超高效液相色谱-串联质谱法测定奈玛特韦及利托那韦血药浓度.pdf

超高效液相色谱串联质谱法测定奈玛特韦及利托那韦血药浓度范菁唐昊翔王银辉范炜斌谢姣林彬(.浙江省长兴县人民医院药学部长兴.湖州市智能药学与个体化治疗重点实验室长兴.浙江省长兴县疾病预防控制中心长兴.西安交通大学附属第二医院药学部西安)摘 要 目的 建立一种具有高灵敏度、高稳定性并且通用性强的能同时测定人血浆中奈玛特韦和利托那韦血药浓度的超高效液相色谱串联质谱法 方法 分离色谱柱采用 柱(.)采用梯度洗脱流动相为 乙腈.甲酸流速为.柱温为 进样量为 以电喷雾离子()作为离子源多反应监测模式扫描(奈玛特韦/.奈玛特韦/.利托那韦/.利托那韦/.)选择 年 月于长兴县人民医院接受奈玛特韦/利托那韦治疗的新型冠状病毒感染患者 例测定其用药 后的奈玛特韦和利托那韦稳态谷浓度 结果 人血浆中奈玛特韦及利托那韦的线性范围分别为.(.)和.(.)奈玛特韦和利托那韦的回收率均批内以及批间精密度的相对标准差()均 ()岁新冠病毒核酸检测或抗原检测结果阳性本人或家属签署知情同意书 排除标准:擅自中断或更改药物剂量 周内服用细胞色素 酶或 糖蛋白抑制剂或诱导剂.用药方法与结果检测收集长兴县人民医院 年 月服用奈玛特韦片/利托那韦片治疗的新冠患者血液标本共计 例 该研究已通过长兴县人民医院伦理委员会审批()伦审药/械/研第(号)例患者均接受奈玛特韦/利托那韦口服治疗其中奈玛特韦、利托那韦 根据奈玛特韦以及利托那韦的半衰期计算连续给药在 后血药浓度达稳态 于第 天给药前半小时采血血样收集于血浆分离胶采血管中离心取上清液进行血浆预处理后分析检测 结果.方法学专属性考察 选取 份不同的空白血浆、已加入定量下限的血浆样品、来自服用奈玛特韦片/利托那韦的患者稳态谷浓度血浆样品按血浆样本处理流程处理后进行分析检测色谱图见图 奈玛特韦及其内标奈玛特韦的保留时间均为.利托那韦及其内标利托那韦的保留时间均为.人血浆中内源性物质在保留时间内的响应值明显低于.空白血浆.定量下限的血浆样品 服用奈玛特韦/利托那韦患者的稳态谷浓度血浆样品图 奈玛特韦和利托那韦的典型质谱图.定量下限的 且不干扰目标峰的分析.标准曲线与线性范围 以奈玛特韦或利托那韦的浓度为横坐标()血浆样品测得的峰面积与各自内标物奈玛特韦或利托那韦峰面积比()进行线性回归并绘制标准曲线得到奈玛特韦标准曲线方程为:.线性范围为.利 托 那 韦 标 准 曲 线 方 程 为:.线性范围为.奈玛特韦定量下限为.利托那韦定量下限为.精密度与准确度按照血浆样品处理流程操作分别配制定量下限、低、中、高质控 个浓度的血浆样本每一浓度重复配制 次分别检测 连续 结果见表 结果显示奈玛特韦与利托那韦在各质控浓度及定量下限浓度的准确度均在内 奈玛特韦批内精密度范围为.利托那韦批内精密度.奈玛特韦批间精密度范围为.利托那韦批间精密度.精密度和准确度符合中华人民共和国药典的相关技术要求.提取回收率 在 个质控浓度(低、中、高)下评价奈玛特韦以及利托那韦的提取回收率 将各质控浓度的血浆样本处理后进样分析得到峰面积 另取空白血浆按血浆处理流程将混合内标工作液替换成等体积的含有.甲酸的乙腈甲醇()加入对应浓度的奈玛特韦、利托那韦及内标进样分析得到峰面积 提取回收率()为峰面积 与峰面积 的比值 结果见表 奈玛特韦和利托那韦的提取回收率均.基质效应考察 份不同来源的空白血浆对奈玛特韦与利托那韦各质控浓度(低、中、高)的影响空白血浆进行血浆样本处理后添加相应浓度的奈玛特韦、利托那韦与内标溶液进行分析得到峰面积()相应浓度的奈玛特韦、利托那韦与内标纯溶液进样分析得到峰面积()基质效应()/结果见表 奈玛特韦的基质效应为.利托那韦的基质效应为.残留效应取定量上限血浆样本(奈玛特韦:利托那韦:)进样每次进样后进空白血浆平行 次残留效应进样定量上限后的残留峰面积/定量下限峰面积 结果显示定量上限浓度点后的空白血浆在奈玛特韦、利托那韦和内标对应的保留时间处未见明显的信号峰奈玛特韦的残留韦.利托那韦的残留韦.表明残留物对血浆样品的后续检测无影响.稀释可靠性 取奈玛特韦及利托那韦储备液加入空白血浆配制含奈玛特韦及利托那韦浓度分别为、的混合血浆样本平行 份样 用空白血浆对以上混合血浆样本进行、和 倍稀释最终得到含奈玛特韦/利托那韦浓度/、/.、/混合血浆样本各 份 处理后进样分析测定结果显示稀释、和 倍的样品奈玛特韦/利托那韦测定结果与标示量的偏差分别为./.、./.、./.稳定性 配制各质控浓度(低、中、高)血浆样品每个浓度平行配制 份分别考察质控品在长期稳定性()反复冻融稳定性(室温次)短期稳定性(室温)以及处理后自动进样器稳定性()结果见表 结果表明奈玛特韦及利托那韦在以上条件下浓度没有明显变化在.临床结果 例患者中男 例女 例年龄(.)岁 患者平均体质量(.)肌表 奈玛特韦与利托那韦测定方法的准确度与精密度.分析物理论浓度/()批内实测浓度/()准确度批间实测浓度/()准确度奈玛特韦.利托那韦.医药导报 年 月第 卷第 期 表 奈玛特韦与利托那韦提取回收率与基质效应.分析物理论浓度/()提取回收率基质效应奈玛特韦.利托那韦.酐清除率平均值为(.)其中伴高血压 例糖尿病 例肿瘤 例奈玛特韦谷浓度为.平均药物浓度为(.)利托那韦谷浓度为.平均药物浓度为(.)提示奈玛特韦和利托那韦在不同患者间的药物浓度差异较大 所有结果均在定量分析线性范围内 本试验建立的/法能满足临床对奈玛特韦/利托那韦血药浓度检测的需求 结果见图 讨论目前有 篇关于奈玛特韦/利托那韦定量检测方法的报道 等报道一种基于液相色谱质谱联用测定健康志愿者体内奈玛特韦和利托那韦的含量的方法该液相方法检测时间共 检测效率低另外该检测方法仅应用于健康志愿者进行浓度监测新冠患者病理生理情况复杂 不一定适用 等报道一种基于液相色谱质谱联用测定新冠患者体内奈玛特韦和利托那韦的含量的方法该方法梯度长达 同样存在检测时间长、效率低的问题不适用于临床大量样本检测 此外这 种方法样本预处理方法复杂检测前需要进行繁琐的准备过程影响工作效率 本研究根据药品说明书中药动学数据设置合理的浓度范围采用/法同时检测人血浆中奈玛特韦和利托那韦浓度 其中奈玛特韦检测浓度范围为.利托那韦检测浓度范围为.该方法检测时间 其中奈玛特韦及其内标奈玛特韦的出峰时间均为.利托那韦及其内标利托那韦的出峰时间均为.考虑到分析物以及内标化合物的物理化学性质本研究检测离子源选择了电喷雾正离子模式并对以下质谱参数进行了优化:毛细管电压、流速、去溶剂化温度、四级杆碰撞能量等 血浆前处理采用了蛋白沉淀法以含内标的乙腈甲醇()作为沉淀剂相比于其他检测方法沉淀蛋白时先加内标混匀后再加沉淀剂费时繁琐笔者在本方法中提前将内标与沉淀剂制备成混合内标工作液仅需一步即可采用高速离心的方法除蛋白方法简单 考虑到基质效应等因素本方法使用结构相似的同位素作为内标物质其中奈玛特韦作为奈玛特韦的内标利托那韦作为利托那韦的内标 试验结果说明当奈玛特韦及利托那韦作为内标时基质效应可忽略不计试验中发现奈玛特韦和利托那韦在色谱中保留时间越长峰形越差 通过优化洗脱程序将奈玛特韦和利托那韦的出峰时间控制在 内以此获得优越的峰形 此外柱温对奈玛特韦的峰形有显著的影响对利托那韦无明显影响通过比较不同的柱温发现柱温为 时峰形最佳 为了提高电离效果本研究在水相中加入.甲酸考虑到奈玛特韦和利托那韦在患者体内的药物浓度较低笔者在本研究中选择灵敏度较高的/法该方法操作简便灵敏度和检测效率高适用于奈玛特韦和利托那韦的血药浓度监测表 奈玛特韦与利托那韦稳定性试验结果.分析物理论浓度/()室温 实测浓度/()/室温冻融 次实测浓度/()/自动进样器 实测浓度/()/实测浓度/()/奈玛特韦.利托那韦.图 新冠患者体内奈玛特韦和利托那韦血药浓度的散点图.等针对新冠患者的研究表明患者接受奈玛特韦/利托那韦口服治疗后(其中奈玛特韦 、利托那韦 )患者体内奈玛特韦谷浓度范围为.利托那韦谷浓度范围为.与本研究中新冠患者体内奈玛特韦/利托那韦药物浓度范围相近 结果显示奈玛特韦和利托那韦在不同患者间的药物浓度差异较大结合部分患者的临床疗效也发现谷浓度较高的患者更易发生不良反应另外谷浓度过低可能影响患者的好转但是需要扩大样本量进一步深入研究笔者在本研究中建立同时测定人血浆中奈玛特韦和利托那韦药物浓度检测方法并进行方法学验证该方法简便、快速、灵敏度高检测范围合理为今后奈玛特韦和利托那韦的临床研究以及药物安全性研究提供方法学支撑参考文献 陈本川.治疗新型冠状病毒肺炎新药奈玛特韦()片与利托那韦片组合用药.医药导报():.陈蕾谢俊刚.新型冠状病毒感染诊疗方案(试行第十版)解读.医药导报():.王钊刘鹤松王秀云.奈玛特韦片/利托那韦片药物相互作用与用药指导.临床药物治疗杂志():.:.():.:.():.().:./.():./.:.程芳李强王静林等./法用于达沙替尼血药浓度监测.医药导报():.赵振寰荆伟丽刘涛等./法测定人血浆中吡咯替尼的浓度及其临床应用.中国药房():.石浩强何娟陆佳倩等./及 法检测利奈唑胺血药浓度及临床应用.中国药师():./.():.医药导报 年 月第 卷第 期