论文格式纤维素降解菌的筛选及其发酵产酶条件研究.doc

纤维素降解菌的筛选及其发酵产酶条件研究李莹姝阎淑珍（南京师范大学生命科学学院，南京 210046）摘要：纤维素酶是一种分解纤维素的高活性生物催化剂，具有广泛的应用价值。为了获得高活性的纤维素降解细菌，对从南京师范大学北区枯叶堆及其附近土壤采集的样品进行富集和刚果红纤维素平板初筛，得到6株产纤维素分解酶的菌株，其中5株为细菌（B1、B3、B4、B8、B10），1株也许为真菌(B10)。通过水解圈复筛，得到两株产酶活性较高的细菌菌株B3、B10，通过细菌形态观测及生理生化鉴定，初步鉴定B3为革兰氏阳性杆菌（也许为巨大芽孢杆菌）、B10为革兰氏阳性杆菌。通过摇瓶发酵，测定其CMCase、FPA酶活力，结果表白B3和B10两菌株分别在培养第三天后所产CMC酶的活力达成最高，分别为55.09 U/mL和44.99 U/mL，并且两株菌均在培养基PH为8时酶活力最高。B3菌株基本没有FPA酶活力，B10菌株在培养三天后FPA酶活力达成最高104.14 U/mL,。可进一步通过紫外诱变育种等方法提高产酶量及酶活性，进行进一步研究。关键词：纤维素酶，微生物，筛选鉴定，酶活纤维素是自然界分布最广、最丰富、最便宜的可再生性有机资源和多糖物质，随着地球上不可再生资源日益耗竭，如何有效转化和运用这一丰富资源，成为各国关注的重要领域1。发展和运用生物技术分解转化天然纤维素原料，得到可运用的糖，再进一步转化为燃料乙醇、燃气等能源物质或者菌体蛋白等食品，成为当前国际研究的热点。2采用微生物技术解决这一问题是当前研究最多方法。目前研究较多的是霉菌, 尤以绿色木霉、里氏木霉和康氏木霉为典型3,对细菌研究较少。分离筛选可以高产纤维素酶, 有效降解纤维素的微生物菌种是应用纤维素材料的首要前提，高产降解纤维素细菌的获得、得到比较稳定的菌剂及应用于工农业上, 对解决当今世界所面临的粮食短缺、饲料资源紧张、能源危机和环境污染等问题具有深远的意义4。土壤中的微生物，大约70%90%是细菌。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约3-8cm的土壤层。因此，土壤取样时，一般要铲去表层土。此外，土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是由于在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。本实验从腐烂枯叶附近的土壤中分离筛选能降解纤维素的细菌，通过富集，刚果红初筛，水解圈大小复筛，测定菌株的CMC酶活力和FPA酶活力，从而得到产纤维素酶活力较高的两株菌，通过形态观测、生理生化实验初步鉴定菌种。1材料和方法1.1菌种来源采集：综合各种因素，本小组图样采集于南京师范大学仙林校区生地图书馆后的土壤。在不同的3个地点采样。土样1：腐烂叶下；土样2:竹叶下；土样3：背阳面枯叶堆。1.2 试剂与仪器DNS试剂（3，5-二硝基水杨酸），柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 68），碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH 9），0.51%羧甲基纤维素钠溶液（CMC），1mg/mL葡萄糖标准液。恒温培养箱、恒温烘箱，恒温水浴锅，控温摇床、全自动灭菌锅、电磁炉、微波炉、离心机、精密分析天平，托盘天平，721分光光度计，20mL具塞刻度试管，20ml试管， pH计（酸度计），容量瓶，移液管（0.5mL，2mL），小口瓶、烧杯、量筒等。1.3 培养基富集培养基：纤维素粉2.5g，NaNO3 0.5g，Na2HPO47 H2O 0.25g,KH2PO4 0.45g ,MgSO47 H2O 0.25g ,KCl0.25g ,酵母粉0.25g ，溶解定容至500ml；刚果红纤维素培养基：纤维素粉1.88g，MgSO47H2O 0.25g，K2HPO40.5g ，刚果红0.2g，琼脂14.0g，明胶2g，蒸馏水1000mL；刚果红纤维素钠培养基：CMC-Na 10g，酵母膏1g，琼脂15g，明胶2g，K2HPO4 0.5g，MgSO47 H2O 0.25g，刚果红0.05g，蒸馏水1000mL；酶活培养基(g/L): CMC-Na 5.0 g, 蛋白胨2.5 g, 酵母膏0.5 g, MgSO40.3 g, KH2PO42.0 g, NaCl 1.0 g,(NH4)2SO41.4 g, CaCl22H2O 0.3 g, FeSO47H2O 0.005 g,MnSO40.0016 g, ZnC120.0017 g,定容至1000mL , 自然pH；牛肉膏蛋白胨培养基（NA）：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂17.0g，水1000mL，pH7.07.2。牛肉膏蛋白胨培养基（NA）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂 15g，自来水稀释至1000 ml。1.4菌种的分离与纯化1.4.1样品解决目的菌富集：称取土样20g，在无菌条件下加入已灭菌的装有50ml培养基和6颗玻璃珠的250ml锥形瓶中，将瓶口塞好扎紧(8层纱布1层牛皮纸)，将瓶置于摇床上，在30下振荡培养3d。梯度稀释：用量程为1000L的移液管从富集培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充足混匀。然后换枪头从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-110-6不同稀释度的土壤溶液。1.4.2菌种初筛初将稀释倍数分别为10-5、10-6的样品溶液，在无菌条件下每个溶液取0.1ml分别涂布到刚果红纤维素培养基（刚果红纤维素钠培养基作对照）上，用涂0.1ml蒸馏水的两种培养基平皿做空白对照，28培养4d，选择四周有透明水解圈的菌株进行分离纯化。1.4.3分离纯化把菌种初筛得到的菌落分别在刚果红纤维素培养基上划线分离，为进一步纯化菌株共进行了两次此划线分离。并排除初筛时处在透明圈内但不产生纤维素酶的假阳性菌，得到纯培养。1.4.4菌种复筛将纯化后的菌株点接种到纤维素刚果红培养基上，每个培养基点四个点，28培养4d。用毫米刻度尺精确测量水解圈直径（H）和菌落直径（D），每个菌株选三个最接近圆形的菌落进行测量，没个菌落测三条直径，求得的H/C比值的平均值即可粗略代表各菌株的酶活大小，选取H/C比值最大的菌株进行进一步精确地酶活测定。1.5菌种鉴定在复筛选出的菌种中选出两个H/C比值最大的菌种，即B3和B10，进行生理生化鉴定。将菌株扩大培养，转接到NB培养基上，置于28恒温培养24h活化菌种。形态学的生理生化形状实验参考周德庆微生物学实验手册进行初步鉴定。51.6酶活测定1.6.1粗酶液的制备将筛选得到的纯菌株接种到50 mL 摇瓶培养基中, 于30C、160 r/min 摇瓶培养16 d。天天取出发酵液, 5000 r/min、4 C 离心20min, 取上清液即是细胞胞外酶液, 用于不同培养时间酶活力的测定。1.6.2 DNS法测定酶活力葡萄糖标准曲线：准确称取100mg恒重的葡萄糖，用蒸馏水溶解定容于100ml容量瓶中，配制成1mg/ml标准葡萄糖溶液，作为标准葡萄糖母液备用。按照表1完毕各试剂的添加及反映，取出冰水中冷却至室温后定容至10ml，分别在540nm下比色，记录吸光值，绘制葡萄糖标准曲线。表1 不同浓度的葡萄糖溶液管号12345678标准葡萄糖溶液(ml)0.00.20.40.60.81.01.21.4蒸馏水(ml)2.01.81.61.41.21.00.80.6DNS (ml)1.51.51.51.51.51.51.51.5摇匀后沸水浴7min，取出冷却蒸馏水(ml)16.516.516.516.516.516.516.516.5菌株CMC酶活力的测定: 在10ml试管中加入0.5ml酶液，对照组（A组）管加1.5ml DNS试剂，实验组（B、C、D组）不加；4组管一起50保温2min，同时分别加1.5ml不同PH含CMC-Na的缓冲溶液（PH 6.0、7.0 、8.0、9.0），50水浴酶解30min,实验组加1.5ml DNS试剂终止反映，沸水浴7min，冷却定容至10ml。以对照组试管溶液为空白对照，在波长540nm处测定吸光度并记录结果。根据上述平行实验组的平均值，在标准曲线上查出相应的葡萄糖含量，计算酶活力6。滤纸酶活力（FPA）的测定：在10ml试管中加入0.5mL酶液和1.5mL柠檬酸缓冲液，向对照组（A组）试管中加入1.5mlDNS试剂以钝化酶活性，作为空白对照，实验组（B、C、D组）先不加。将实验组和对照组试管同时在50水浴中预热5min，然后各加入50mg滤纸条（新华定量滤纸，1cm6cm，多张叠起来剪，卷成蓬松的卷，使可以淹没），50 C保温30min，取出后立即向对照组组试管中迅速加入1.5mL DNS试剂以终止酶反映。将4组试管充足摇匀后在沸水浴中加热8min，取出冷却后用蒸馏水定容至10mL。以对照组组试管溶液为空白对照，在波长540nm处测定吸光度并记录结果。根据上述平行实验组的平均OD值，在标准曲线上查出相应的葡萄糖含量，计算酶活力。酶活力定义：在50条件下，1ml酶液每分钟水解底物生成1ug葡萄糖的酶量，称为一个酶活力单位，以U/mL表达。酶活力计算公式如下：1个酶活力单位 X=(1000Cn)/T)式中：X:样品的酶活力（U/mL）；C：测试液中葡萄糖含量（mg/mL）；n：稀释倍数；T：水解时间（min）。2结果和分析2.1初筛及菌种纯化结果图1 产纤维素酶细菌的初筛部分结果 初筛培养基上部分菌落周边产生明显的透明圈，该菌落即为产纤维素分解酶微生物。通过初筛选出10株也许产纤维素酶的微生物。但有部分水解圈内有两个或多个菌落，无法分辨是哪个菌落产生的透明水解圈，也许存在不产酶的假阳性菌，需经进一步划线分离纯化拟定。初筛实验中，涂布在刚果红纤维素培养基上通过培养出现明显的透明圈，初筛效果较好；但涂布在刚果红纤维素钠培养基上并未产生明显的透明圈，筛选效果不好。通过两次分离纯化，排除假阳性菌得到了6株产纤维素分解酶的菌株即B1 ,B3 ,B4 ,B8 ,B10 ,B10。其中B10菌也许为共生真菌，菌落中央为红粉色，周边一圈为白色，培养一周后菌落呈霉状。表2 初筛及分离纯化结果土样编号初筛涂板稀释度菌株编号2-5B013-5B032-6B042-5B083-5B103-5B102.2复筛及鉴定结果表3 菌落H/C比值测量结果菌种编号透明圈直径平均值（H，mm）菌落直径平均值（C，mm）H/CB118.174.264.27B326.914.645.79B419.784.414.48B817.003.375.05B1026.392.5710.28B1012.442.185.71 表3所示为复筛的测量结果，从表中可以看出，在相同培养条件下通过相同的时间，H/C比值从平均4.38到10.57不等，最大的两株菌为B10和B03号菌株，H/C比值分别高达10.57和5.85，可作为进一步测定精确酶活力的菌株。 通过对B3和B10的菌种初步鉴定，B3菌株是革兰氏阳性菌，杆状，有芽孢，也许为巨大芽孢杆菌。B10号菌是革兰氏阳性杆菌。2.3酶活测定2.3.1葡萄糖标准曲线 按照表1操作，用分光光度法获得以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标所得的标准曲线回归方程：y=15.04X-0.039，R2=0.996。浓度X与吸光值Y之间呈良好的线性关系。2.3.2菌株CMC酶和FPA酶活力测定 用不同发酵时间粗酶液、不同PH值缓冲液配制的底物溶液，测定B3和B10两个菌株的菌株CMC酶活力。用不同发酵时间粗酶液测定两株菌FPA酶活力，结果见图2、图3、图4。3 讨论 纤维素酶的来源非常广泛，真菌、放线菌及细菌在一定条件下均可产生。本实验从枯叶堆下的土壤中筛选出六株可产生纤维素分解酶的菌株，其中有两株产酶活性较高，分别为一株革兰氏阳性芽孢杆菌B3（也许为巨大芽孢杆菌）和一株革兰氏阳性杆菌B10，两菌株分别在培养第三天后所产CMC酶的活力达成最高，分别为55.09 U/mL和44.99 U/mL，并且两株菌均在培养基PH为8时酶活力最高。B3菌株基本没有FPA酶活力，B10菌株在培养三天后FPA酶活力达成最高104.14 U/mL。吕静琳等8所筛选的纤维素分解菌LT-3产滤纸酶活最大可达33.37 U/ mL,孙军德等9所筛选的纤维素分解菌在第3天滤纸酶活力达成最大值为20.14U/ml,对比可知菌株B10产滤纸酶能力较强。滤纸酶活力可以代表菌株对于纤维素的综合降解能力。B10菌株具有很高的FPase活性，这表白该菌具有较完整的酶系，其产生的纤维素酶系具有较强的综合降解能力。 实验结果显示两菌株产纤维素酶活力在通过段时间达成峰值后会减少到很低，推测纤维素酶的产生与细菌的生长密切相关，后期酶活的减少也许与培养基消耗、菌体密度过高导致的细菌生长减缓有关。 纤维素酶是一种复合酶，涉及葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和葡萄糖苷酶。测定滤纸酶活大的优点是可以筛选到产生酶系较全，分泌各个酶组分比例较为协调的菌株。由于滤纸涉及结晶型和非结晶型纤维素，只有三种纤维素酶均有产生的菌株才有也许将其较好的降解。因此滤纸酶活力可以代表菌株对于纤维素的综合降解能力。B10菌株具有较高的FPase活性，这表白该菌具有较完整的酶系，其产生的纤维素酶系具有较强的综合降解能力，可进一步通过诱变或基因工程等手段提高其纤维素酶活力，具有相称广阔的理论价值和工业应用前景。自然状态下，纤维素的彻底降解是在微生物体系中多种微生物长时间互相作用的结果，这一过程仅靠一种微生物是无法实现的。这是由于分解纤维素的酶是由多种组分组成的酶体系。因此，在进行纤维素大分子降解的研究过程中要考虑到微生物的产酶体系之间的协同效应10。目前，微生物降解纤维素法还不可以普遍应用，一个很大的因素就是很多人都想找到一种高效的酶或微生物能充足运用纤维素，而忽略微生物的产酶体系之间的协同效应，很少部分人做运用微生物的产酶体系之间的协同效应降解纤维素的实验，结果也由于限制因素较多而不乐观，因此，要实现生物法降解纤维素的产业化，还需继续探索。若能进一步研究纤维素酶的协同作用, 应用混合发酵把天然纤维素, 如农作物秸秆、竹子纤维、城市废料、木材等中的纤维素, 转化为燃料、医药、食品及高科技纺织等行业的可运用资源, 这对当今高度重视的环境和生态问题将会有很大的研究前景和意义4,7。参考文献：1 朱建良，邱晔，陈晓晔，等.1株产纤维素酶真菌的鉴定及其酶学性质初探J.安徽农业科学，2023,36（21）：9044-9046.2 王全，李术娜，李红亚，等.产芽孢纤维素降解细菌XN-13菌株筛选及酶活力测定J.中国农业通报，2023,25（11）：180-185.3 吴敏峰, 耿秀蓉, 祝小, 等. 产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定J. 饲料工业, 2023, 27(20): 2124.4 高凤菊, 李春香. 真菌与细菌纤维素酶研究进展J. 唐山师范学院学报, 2023, 27(2): 710.5 周德庆.微生物学实验手册M.上海：上海科学技术出版社，1986:63-120.6 钱林，郑巧丽，付瑾，等。一株高效纤维素降解菌株的分离鉴定及其酶学性质J.微生物学通报，2023,37（4）：524-5287 Campbell CJ, Lallerrere JH. The end of cheape oilJ.Sci Am, 1998, 3: 7883.8吕静琳，黄爱玲，郑蓉等一株产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及产酶条件优化J生物技术，2023，19（6）：2629.9孙军德，陈南. 秸秆纤维素降解细菌的筛选及其产酶条件的研究J. 沈阳农业大学学报，202304，41(2)：210-213.10 Phil kersten ,Dan Cullen ,Extracellular oxidative systems of the lignin-degrading Basidiomycete Phanerochaete chrysosporium ,Fungal Genetics and BIOLOGY ,2023,44:77-87.