土壤中金霉素的降解--毕业论文.doc

毕业论文

题 目： 土壤中金霉素的降解

目录
1 前言 5
2 实验部分 5
2.1 仪器与试剂 5
2.1.1 实验仪器 5
2.1.2 实验试剂 6
2.2 标准物质及溶液配制 6
2.3 土壤样品的制备和提取 6
2.3.1 土壤样品的制备： 6
2.3.2金霉素的提取 6
2.4 HPLC-UV测定色谱柱：YP-ODS柱（C18柱）: 7
2.5 金霉素的降解试验 7
2.5.1 降解浓度的设立 7
2.5.2 土壤处理 7
2.5.3 称取土样 7
2.5.4 降解试验 7
3 实验结果与讨论 7
3.1 HPLC-UV色谱分析条件的确立与优化 7
3.2土壤样品提取条件的确定优化 9
3.3 降解试验结果 9
4 结论 11
5 资金支持 11
土壤中金霉素的降解

指导教师∶

（河北北方学院理学院化学系，河北 张家口 075000）

摘 要:建立了金霉素的高效液相色谱-紫外（HPLC/UV）测定法，采用室内模拟培养试验研究了金霉素样品在土壤中的动态变化以及降解情况.均质样品用PH4.0±0.5Mcllvaine-Na2EDTA 缓冲溶液提取，经超声、离心，水性膜过滤后，采用HPLC/UV 检测.金霉素在0.05~0.8μg /mL 浓度范围内线性关系良好，相关系数r均大于0.99.在0. 05、0. 10、0. 15 mg /kg 的加标水平下，回收率为86.44%~96.18%.结果表明，金霉素(添加浓度4mg/L，8mg/L，16mg/L)能在土壤中迅速进入降解，半衰期为1d，含量变化呈“ L ”型.

关键词:高效液相色谱；金霉素；土壤；降解

The degradation of chloroteracycline in soil
Yan Chengcheng
(Department of Chemistry，College of Science, Hebei North University，Zhangjiakou Hebei，075000, China)

Abstract: This paper developed the HPLC/UV to determine the residues of chloroteracycline in soil sample, and studied the dynamic changes and the degradation of chloroteracycline by the indoor simulation training test. Homogeneous samples were extracted by Mcllvaine-Na2EDTA buffer solution ( PH4.0 ± 0. 5) , was ultrasonic extracted and centrifuged, then the extractive solution was through the membrane filtration, and detected using HPLC/UV. The linear concentration of chloroteracycline ranged from 0.05 µg/mL to 0.8 µg/mL, and the correlation coefficient was above 0.99. The recoveries were 86.44% ~ 96.18%. The results showed that the chloroteracycline（dosage 4 mg/L, 8 mg/L, 16 mg/L） can quickly be degradated in soil and the changes of content showed "L" type.
Keywords: high performance liquid chromatography (HPLC); chloroteracycline; Soil; degradation

1 前言
金霉素( chloroteracycline，CTC) 属于四环素类抗生素药物，是由链霉菌产生的一类广谱抗生素，分子结构如图1所示，主要用于防治动物肠道感染和促进动物生长，在猪和肉鸡上应用最为广泛[1] .

图1金霉素分子结构
研究表明，动物饲喂四环素后，有 25% ～75% 甚至 70% ～ 90% 被排放到粪便废弃物中且不易被降解，并且在施用粪肥的土壤中长期持留[2] ，将给土壤带来严重的生态风险[3] .中国大多数规模化畜禽养殖场缺少环境治理和综合利用设施，畜禽粪便会不经妥善处理直接排入环境 .随畜禽粪便进入土壤的金霉素在土壤中的留存与分解状况不但可以预示这类抗生素的环境风险，而且可能影响作物的生长状况.目前研究主要集中在金霉素在某种畜禽粪便中的降解情况 或在粪肥及土壤中的吸附解吸情况[4] ，金霉素可被畜禽粪便强力吸附，在新鲜的粪肥中含量很高 ，中国 7 省、市、自治区的典型规模化养殖场猪粪中金霉素平均含量为 3. 57 mg·kg-1，最高达121. 78 mg·kg-1 ，经过堆腐处理后，其含量有所下降 ，自然光照下金霉素在鸡粪中的降解半衰期为 3. 24 d，降解率可达 97%[5,6] .外源添加纯品金霉素在土壤中降解过程主要发生在前 10 d，且对土壤酶活性有抑制作用 ，用动物排泄物施肥的土壤，0～40 cm 土层金霉素最大浓度高达 26. 4 mg·kg-1[7] .但有关于畜禽粪便中所含的金霉素进入土壤后的动态变化情况还鲜见报道.因此，本研究通过室内模拟培养试验方式，研究金霉素进入土壤后的动态变化规律及变化差异，并探讨其含量变化的机制，为环境的保护提供科学依据.
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
2.1.1 实验仪器
LC-2OAT 液相色谱仪，配SPD-20A 紫外可见检测器和CBM-102 色谱工作站（岛津有限公司）；
　　JJW-300 精密净化交流稳压电源（东方集团易事特公司）；
　　YP-ODS 色谱柱（150L×4.6）（岛津有限公司）；
　　DP-01 真空泵（Tianjin，Do-chrom technology Co. Ltd.）；
　　800 型离心沉淀器（上海手术器材厂）；
　　MS1 振荡器（IKA）（德国，IKA W公司）；
全套过滤玻璃设备;
电子天平（感量0.1mg）（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；
　　500mL 棕色试剂瓶，100mL容量瓶；
　　移液管(1mL、5mL、10mL、25mL、50mL)；
　　100mL 量筒；
　　5mL 全玻璃注射器；
　　50mL 烧杯若干；
　　10mL 聚丙烯试管若干；
　　0.45μm 水性滤膜；
　　一次性纸杯；
　　滴管；
　　吸耳球；
　　PH 试纸；
　　保鲜膜.
2.1.2 实验试剂
金霉素（CTC）标准品，纯度92.5%（德国进口）；
甲醇，液相色谱专用纯度，(天津市永大化学试剂有限公司)；
乙腈，色谱纯，(天津市永大化学试剂有限公司)；
柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、草酸，均为分析纯，（天津市北方天医化学试剂厂）；
纯净水，代替二次水，（天津市娃哈哈饮料有限公司）.
2.2 溶液配制
金霉素标准储备溶液:准确称取金霉素标准物质0.0108g 溶于甲醇（色谱纯），定容100mL，获得浓度为1.000mg/mL（1000mg/L）的标准储备液，4℃冷藏.临用前再按要求配成系列标准溶液.
金霉素标准工作溶液：准确移取一定体积的标准储备液，加水稀释，配制浓度为1、2、4、5、8、10mg/L溶液.
Mcllvaine-Na2EDTA 缓冲溶液( 提取液) ，分别称取12.9 g 柠檬酸、10.9 g 磷酸氢二钠、37.2 g 乙二胺四乙酸二钠，加900 mL 水溶解后，用1 mol /L 氢氧化钠溶液调pH 至4.0 ±0.5，加水稀释至1000 mL.
2.3 土壤样品的制备和金霉素的提取
2.3.1 土壤样品的制备：
土壤样品取自河北北方学院西校区实验田，土壤为耕作土层，采集土壤样品大于10Kg，自然风干、粉碎、缩分，获得实验土样2 Kg，土壤进一步自然风干，粉碎，过筛（100目，0.2mm）， 室温20℃烘干12h，将其全部放入密封袋中，以待备用.
2.3.2金霉素的提取
准确称取2 g 土壤样品于10mL 聚丙烯离心管中，准确加入Mcllvaine-Na2EDTA 提取溶液5mL，涡旋混匀2 min，超声提取5 min，以3500 r /min 离心10min 后，将上清液移入至另一10 mL 聚丙烯离心管中，残留物再加入5 mL 提取液提取1 次，3500 r /min 离心5min，合并提取液备用.准确移取上清液2mL过0.45µm的水性膜，进行HPLC/UV 分析.
2.4 HPLC/UV测定色谱柱：
色谱柱：YP-ODS柱（C18柱）
检测器：紫外检测器（UV），波长 355 nm
流动相：甲醇－乙腈（1:3，V/V）-0.01mol/L草酸（经过过滤处理）(4:6, V/V)，使用前超声脱气10min.
流速：1.0 mL/min
柱温：25℃
进样量：20 μL
2.5 金霉素的降解试验
2.5.1 降解浓度的设立
参考文献资料和金霉素的最大残留限量值（最大值600 mg/kg，肾），以及仪器检测结果设立了三个金霉素的药物的降解浓度，即4mg/L，8mg/L，16mg/L
2.5.2 土壤处理
试验前，准确称取500g 制备好的干燥的土壤加水至最大含水量的50%-60%，（最大含水量采用纸杯滴水法测定），混合均匀至于塑料袋中2h，使水分混合均匀.
2.5.3 称取土样
准确称取5g 处理好的土壤样品于干净的纸杯中，共称取90份，其中每个浓度做3次重复，每个浓度做9个点，共81份，同时做空白，共计90份,
2.5.4 降解试验
称取好的土样烧杯做好标记，添加相应浓度的药物标准溶液，然后用保鲜膜覆盖好，防止水分流失，在上面扎几个小孔，置于室温度稳定的环境中培养，所有样品采用称总重法每周调节含水量一次，根据标号分别在固定的时间内取出测定，（取样时间：0h、2h、5h、10h、1d、2d、5d、10d、15d），所取样品当天处理测定完成.

3 实验结果与讨论
3.1 HPLC/UV色谱分析条件的确立与优化
在采用HPLC/UV 检测金霉素时，为了有效地降低金霉素的去质子化作用，流动相一般选用酸性溶液，如磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸、乙酸、磷酸、草酸、甲酸等，其中最常用的是草酸和甲酸.由于实验过程中使用甲酸作流动相，存在基线漂移的现象，而且柱压明显升高，所以本实验使用草酸，但是配制流动相之前必须进行过滤！
流动相中的有机相，如甲醇、乙腈对金霉素的色谱分离和检测灵敏度有较大的影响.当流动相中只含有甲醇时，虽然分离度较好，但是洗脱速度慢；当流动相中只有乙腈时，虽然洗脱速度快，但是分离度变差.因此，在本实验中同时选用甲醇、乙腈和草酸作为流动相，其中草酸的浓度为0.1 mol/L.同时参考文献，确定了三者之间的比例.优化的流动相为甲醇/乙腈（1:3，V/V）-0.01mol/L 草酸（经过过滤处理）(4:6, V/V).在优化的色谱条件下，获得的金霉素的色谱图如图2所示.比采用此条件对浓度为1、2、4、5、8、10mg/L 的金霉素标准溶液进行测定，获得的标准曲线如图3所示，标准曲线方程为y=7256.1x+158.98，R²=0.9987符合所进行实验色谱分析的要求.

金霉素（Rt=2.85min）

图2 金霉素标准谱图

图3 HPLC/UV测定金霉素的标准曲线（n=3）
3.2土壤样品提取条件的确定优化
根据文献报导，土壤等样品中金霉素残留一般采用Mcllvaine-Na2EDTA 缓冲溶液提取，采用C18 固相萃取净化.对于本实验，由于处理样品量较大、分析时间需准确控制，防止继续降解，本研究探讨了不经净化，采用离心取上清液直接测定的方法对金霉素进行分析，获得了满意结果，金霉素HPLC/UV 测定不存在干扰.土壤样品HPLC/UV 色谱图见图4.同时对添加了三个浓度的土壤样品进行测定，测定的回收率见表1.
金霉素（Rt=2.85min）

图4 土壤样品中金霉素HPLC/UV测定的色谱图

表1 金霉素回收率（n=6）
土样编号
添加浓度(mg/L)
标准品平均峰面积
检测平均峰面积
回收率(%)
1
4
17460.4
14415.6±470
82.56%±2.7%
2
8
28753.2
26732.3±520
92.97%±1.8%
3
16
43732.5
42321.2±610
96.77%±1.4%

3.3 降解试验结果
根据降解实验设计，分别在0h、2h、5h、10h、1d、2d、5d、10d、15d 取出相应标记的土样进行金霉素含量的HPLC/UV测定.以降解时间为横坐标，以色谱峰面为纵坐标，绘制降解曲线.

图5 金霉素降解曲线

实验结果表明，不同浓度的金霉素在土壤中降解的动态变化趋势基本一致，均表现为培养前期含量迅速下降，中后期逐步稳定.到了一定时间后，低浓度的变化不明显，高浓度的则持续减少，但降幅有所减缓.通过实验可知金霉素的半衰期大约为一天，影响其降解的主要因素有金霉素的浓度、土壤与空气的接触面积.金霉素残留物进入环境后由于前期降解快，后期降解困难，从而造成土壤的污染，影响生态.由于后期试验金霉素降解缓慢，所以应该采取相关措施促进金霉素的降解（如可能的催化剂等）.从图中可知较高初始浓度组的金霉素降解速率均比较低初始浓度组慢.
4 结论
本实验建立了优化的HPLC/UV检测金霉素的方法，采用Mcllvaine-Na2EDTA 缓冲溶液提取，采用C18固相萃取净化.对于本实验，由于处理样品量较大、分析时间需准确控制，防止继续降解，本研究探讨了不经净化，采用离心取上清液直接测定的方法对金霉素进行分析，结果获得了满意结果，金霉素HPLC/UV测定不存在干扰.
金霉素在室内降解规律，在高浓度条件下能快速进入降解期，半衰期为1d，半衰期后降解速率减缓．降解曲线呈“L”型．
建议在后续的研究中可以对不同土壤湿度、光照对降解的影响，并加入对土壤灭菌前后的对照考察微生物对金霉素降解的作用.以对更深入的研究金霉素在土壤中的降解行为做出更合理的判断，对我们保护环境做出更大的贡献，为保护环境出谋划策.
5 资金支持
本课题得到河北北方学院课题“金霉素在栗钙土中的转归及对土壤微生物和白菜的生态毒性研究 2010”的资助.

参考文献：
[1]鲍艳宇，周启星，万 莹，等．2010．3 种四环素类抗生素在褐土上的吸附和解吸．中国环境科学，30( 10) : 1383 －1388．
[2]庞国芳，曹彦忠，张进杰，等.高效液相色谱法同时测定禽肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留的研究.分析测试学报，2005,24（4）：61-63.
[3]王敏，唐经春. 土壤中的抗生素污染及其生态毒性的研究. 第三届全国农业环境科学学术研讨会论文集. 2009年3月.
[4]刘伟，王慧，刘小军，杨大为，匡光伟，孙志良. 抗生素在环境中降解的进展. 动物医学进展，2009，30（3）：89-94
[5]薄海波，陈立仁. 固相萃取法提取、高效液相色谱-紫外检测法同时测定蜂王浆中土霉素、四环素、金霉素残留[J]. 中国卫生检验杂质，2004,14（6）：699-700.
[6]鲍艳宇. 四环素类抗生素在土壤中的环境行为及生态毒性研究. 2008.年8月.
[7]ai Y Q, Jiang G B, Liu J F, et al. Muliti-walled carbon nanotubes packed cartridge for the solid-phase extraction of several phthalate esters from watert samples and their determination by high performance liquid chromatography[J]. Anal. Chin. Acta,2003,494:149-156.
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致谢

在论文完成之际，首先衷心感谢指导老师和老师. 在课题的研究和论文的撰写过程中，给予细心的指导和帮助，指导实验过程中很多容易忽视的细节，帮助解决很多实验过程中遇见的难题，尤其是赵老师兢兢业业的工作精神，严谨的治学态度和高尚的人格使我钦佩不已，她的言传身教将使我受益无穷.
还要感谢分析实验室的老师平时对于实验的帮助，提供仪器并给于实验室安全的教育. 同时还要感谢所有的老师悉心的指导！感谢一起做实验的马文涛、杨普华同学，在实验过程中给予我很大的帮助，也向所有关心过和帮助过我的同学表示衷心的感谢.

2012.6.10

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