CD40基因多态性与高血压性心脏病的相关性分析.pdf

CD40 基因多态性与高血压性心脏病的相关性分析戚南昌，蒋金梅，黎海生，徐敏，杜娜，杜艳2云南医药2 0 2 4年第45卷第2 期论著（1.昆明市第一人民医院检验科，云南昆明6 50 10 0；2 昆明医科大学第一附属医院检验科/云南省实验诊断研究所云南省检验医学重点实验室，云南昆明6 50 0 32；3.云南省中医医院检验科，云南昆明6 50 0 2 1）【摘要目的本研究旨在探究CD40两个SNP位点rs4810485和rs1883832的多态性是否与HHD的遗传易感性有关。方法采用PCR-RFLP方法对CD40基因的rs4810485和rs1883832SNP位点进行基因分型。结果CD40基因rs4810485的GG基因型和 G等位基因在高血压性心脏病中显著增高，G等位基因为高血压性心脏病的易感基因。结论GG基因型在HHD 中显著增高，G等位基因为HHD的易感基因。关键词高血压心脏病；CD40；单核苷酸多态性；等位基因【中图分类号】R541.3Analysis on the correlation analysis between CD40 gene polymorphismQI Nanchang,JIANG Jinmei,LI Haisheng,XU Min,DU Na,DU Yan?(1.Deqartment of Uinical Laboratory,The First Peoples Hospital of Kunming,Kunming Yunnan 650100,China;2.Clinical Lab,The First Afiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming Yunnan 650032,China/Yunnan,Experimental Diagnostic Institute/Yunnan Key Laboratory Medicine,Kunming Yunnan 650032,China;3.Deqartment of Uinical Laboratory,Yunnan Traditional Chinese Medicine Hospital,Kunming Yunnan 650021,China)Abstract:Objective The aim of this study was to investigate whether polymorphisms in two SNPS of CD40,rs4810485 andrs1883832,are associated with genetic susceptibility to HHD.Methods rs4810485 and rs1883832 SNPS of CD40 gene were genotyped byPCR-RFLP.Results The CG genotype of CD40 gene rs4810485 and the G allele were significantly increased in hypertensive heartdisease,and the G allele was a susceptibility gene for hypertensive heart disease.Conclusions The GG genotype is significantly increasedin HHD,and the G allele is the susceptibility gene for HHD.Key words:hypertensive heart disease,CD40,single nucleotide polymorphism,allele高血压性心脏病（hypertensive heart disease，HHD）的特征包括左心室肥厚，心脏舒张功能障碍及心肌弥漫性间质纤维化1-3。高血压患者长期慢性压力过载似乎会导致基因表达的改变，从而导致肌细胞肥大和细胞外基质的改变4，这种细胞外重塑的最终结果导致心肌纤维化，并增加心力衰竭（Heart fail-ure,HF）发展的风险。CD40是一个跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子（T NF）受体超家族，表达于免疫细胞，如B淋巴细胞（Blymphocytes，B细胞）、树突状细胞（Dendriticcells，D C）、单核细胞和巨噬细胞，是联系免疫、炎症、高凝状态三者间的桥梁6-8 。CD40 存在核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNPs）。此 SNPs主要与自身免疫性疾病、心血管疾病的易感性相关 。此SNPs可能是未来心血管疾病防治的重要靶收稿日期：2 0 2 3-0 7-2 0*基金项目：云南省基础研究计划中医联合专项青年项目【2 0 19 FF002（-0 8 1）；云南省基础研究计划中医联合专项面上项目(202101AZ070001-205)。作者简介：戚南昌（19 9 0）男，本科，主治医师，从事血液系统疾病研究工作10 余年。通讯作者：杜艳，E-mail：d u y a n _m 139.c o m。文献标志码 Aand hypertensive heart disease1资料和方法1.1一般资料本研究对本院2 0 19 年6 月2 0 2 3年1月收治的422名患者进行研究。其中2 11名血压正常人群作为对照组，对照组男性114名，年龄2 8 8 4岁（52.512.4），女性9 7 名，年龄358 7 岁（58.6 14.7)；2 11名确诊为高血压心脏病的患者作为观察组，观察组男性6 1名，年龄2 8 8 4岁（52.512.4），女性150 名，年龄358 7 岁（58.6 14.7）。观察组的文章编号10 0 6-4141(2 0 2 4)0 2-0 0 0 5-0 4点10。因此，本文通过聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（Polymorphism chain reaction Restrictiononfragment length polymorphism,PCR-RFLP）对 CD40rs4810485和rs1883832两个位点进行基因分型，旨在探究 CD40两个位点 SNPs与高血压性心脏病的遗传易感相关性，现报道如下。6：纳人标准为：（1）高血压心脏病患者符合美国2 0 17年成人高血压预防、诊断、评估和管理指南；（2）患者已签署知情同意书；（3）本研究得到昆明市第一人民医院医学伦理委员会的批准。排除标准：（1）合并认知功能障碍、精神疾病者；（2）合并自身免疫性疾病、肝功能衰竭、肾功能衰竭患者；（3）合并恶性肿瘤、淋巴瘤、白血病、病毒性心肌炎者；（4）非高血压引起的心力衰竭者；（5）合并重症感染、脓毒血症者。所有研究对象通过问卷调查记录观察组和对照组的年龄、性别、BMI、收缩压、舒张压、吸烟、糖尿病史等数据。通过检验确定受试者：Crea、H D L-C、LD LCT G、甘油三酯、超敏 C反应蛋白（highsensitivity C-reactive protein，h s -CRP)。CD 40 的SNPs从公共数据库中基于其位置和功能方面选择。1.2外周血 DNA的提取采取观察组与对照组晨起空腹外周静脉血3mL于乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，ED-TA）抗凝管中，用全血DNA商品试剂盒提取基因。所使用的试管、移液管、小型的离心管（Eppendorf,EP）均经高压灭菌处理。操作步骤（严格按照说明书执行）。1.3引物的设计与合成CD40两种SNPs，CD 40（r s 18 8 38 32）上游引物序列，5-RCCCGCCCTCTGAACCCCCTACCAGT-3，下游引物序列，5CCCCGATAGGTGGACCGCGATTGGT-3；CD 40（r s 48 10 48 5）上游引物序列，5GC-CCCCCTTTACCTCTTTCCA3，下游引物序列，5-TATTTTTGTAGTTCCTCATTCTGGA-3。1.4PCR扩增条件PCR在2 5L的总体积中进行，包含10 Buffer2.5L,25 mmol/L MgCl,2 L,10 mmol/L dNTP 0.5L，10 mmo l/L上游引物和下游引物各0.5L，T a q D-NA聚合酶（5U/L）0.2 L，模板DNA5L，双蒸水13.8 L。按以下条件完成反应：9 4预变性5min，9 4变性2 0 s；52 退火30 s；7 2 延伸30 s；循环36 次后再7 2 延伸5min，4冰箱保存。1.5扩增产物的酶切取10 L扩增产物，加限制性内切酶Ncol或者MspI5L，37 作用2.5h后，2.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶（Ethidiumbromide，EB）染色，然后使用凝胶成像系统进行拍照。CD40基因rs1883832被限制性内切酶 NcoI 酶切后有 3 种基因型：CC 基因型（10 3b p、18 0 b p 2 条带）、TT基因型（2 8 3bp1条带）、CT基因型（10 3bp、18 0 b p、2 8 3b p 3条带）。rs4810485被限制性内切酶MspI酶切后的3种基因型：GG基因型（132 bp、37 3b p 2 条带）、CC基因型（50 5b p 1条带）、CG基因型（132 bp、37 3b p、50 5b p3条带）。云南医药2 0 2 4年第45卷第2 期1.6统计学方法CD40基因 rs4810485和 rs1883832 SNPs的基因型和等位基因分布采用检验，P0.05为有统计学意义；采用t检验对观察组与对照组的生化指标进行分析。根据哈迪温伯格平衡（HardyW e i n b e r g e q u i-librium，H W E）分析CD40多态性rs4810485和rs1883832在观察组和对照组中的基因型及基因频率变化。相关数据分析均使用SPSS23.0完成。2结果2.1观察组与对照组一般临床特征与对照组的一般临床特征比较，观察组的性别、年龄、遗传病史、糖尿病、收缩压、舒张压、BMI、Crea、H D L-L、LD L-L、T G、h s -C RP 等临床特征及实验室检查差异均有统计学意义（P0.05），见表1。表1观察组与对照组的一般特征对照组观察组指标(n=211)男n(%)63(29.9)收缩压（mmHg)107 8舒张压（mmHg)805BMI(kg/m)21.5 1.6吸烟n（%)61(28.9)糖尿病n(%)36(7.37)HDL-C(mmol/L)1.3 0.3LDL-C(mmol/L)2.3 0.7TG(mmol/L)1.4 0.6Hs-CRP(mmol/L)1.8 1.3Crea(mol/L)76.3 22.983.3 39.5注：BMI：身体质量指数；Crea：肌酐；HDLC：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；TG：甘油三酯；Hs-CRP：超敏C反应蛋白。2.2（CD40rs1883832位点和rs4810485位点的酶切结果rsl883832位点的酶切结果：CD40基因rs1883832位点上有C或T碱基的变化，经限制性内切酶Ncol酶切后有3种基因型：CC基因型（10 3bp、18 0 b p 2条带）、TT基因型（2 8 3bp1条带）、CT基因型（10 3b p、18 0 b p、2 8 3b p 3条带）。rs4810485位点的酶切结果：CD40基因rs4810485位点上有C或G碱基的变化，经限制性内切酶MspI酶切后有3种基因型：GG基因型（132 bp、37 3b p 2 条带）、CC基因型（50 5b p 1条带）、CG基因型（132 bp、37 3b p、50 5b p3条带），见图1。2.3观察组与对照组中CD40rs1883832位点、P(n=211)114(54.0)153 1790 1422.8 2.258(27.5)33(13.92)1.2 0.32.7 0.91.8 1.36.9 3.10.0010.0010.0010.0010.7460.0010.0010.0010.0010.05）。CD40 基因rs1883832 的基因型与等位基因频率在观察组与对照组间无显著差异。CD40 基因rs4810485 的GG基因型在观察组与对照组之间有显著差异（P0.05等位基因C25259.72%26161.85%0.589T17040.28%16138.15%rs4810485基因型GG9745.97%6430.33%10.936 0.05等位基因G27464.93%22753.79%10.849 0.001T14835.07%19546.21%注：n代表样本量；F为基因频率%。2.4观察组和对照组的联合基因型和单倍型频率观察组和对照组的联合基因型和单倍型频率，其中 GG-CC、G T-CT 联合基因型在观察组与对照组之间有显著差异（P0.054822.75%62.9670.085P0.05GT-CT基因频率为2 9.38%，明显低于对照组的40.76%，见表3。F表3观察组和对照组CD40 rs4810485和rs1883832基因多态性的联合基因型和单倍型分布联合观察组(n=211)基因nGG-CC80GG-CT30.450GG-TTGT-CCGT-CTGT-TT0.061TT-CCTT-CTTT-TT单倍型G-C245G-T30.71%T-C44T-T130注：n代表样本量；F为基因频率%。对照组（n=211)Fn37.91%531.40%800.00%209.48%6229.38%00.00%83.80%83.80%3014.22%n=42258.06%10.43%30.81%PF25.12%3.80%00.00%3014.22%8640.76%0.01400.00%52.37%41.90%2511.85%n=42223054.50%0.29881.89%4410.43%14033.18%0.0050.1271.0000.1321.0000.3980.2410.4700.1291.0000.46183讨论高血压是多种遗传变异加上环境和其他因素导致的疾病，而高血压性心脏病是长期高血压导致的结果，其特点是在没有其他原发性心血管异常的情况下，心肌结构和功能发生改变 。CD40是一种I型跨膜糖蛋白，是肿瘤坏死因子家族受体超家族成员。研究表明CD40 及其相关的信号通路可能参与高血压并发心脏病这一过程12 。观察组与对照组临床情况比较结果显示：CD40C/T，G/C 基因多态性中性别、年龄、遗传病史、糖尿病、收缩压、舒张压、BMI、肌酐、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、超敏C反应蛋白等因素是高血压性心脏病的独立危险因素，与张记收等13 基于2019年全球疾病负担研究数据分析19 9 0 2 0 19 年中国高血压性心脏病疾病负担变化趋势及危险因素研究结果一致。CD40 基因 SNPs位点 rs4810485 等位基因 G 在病例组中分布频率显著高于对照组，提示 CD40 基因SNPs 位点rs4810485可能是高血压性心脏病的风险性因素。有学者研究表明欧洲人群风湿性关节炎及系统性红斑狼疮中的研究显示该位点等位基因G与疾病风险显著相关14。云南地区也有学者张新文等15 研究表明 G等位基因与 2 型糖尿病显著相关。Vazgiourakis等16 的研究表明rs4810485可能与CD40的表达水平具有相关性。结合血清CD40表达水平的检测结果，本文推测G等位基因可能对CD40的释放起到促进作用，从而增加了血清或血浆中CD40的表达，但这仍需要进一步实验验证。CD40基因的2 个SNPs位点连锁分析发现，连锁基因 GG-CC 可以增加高血压心脏病的患病风险，而 GT-CT基因可以降低高血压性心脏病的患病风险。该研究结果与 rs4810485 等位基因 G是高血压性心脏病发生的风险因素相一致。郑倩等17 研究显示CTLA-4+49A/G基因多态性与云南本地区汉族人群相关。遗憾的是本研究中民族因素并未列入作为研究内容。综上所述，本文发现GG基因型在高血压性心脏病中显著增高，G等位基因为高血压性心脏病的易感基因。参考文献：1 Nwabuo CC,Vasan RS.Pathophysiology of Hypertensive HeartDisease:Beyond Left Ventricular Hypertrophy J.Curr Hy-pertens Rep,2020 Feb 3;22(2):11.2李晓丹,陈炎,刘家祎，等.心脏磁共振成像在高血压性心脏病的应用价值J.心肺血管病杂志,2 0 19,38（12：1309 1312.3杨朝霞,周宁,唐大中，等.心脏MRI特征追踪技术早期评价高血压性心脏病左心室亚临床功能障碍的研究J.中云南医药2 0 2 4年第45卷第2 期华放射学杂志，,2 0 2 1,55（3）：2 57-2 6 3.4 Slivnick J,Lampert BC.Hypertension and Heart FailureJ.Heart Fail Clin,2019 Oct;15(4):531-541.5 Stacey RB,Hundley WG.Integrating Measures of MyocardialFibrosis in the Transition from Hypertensive Heart Disease toHeart FailureJ.Curr Hypertens Rep,2021 Apr 21;23(4):22.6 Kusters PJH,Lutgens E,Seijkens TTP.Exploring immunecheckpoints as 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