A 为盐、干旱和低温胁迫处理前表型以及 48 h 处理后表型。B 为盐、干旱和低温胁迫下 CsNCED2、CsERF38 和 CsDof5.4 的表达分析。基因表达量数据是用 3次生物学重复的平均值标准误差来表示，采用 Students test与对照进行显著性分析。（*，P0.05）Note:A,phenotypes before salt,drought and low temperature stress and after 48 h stress treatment.B,expression analysis of CsNCED2,CsERF38 and CsDof5.4 under salt,drought and low temperature stress.Gene expression data are expressed as mean standard errorof 3 biological replicates,significant differences were determined using Students test by comparison to control.(*,P 0.05)CsDof5.4 相关性 Correlation 1.00.80.60.40.20基因 Gene CsERF38 0.85 0.79 NaCl CsDof5.4相关性 Correlation 1.00.80.60.40.20基因 GeneCsERF380.450.77PEGCsDof5.4 1.00.80.60.40.20基因 Gene CsERF380.21 0.184 相关性 Correlation 3 期 李佳思，等：茶树 CsNCED2 启动子互作转录因子筛选及在非生物胁迫中的响应 333 还需进一步验证，但 CsERF38 和 CsDof5.4 在盐胁迫下与 CsNCED2 的表达高度相关，同时，CsERF38 的表达在干旱胁迫下与 CsNCED2 也高度相关，结合它们对 CsNCED2 表达的激活作 用，我 们 推 测CsERF38 能 通 过 调 控CsNCED2 的转录从而参与茶树对盐胁迫和干旱胁迫的响应过程，而 CsDof5.4 能通过调控CsNCED2 的转录参与茶树对盐胁迫的响应过程。本研究结果为茶树中 CsNCED2 响应盐胁迫和干旱胁迫的转录调控机制研究奠定了一定的理论基础。参考文献 1 Leung J,Giraudat J.Abscisic acid signal transduction J.Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,1998,49:199-222.2 Chen K,Li G J,Bressan R A,et al.Abscisic acid dynamics,signaling,and functions in plants J.Journal of Integrative Plant Biology,2020,62(1):25-54.3 Shu K,Chen Q,Wu Y R,et al.ABI4 mediates antagonistic effects of abscisic acid and gibberellins at transcript and protein Levels J.The Plant Journal,2016,85(3):348-361.4 Shu K,Chen Q,Wu Y,et al.ABSCISIC ACID-INSENSITIVE 4 negatively regulates flowering through directly promoting Arabidopsis FLOWERING LOCUS C transcription J.Journal of Experimental Botany,2015,67(1):195-205.5 陈唯,曾晓贤,谢楚萍,等.植物内源 ABA 水平的动态调控机制J.植物学报,2019,54(6):677-687.Chen W,Zeng X X,Xie C P,et al.The dynamic regulation mechanism of the end