仓储小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测技术的优化_李瑞姣.pdf

第 3 期第 53 卷工业微生物基金项目：上海市科学技术委员会社会发展科技攻关项目（21DZ1201300）资助。作者简介：李瑞姣，女，硕士研究生，研究方向：农产品质量安全。E-mail:。*通讯作者：孟佳佳，女，博士，助理研究员，研究方向：农产品质量安全。E-mail:。仓储小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测技术的优化李瑞姣1,2，黄晴雯2，聂冬霞2，娄秀萍2,3，杨俊花2，韩铮1,2,3，孟佳佳2*1.上海理工大学健康科学与工程学院，上海 200093；2.上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403；3.上海海洋大学食品学院，上海 201306摘要：脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是小麦仓储过程中的重要危害因子，其污染水平是仓储公司定期检测的重要指标。为提高 DON 检测的平行性和准确度，文章对仓储小麦 DON 检测过程中样品制备和酶联免疫吸附法（ELISA）检测关键技术进行优化。结果表明：样品制备过程中，将扦样后的样品先粉碎再分样的处理方法（方法 2）明显优于先分样再粉碎的方法（方法 1），测定样品的相对标准偏差由 25.28%降至 7.42%。另外，将 ELISA 检测过程中两种不同的移液枪使用方法（前进移液法和反向移液法）进行比较，发现前进移液法在 10 次测定中结果相对标准偏差较小，平行性较好；且加样过程中，采用不贴壁加样方式会使检测值更加准确，平行性也较好。优化后的仓储小麦中 DON 毒素 ELISA 快速检测技术具有较好的平行性和准确度，可用于实际仓储小麦中 DON 毒素的准确、快速检测。关键词：仓储；小麦；脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）；酶联免疫吸附法（Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）doi：10.3969/j.issn.1001-6678.2023.03.029第 53 卷第 3 期2023 年 6 月工业微生物Industrial MicrobiologyVol.53 No.3Jun.2023脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），又 称 呕 吐 毒 素，是 由 禾 谷 镰 刀 菌（Fusariumgraminearum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）等霉菌产生的一种重要的单端孢霉烯族真菌毒素1。DON 具有急性毒性（引起腹泻、呕吐、直肠出血等）和慢性毒性（导致厌食、体重减轻、发育不良等），欧盟将其定为三级致癌物质。DON 主要污染小麦、玉米、大麦等谷物及其制品和副产品，污染地区遍布全球2-3，为人和动物的健康带来巨大的安全风险。小麦是我国主要的粮食作物，其储存周期较长，麦堆温湿度会随外界环境发生季节性变化，而水分含量高的地区更利于微生物生长繁殖引起谷物霉变，造成品质下降4-5。在仓储小麦真菌毒素筛查中发现，江苏地区的小麦比山东地区小麦 DON 污染严重得多，检出率高达 40.68%6。温晓燕等6对在上海地区采集的 119 份仓储小麦进行 DON 污染分析发现，检出率达 33.61%，质量分数为 2.88199.14 滋g/kg。我国作为小麦食用大国，高度重视 DON 污染问题，2013 年国家风险监测计划已将小麦粉中 DON含量的监测列为重点7-8。中国规定谷物中 DON 的最大残留限量为 1 000 滋g/kg9，欧盟委员会（EC 法规 1126/2007）将供人类直接食用的谷物中 DON 的最大残留限量设为 750 滋g/kg10。目前，DON 的检测方法主要包括超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）11、高效液相色谱法12、气相色谱法13、气相色谱串联质谱联用法14、酶联免疫吸附法（ELISA）15、电化学分析16等。其中，ELISA 检测方法以其操作简单、快速、低成本，且适用于大批量样品筛选等优点，愈发受到研究者的关注17，是目前仓储公司检测仓储小麦中 DON 等毒素最常用的方法，其检测基本过程（如图 1 所示）：使用120-第 3 期第 53 卷扦样器从粮仓不同部位采集小麦样品，扦样后的样品经混匀、分样、粉碎等过程制备成检测样品（即双试样，扦样样品混合均匀后由分样器分成约 1 kg 的次级样品，将所得的次级样品进一步用分样器分出两份质量相同的检测样品（每份约 100 g），粉碎后即为双试样），随后按照 ELISA 试剂盒上的操作步骤进行 DON 毒素含量的测定。但在仓储公司对储藏的小麦中 DON 毒素含量的实际检测过程中发现，双试样间的检测结果经常差别较大，且检测重复性差，难以判断 DON 毒素的真实污染水平。本研究针对仓储公司实际检测中遇到的问题，对其常用的检测方法中样品制备和 ELISA 检测过程中移液枪使用方法及加样方式的关键技术进行优化（图 1），并且将优化后的 ELISA 检测方法与实验室常用的 UPLC-MS/MS 检测方法进行比对验证。为解决仓储小麦中 DON 毒素检测平行性和准确度差的问题提供理论基础和数据支撑。1材料与方法1.1材料与试剂小麦样品采自上海浦江仓储有限责任公司，DON 标准品（100 滋g/mL），乙腈（色谱纯）；呕吐毒素ELISA 检测试剂盒。1.2仪器与设备酶标仪 Infinite M200，多管涡旋混匀仪 DMT-2500，电子天平，离心机，UPLC XEVOTQ-S 超高效液相色谱-串联质谱联用仪，Milli-Q 超纯水仪，分样器，扦样器。1.3扦样从上海浦江仓储有限责任公司的粮仓中采集小麦样品，平房粮仓装粮高度为 6 m 左右，本研究分为四层扦样，分别选择五个位置（西北角、东北角、西南角、东南角及中心点）的上层、中上层、中下层、下层作为本试验的采样点，每个点的扦样量不小于 3kg。1.4检测样品的制备将采集的 3 kg 扦样样品经混匀分样、粉碎等处理制备成检测样品。仓储公司常用的样品制备方法为：将扦样小麦样品用分样器分为 1 kg 次级小麦样品，再分成 2 份 500 g 的小麦样品（其中一份样品用于留样），另外一份 500 g 检测样品用分样器分出 2个约 100 g 的样品，将样品分别粉碎后得到双试样，用于检测其中 DON 的含量，如图 2 方法一所示。本试验对粮仓常用的样品制备方法进行了优化，优化后的样品制备方法为：将扦样样品用分样器分为 1 kg 的次级样品后，用研磨机全部磨粉，分成2 份 500 g 的小麦粉样品，其中一份用于留样，从另一份 500 g 小麦粉样品中取出 2 份 100 g 的小麦粉样品（即双试样），用于检测其中 DON 的含量，如图2 方法二所示。1.5样品 ELISA 试剂盒检测制备好的双试样按照 ELISA 试剂盒的操作步骤进行，检测其中 DON 毒素的含量。（1）提取从准备好的样品中，称取 5.00 g 样品置于 50mL 离心管中，每份样品重复三次。加入 25 mL 去离图 1仓储小麦中 DON 检测流程图3 kg 左右小麦样品扦样器仓储小麦粮仓研磨机研磨机样品1：约100 g样品1：约100 g（小麦粉）样品2：约100 g（小麦粉）样品2：约100g分样器分样器约500 g小麦样品（用于检测）约500 g小麦样品（用于留样）次级样品样品制备方法先分样再粉粹先粉粹再分样双试样提取移液枪使用方式移液枪加样方式前进移液法反向移液法枪头不接触孔壁枪头接触孔壁ELISA 检测小麦检测样品制备扦样李瑞姣等：仓储小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测技术的优化121-第 3 期第 53 卷工业微生物子水将其混匀；在振荡器上剧烈振荡 10 min，转速为 2 500 r/min；提取液置于离心机中室温离心 5min，转速为 4 000 r/min；取 1 mL 上清液，加入 4 mL去离子水，涡旋 1 min，待用。（2）ELISA 试剂盒检测从冰箱中取出 DON 毒素 ELISA 测试盒，待其温度恢复至室温。加标准品/样品：加标准品/样品 50 滋L/孔于对应微孔中，再加入 DON 酶标物 50 滋L/孔，最后加入DON 抗试剂 50 滋L/孔，轻轻震荡摇匀，用盖板膜盖板后置于 25 益避光环境中反应 30 min。洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用250 滋L/孔的洗涤液充分洗涤 45 次，每次间隔 10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。显色：加入底物液 A 液 50 滋L/孔，再加底物液B 液 50 滋L/孔，轻轻震荡摇匀，用盖板膜盖板后置于25 益避光环境中反应 15 min。测定：加入终止液 50 滋L/孔，轻轻振荡摇匀，设定酶标仪于双波长 450/630 nm 处检测，检测每孔吸光度（OD）值。1.5.1ELISA 试剂盒检测过程中关键技术的优化1.5.1.1 移液枪的使用在 ELISA 检测过程中移液枪的使用频率较高，所以其移取溶液的准确性直接影响到 DON 毒素含量检测结果。在确保移液枪性能良好的基础上，规范操作方法可以提高试验结果的可靠性。所以将移液器常用的两种移液方法（前进移液法和反向移液法）进行对比，在一定温度下称量 50 滋L 溶液的重量，每种移液方式进行 10 次重复操作，并对称量结果进行单样本 T 检验。使用移液枪的两种方法具体操作如下。前进移液法：将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回到原点；接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮直至第二停点吹出残余的液体，最后松开按钮。反向移液法：先按下按钮至第二停点，慢慢松开按钮回到原点；接着将按钮按至第一停点排出已设置好量程的液体，继续按住按钮使其保持在第一停点，取下有残留液体的枪头，弃之。如图 3 所示。图 3前进移液法和反向移液法示意图1.5.1.2 加样方式优化在 ELISA 检测过程中，加样方式是影响 ELISA检测结果准确性的重要因素。本试验分别采用枪头接触孔壁和枪头不接触孔壁两种不同的加样方式，图 2两种不同方法的样品制备流程图第一停点第二停点第一停点步骤 1：按置第一停点第一停点第二停点步骤 2：回置原点，吸取液体第二停点步骤 3：按置第二停点，排除液体前进移液法第二停点步骤 1:按置第二停点第一停点第二停点步骤 2：回置原点，吸取液体步骤 3：按置第一停点，排除液体反向移液法第一停点方法一：检测样品（500 g）分样器分样器分样器双试样（2伊100 g）检测研磨机小麦样品（2伊100 g）扦样（小麦 3 kg）留样样品（500 g）次级样品（小麦 1 kg）方法二：检测双试样（2伊100 g）检测样品（500 g）留样样品（500 g）小麦粉（1 kg）研磨机分样器次级样品（小麦 1 kg）扦样（小麦 3 kg）122-第 3 期第 53 卷李瑞姣等：仓储小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测技术的优化已知检测小麦样品中 DON 浓度为 150 滋g/kg，比较这两种加样方式的准确性，每种方式进行 3 次平行加样。1.6ELISA 方法与 UPLC-MS/MS 方法的比较本试验将优化后的 ELISA 检测方法与实验室常用的 UPLC-MS/MS 检测方法进行比对，以验证该方法的准确性。UPLC-MS/MS 检测方法为本研究所在实验室建立的方法18。称取 2.00 g 小麦粉于 50 mL离心管中，加入 20 mL 乙腈水（8416，V/V），超声30 min、涡旋 30 min、以 5 000 r/min 的速度离心 5min。取上清液 100 滋L，再加入 900 滋L 甲醇水（28，V/V），涡旋混匀 30 s，过 0.22 滋m 的滤膜，待测。色谱条件：色谱柱为 XBridge BEH-C18色谱柱（3.0伊100 mm，2.5 滋m）；流动相，流动相 A 为 5mmol/L 乙酸铵水溶液，流动相 B 为甲醇。梯度洗脱程序：03 min，30%B；35 min，30%B10%B；56min，10%B；66.1 min，10%B耀90%B；6.18 min，90%B；流速 0.4 mL/min；进样量 3 滋L；柱温 40益。质谱条件：采用电喷雾电离源正离子模式（ESI+）同时扫描；雾化气、辅助气均为高纯空气，碰撞气为高纯氮气；雾化气 50 Psi；辅助气 50 Psi；雾化温度500益；喷雾电压 5 500 V；喷雾电压气帘气 35 Psi；碰撞气 8 Psi。通过多反应监测（multiple reactionmonitoring，MRM）模式对目标化合物进行定量。DON真菌毒素的保留时间、母离子、子离子、碰撞电压等质谱参数如表 1 所示。表 1DON 质谱参数1.7统计分析酶标仪测得的数据由 Ridasoft Win.NET 软件进行数据处理分析。2结果与分析2.1样品制备方法的比较扦样后的样品采用 2 种不同的制备方法（见 1.4图 2）制备得到检测样品（双试样），每份样品重复测定 3 次，结果如表 2 所示。按照方法一制备得到的双试样经 ELISA 检测，双试样 1 的检测平均值为93.04 滋g/kg，双试样 2 的检测平均值为 151.45 滋g/kg，平均值的差值为 58.41 滋g/kg，双试样标准偏差SRSD高达 25.28%。而优化后的样品制备方法（方法二）制备得到双试样后，所测双试样平均值差值较小，仅为 5.03 滋g/kg，双试样标准偏差 SRSD为 7.42%。优化后的样品制备方法测得的 DON 毒素含量平行性较高。表 2方法一和方法二制备得到的双试样 DON 检测结果对比2.2ELISA 检测关键技术优化2.2.1移液枪移液方式本试验对比了前进移液法和反向移液法两种不同移液方式的准确性，结果见表 3，前进移液法相对标准偏差为 0.21%，反向移液法相对标准偏差为0.37%。前进移液法与反向移液法相比相对标准偏差较小，且反向移液法移取液体的质量与真实值差距较大，因此，采用前进移液法可以使结果更加准确。表 3前进移液法和反向移液法差异对比真菌毒素缩写保留时间/min母离子（m/z）子离子（m/z）碰撞电压/eV脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON2.61297.1231.1*/149.113/10样品重复DON 含量/（滋g kg-1）方法一方法二双试样 1182.97132.47292.26117.093103.90147.81平均值93.04132.46双试样 21150.62137.782165.83144.113137.91130.56平均值151.45137.48双试样平均值差值58.415.03双试样相对标准偏差/%25.287.42次数前进式移液法/mg反向式移液法/mg149.8850.84249.9750.24349.9950.54449.9650.34549.8850.32650.1350.42750.2450.33850.0950.20949.9850.231050.0050.22平均数50.0150.37相对标准偏差/%0.210.37123-第 3 期第 53 卷工业微生物2.2.2加样方式优化分别采用接触孔壁和不接触孔壁两种加样方式，对小麦中 DON 含量为 150依10 滋g/kg 的样品进行检测，结果如表 4 所示。采用接触孔壁加样方式测得结果平均值为 86.40 滋g/kg，与其真实含量（150依10 滋g/kg）相差较大；而采用不接触孔壁加样方式测得结果平均值为 148.47 滋g/kg，与其真实含量（150 滋g/kg）结果较为接近；说明不接触孔壁加样方法的测量检测结果准确度更高。另外，接触孔壁方式的测量结果相对标准偏差为 6.63%，大于不接触孔壁测量结果的相对标准偏差（3.32%），也进一步说明，不接触孔壁的方法其测量重复性相对较好。表 4枪头接触孔壁对 DON 检测结果的影响2.3ELISA 方法与 UPLC-MS/MS 方法的比较本试验采用 ELISA 法和 UPLC-MS/MS 法对DON 浓度为 2.30依0.17 mg/kg 的小麦样品进行检测，并将 ELISA 法与 UPLC-MS/MS 方法检测结果进行比较，评价 ELISA 方法检测结果的可靠性，结果如表 5 所示。ELISA 法检测结果平均值为 2.32 mg/kg，相对标准偏差为 2.43%；UPLC-MS/MS 法检测结果平均值为 2.39 mg/kg，相对标准偏差为 2.17%。ELISA 和 UPLC-MS/MS 两种方法检测结果的平均值和相对标准偏差相差不大，证明优化后的 ELISA检测方法的准确度高、平行性较好，可用于实际样品的检测。表 5实际样品 ELISA 和 UPLC-MS/MS 检测结果对比3讨论谷物在储存过程中，其中有少部分颗粒受到产毒真菌的污染，导致真菌毒素含量较高，而其余未被污染部分真菌毒素含量相对较低，所以真菌毒素在谷物中分布不均匀现象的出现容易造成检测结果产生较大偏差。在实际检测过程中，将不同扦样点的样品混合成大样，整体粉碎后再检测真菌毒素含量是不切实际的1923。因此，样品制备是保障真菌毒素准确检测的一个重要环节。王松雪等23先将大样粉碎再进行次级样品取样检测发现能够减少检测误差。同样，Spanjer 等24也证明了将样品先粉碎再分样可以提高真菌毒素的均一性。本研究通过对比先分样后粉碎和先粉碎后分样两种不同的样品制备方法，检测双试样的平行性，得出先粉碎后分样方法取得的检测结果平行性好，能够使 DON 在谷物中均匀分布，更加准确地分析 DON 的污染水平，解决了实际谷物样品中双试样平行性差的问题。移液枪是实验室中常用的定量移液器具，其操作的准确性直接影响着最终的检测结果25。ELISA检测过程中移液方式的不同对真菌毒素检测准确性有一定的影响26，因此掌握规范化的要领、严格按照相关技术要求操作是对检验人员的基本要求。通常移液枪有两种移液方式，即前进移液法和反向进移液法26-27，在本试验中前进移液法准确性要高于反向进移液法，这是因为反向移液法时常会在枪头留有部分液体，导致每次加样不能保持一致，从而影响检测结果的准确性。另外，ELISA 检测过程中移液枪加样方式的不同，也会对检测结果产生一定的影响。李世凤等26指出，加样时不能将样品滴在孔壁上，避免由人为因素造成试验结果不准确。林萍萍、李红叶等也同样提到每次加样应加在板孔的底部，避免样品残留在孔壁上对试验结果产生影响28-30。在本研究中，接触孔内壁的测定结果与真实值相差较大，而不接触孔壁的加样方式测定结果更加准确。4结论本研究优化了仓储小麦 DON 毒素 ELISA 检测过程中的关键技术，包括检测样品制备、ELISA 检测过程中移液枪的使用及移液枪的加样方式。将优化后的 ELISA 检测方法与常用的 UPLC-MS/MS 检测重复接触孔壁/（滋g kg-1）不接触孔壁/（滋g kg-1）188.10150.62278.69153.14392.42141.64平均值86.40148.47相对标准偏差/%6.633.32检测方法ELISA/（mg kg-1）UPLC-MS/MS/（mg kg-1）12.242.3222.322.4232.382.44平均值2.322.39相对标准偏差/%2.432.17124-第 3 期第 53 卷方法进行比较，表明该检测方法准确、可靠，可用于实际样品检测分析，为仓储小麦 DON 污染检测提供技术支撑，推动 ELISA 检测技术进一步发展。参考文献1 王梦晨,张勇,刘来亭,等.饲料及饲料原料中呕吐毒素检测的研究进展 J.饲料研究,2022,45(9):152-155.2SILVA M V,PANTE G C,ROMOLI J C Z,et al.Occurrence and risk assessment of population exposed todeoxynivalenol in foods derived from wheat flour in BrazilJ.Food Additives&Contaminants:Part A,2018,35(3):546-554.3 BRYLA M,KSIENIEWICZ-WOZNIAK E,WASKIEWICZA,et al.Natural occurrence of nivalenol,deoxynivalenol,and deoxynivalenol-3-glucoside in polish winter wheatJ.Toxins,2018,10(2):81.4 ABEDI-TIZAKI M,ZAFARI D M.Natural occurrence ofdeoxynivalenol and its acetylated derivatives in wheat innorth of Iran J.Journal of Plant Pathology,2015,97(3):431-437.5 夏培培,张祎.小麦呕吐毒素含量与安全储藏关系探讨J.现代面粉工业,2022,36(2):10-13.6 温晓燕.仓储小麦和稻谷中主要真菌毒素污染水平及快速识别技术研究 D.上海:上海海洋大学,2021.7 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parallelism and accuracy of DON detection,the paper optimizes thekey technologies of sample preparation and enzyme-linked immunosorbent(ELISA)detection during the DON detection of storedwheat.The results show that during the sample preparation process,the treatment method of first crushing and then dividing thesamples after sampling(Method 2)is significantly better than the method of first sizing and then pulverizing(Method 1),and therelative standard deviation of the measured samples is reduced from 25.28%to 7.42%.In addition,comparing two different methodsof using pipette guns(forward pipette method and reverse pipette method)in the ELISA detection process,it was found that theforward pipetting has shown a better repeatability and parallelism in 10 assays;In the process of dosing in ELISA test,the detectionvalue is more accurate and parallelism is better by using the non-adherent sample method.The optimized ELISA rapid detectiontechnology of DON in stored wheat has good parallelism and accuracy,which can be used for accurate and rapid detection of DON inactual storage wheat.Key wordsstorage;wheat;deoxynivalenol;ELISAOn the ELISA Detection Technology of Deoxynivalenol in Wheat During StorageLI Ruijiao1,2，HUANG Qingwen2，NIE Dongxia2，LOU Xiuping2,3，YANG Junhua2，HAN Zheng1,2,3，MENG Jiajia2*1.College of Health Science and Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 2000932.Institute for Agro-food Standards and Testing Technology,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai Academy ofAgricultural Sciences,Shanghai 2014033.College of Food Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306126-