甘蔗渣的碱催化甘油水溶液预处理.pdf

第 12 卷 第 2 期 新 能 源 进 展 Vol.12 No.2 2024 年 4 月 ADVANCES IN NEW AND RENEWABLE ENERGY Apr.2024 *收稿日期：2023-06-19 修订日期：2023-10-19 基金项目：国家自然科学基金面上项目（22278189）；科技部国家重点研发计划专项项目（2019YFE0114600）；财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系项目（CARS-11-HNSHY）通信作者：孙付保，E-mail： 引用本文：王晨,宋国杰,孙海彦,等.甘蔗渣的碱催化甘油水溶液预处理J.新能源进展,2024,12(2):209-215.Citation：WANG Chen,SONG Guojie,SUN Haiyan,et al.Alkali catalyzed aqueous glycerol pretreatment of sugarcane bagasseJ.Advances in new and renewable energy,2024,12(2):209-215.文章编号：2095-560X（2024）02-0209-07 甘蔗渣的碱催化甘油水溶液预处理*王 晨1，宋国杰1，孙海彦2，闫俊书3，宦海琳3，窦少华4，孙付保1,（1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101；3.江苏省农业科学院畜牧研究所，南京 210014；4.大连大学 生命健康学院，辽宁 大连 116622）摘 要：建立了一种木质纤维素的碱催化甘油水溶液预处理方法以期选择性分离组分和提高底物的可酶解性。实验确定了碱催化甘油水溶液预处理甘蔗渣的条件为：温度 180、NaOH 添加量 7%、反应时间 45 min 以及甘油水溶液浓度 80%。在该条件下，甘蔗渣的纤维素和半纤维素保留率分别为 93.0%和 83.4%，而木质素脱除率接近 80%，达到了理想的组分分离效果。预处理后底物（20 g/L）在 CTec 2 酶载量 10 FPU/g 干基下水解 72 h 酶解率为 79.6%，表明预处理后底物具有较好的可酶解性。利用现代分析技术解析了甘蔗渣预处理前后的组成结构演变规律，初步探明了碱催化甘油水溶液预处理有效提升生物质原料可酶解性的原因。关键词：木质纤维素生物质；甘油水溶液；组分分离；酶解糖化；可发酵性糖 中图分类号：TK6 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.2095-560X.2024.02.012 Alkali Catalyzed Aqueous Glycerol Pretreatment of Sugarcane Bagasse WANG Chen1,SONG Guojie1,SUN Haiyan2,YAN Junshu3,HUAN Hailin3,DOU Shaohua4,SUN Fubao1,(1.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China;2.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101,China;3.Institute of Animal Science,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China;4.College of Life and Health,Dalian University,Dalian 116622,Liaoning,China)Abstract:This study introduced an alkali-catalyzed aqueous glycerol pretreatment for fractionation of sugarcane bagasse to improve the enzymatic hydrolysability.The pretreatment conditions were optimized at 180 C,7%NaOH addition,45 min,and 80%glycerol in an aqueous solution.The pretreatment led to 93.0%and 83.4%cellulose and hemicellulose retention,respectively,while 80%of the delignification indicated a satisfactory component fractionation.Subsequently,the enzymatic hydrolysis of the pretreated substrate(20 g/L)was 79.6%at the hydrolytic condition of 10 FPU/g-dry substrate(CTec 2)for 72 h,meaning that the pretreated substrate was capable of good enzymatic hydrolysability.The structural evolution of sugarcane bagasse before and after the pretreatment was analyzed by modern analytical techniques,and the reason for the good enzymatic hydrolysability of lignocellulose substrate contributed by alkali-catalyzed aqueous glycerol pretreatment was preliminarily made.Keywords:lignocellulosic biomass;aqueous glycerol solution;component fractionation;enzymatic hydrolysis and saccharification;fermentable sugar 0 引 言 木质纤维素类生物质原料具有储量丰富、来源广泛和碳中性等诸多优势，被认为是最有前景的可再生生物质资源。其主要由 30%60%纤维素、20%35%半纤维素和 15%30%木质素组成1，其中纤维素微纤丝是生物质细胞壁结构的基本骨架，周围由半纤维素和具有三维网格结构的木质素通过210 新 能 源 进 展 第 12 卷 分子链内/层间氢键及共价键稳定连接，从而导致了高生物顽抗性和难以被有效生物降解2。因此，酶基生物质精炼加工前通常需要进行预处理以拆解原料的高生物顽抗性，进而提高纤维素酶对纤维质糖的可及性3。近年来，有机溶剂预处理作为一种简单有效和安全环保的生物质组分拆解方法，受到了国内外研究学者们的广泛关注。其中，高沸点甘油有机溶剂预处理具有常压运行、运行安全、组分溶解性好、以及呋喃类发酵抑制物生成量少等优势，已成为木质纤维素富有前景的预处理技术之一4。本课题组前期建立了甘油有机溶剂预处理木质纤维素生物质的方法5。比如，碱催化常压甘油预处理（240，30 min）蔗渣在保留约 88%纤维素和约 75%半纤维素前提下脱除了较高的木质素（70%），显著提高了预处理后底物的可酶解性6。尽管如此，该预处理方法仍存在一些瓶颈问题：（1）预处理过程的反应温度过高；（2）使用纯甘油会增加预处理的溶剂成本；（3）黏度过高的纯甘油预处理体系将导致下游有机溶剂木质素分离以及溶剂回收利用困难。因此，如何在保证良好的组分分离和底物可酶解性前提下改进该预处理方法，成为亟待解决的问题。研究显示，预处理溶剂添加适量水对提升预处理效果具有积极作用。WEI 等7研究发现在离子液体预处理中添加一定量的水，可以降低预处理体系黏度，增强生物质溶解的传质效率，从而有效提高预处理效果。NOVO 等8发现水在木质素醚键断裂过程中具有亲核行为，可一定程度地促进有机溶剂对木质素组分的解离。LING 等9也发现在酸催化乙二醇预处理蔗渣中添加少量水（10%）可提高木质素和半纤维素去除率，同时获得更高的纤维素保留率。因此，甘油有机溶剂预处理过程中添加适量水不仅有助于降低甘油黏度和减少溶剂用量，而且可能会提升预处理效果。基于此，本文尝试构建新型碱催化甘油水溶液预处理方法，首先考察预处理过程主要参数（反应温度、NaOH 添加量、反应时间和水添加量）对蔗渣生物质组分选择性拆解的影响，确立最佳预处理反应条件；随后在不同酶载量和固体负荷下评估预处理底物的可酶解性；最后利用现代技术表征手段分析此预处理方法提升底物可酶解性的原因。1 材料与方法 1.1 原料与试剂 甘蔗渣取自广西壮族自治区，使用前过 20 目筛，并置于 60 烘箱干燥至恒重。其三大组分含量分别为 39.1%的纤维素、22.0%的半纤维素和 25.2%的木质素。工业甘油（纯度大于 99.5%）购自无锡化工厂。纤维素酶 CELICCTec2（120 FPU/g）由北京诺维信投资有限公司提供。1.2 实验方法 1.2.1 甘蔗渣生物质预处理 预处理过程在高温高压反应釜（K-PPA，南京正信）中进行。首先将 10 g 甘蔗渣与 100 g 甘油水溶液置于反应釜内，设置搅拌转速为 180 r/min。随后通过单因素优化来确定最佳预处理条件，设置反应温度为 120 200、NaOH 质量浓度为 1%9%（如无特殊说明，均指质量百分数）、反应时间为15 90 min、甘油含量为 30%100%。待反应结束后，预处理生物质浆液通过 G1 砂芯漏斗过滤，滤饼用 150 mL 自来水洗涤两次。最后，将固体底物在60 烘箱中干燥 8 h，所得样品置于干燥器中密封保存备用。1.2.2 纤维质底物酶解糖化 酶解过程在 100 mL 的三角瓶中进行，加入一定量的柠檬酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH 4.8），纤维质底物的固体含量为20 100 g/L，纤维素酶CTec2的酶载量为 5 30 FPU/g 干底物。摇床转速设置为 180 r/min，反应温度为 50。对底物酶解过程进行定期取样（0.4 mL）检测，样品置于沸水浴中煮沸10 min 使纤维素酶变性，随后测定酶解液中的葡萄糖和木糖浓度。酶解率按照公式（1）计算：0.9100%葡萄糖产量酶解率纤维素含量 (1)1.3 分析表征方法 1.3.1 生物质组分及酶解液成分测定 采用美国国家可再生能源实验室两步酸水解法检测甘蔗渣样品的组分含量10。用高效液相色谱仪（Chromaster CM5110，日本日立）检测酶解液中葡萄糖和木糖浓度，该液相色谱仪配有示差检测器和Bio-Rad HPX-87H 有机酸色谱柱（9 m，300 mm 7.8 mm），柱温设置为 60，流动相为 5 mmol/L硫酸，流速为 0.6 mL/min。第 2 期 王 晨等：甘蔗渣的碱催化甘油水溶液预处理 211 1.3.2 固体底物结构表征 采用场发射扫描电子显微镜（SU8020，日本日立）解析预处理前后蔗渣的表面形貌特征，测试时先称取微量样品烘至恒重并进行镀金处理，随后将样品放大至 500 倍进行观察。利用傅里叶变换红外光谱仪（NEXUS，美国尼力高）分析预处理底物的官能团结构变化规律，光谱记录采用衰减全反射模式（attenuated total refraction,ATR），测量范围为4 000 500 cm1，分辨率为 4 cm1。使用 X 射线衍射仪（D8 ADVANCE，德国布鲁克）分析样品结晶度变化情况11。晶体指数（Icr）按照公式（2）计算：002amcr002100%iiIi (2)式中：i002为结晶区的衍射强度；iam为无定形区的衍射强度。2 结果与讨论 2.1 碱催化甘油水溶液预处理甘蔗渣的条件 2.1.1 预处理温度 实验首先考察了预处理反应温度对生物质组 分拆解的影响规律。如表 1 所示，当预处理温度为 120 时生物质的固体回收率高达 85.6%，木质素脱除率仅为 38.1%。这表明，较低的反应温度不足以破坏木质素结构单元的连接键，进而导致组分溶解分离效果不佳。当反应温度升高至140 时，木质素脱除率显著提高至 61.9%，这使得预处理后固体回收率（75.4%）明显下降。当反应温度从 140 上升至 200 时，木质素脱除率继续提高（72.9%），纤维素和半纤维素的保留率分别从 97.4%和 95.2%降至 88.8%和 80.1%，这表明过高的反应温度会导致纤维素和半纤维素的不可逆降解12。预处理条件的选择是在纤维素和半纤维素保留率尽可能高的前提下，木质素脱除率越高表明暴露出更多的纤维素和半纤维素，从而有利于后续酶解产糖13。在温度达到 180 时纤维素保留率达到 90%以上，继续提升温度至200，纤维素保留率会继续下降且增加能耗。基于此，在综合考虑预处理过程的能量消耗、木质素脱除率、综纤维素保留率及其在固体底物中含量后，选择 180 作为最佳预处理温度。表 1 预处理温度对生物质组分拆解的影响 Table 1 Effect of pretreatment temperature on the deconstruction of lignocellulosic biomass预处理温度/回收率/%组分含量/%组分保留率/%木质素脱除率/%纤维素 半纤维素 木质素 纤维素半纤维素 120 85.60 44.17 24.27 18.22 96.80 94.39 38.09 140 75.40 50.44 27.79 12.72 97.37 95.20 61.93 160 71.70 50.57 26.69 13.10 92.83 86.95 62.71 180 69.80 51.37 26.84 11.75 91.80 85.12 67.44 200 68.90 50.35 25.60 9.90 88.82 80.14 72.92 注：NaOH 浓度为 5.0%，预处理时间为 30 min，甘油浓度为 80%。2.1.2 加碱量 在反应温度为 180 条件下考察不同 NaOH 添加量对蔗渣预处理性能的影响，结果见表 2。当NaOH 添加量为 1%时木质素脱除率为 37.2%，溶剂体系无法实现蔗渣原料的有效拆分，预处理过程仅溶解了 20%的生物质组分。当 NaOH 添加量从 3%增加至 7%时，木质素脱除率大幅提高（从 63.9%提高至 77.9%），纤维素的保留率基本不变（约 92%），而半纤维素的保留率会有所下降（从 89.6%降至82.5%）。这是由于增大 NaOH 添加量会提高溶剂碱强度，不仅能够显著破坏半纤维素与木质素分子之间的酯键，也有助于木质素醚键的断裂，进而促进其溶解分离14。尽管继续增大 NaOH 添加量可获得更高的木质素脱除率，但过高的碱用量也会增加预处理成本和环保负担。结合木质素脱除率、纤维质糖保留率等考虑，实验选择 7%NaOH 作为预处理碱添加量。212 新 能 源 进 展 第 12 卷 表 2 加碱量对生物质组分拆解的影响 Table 2 Effect of alkali addition on the deconstruction of lignocellulosic biomass NaOH 浓度/%回收率/%组分含量/%组分保留率/%木质素脱除率/%纤维素 半纤维素 木质素 纤维素半纤维素 1.0 80.00 45.88 25.01 19.77 93.97 90.90 37.22 3.0 74.30 49.32 26.53 12.23 93.82 89.56 63.92 5.0 69.80 51.37 26.84 11.75 91.80 85.12 67.44 7.0 67.70 52.96 26.82 8.23 91.79 82.49 77.88 9.0 65.50 54.30 27.73 6.60 91.06 82.52 82.84 注：预处理温度为 180，预处理时间为 30 min，甘油浓度为 80%。2.1.3 预处理时间 实验进一步评估预处理时间对生物质组分拆解的影响。如表 3 所示，当预处理时间从 15 min 延长至 90 min 时木质素脱除率从 76.5%略微提高至79.9%，而纤维素和半纤维素组分基本维持不变。尽管延长预处理时间可增加甘油向底物内部的渗透作用并强化反应过程15，但当反应温度和碱用量确定后，预处理时间对生物质组分溶解的促进作用非常有限。综合来看，当预处理时间为 45 min 时固体底物具有较好的木质素脱除率（78.5%），因此实验选择 45 min 作为合适的预处理时间。表 3 预处理时间对生物质组分拆解的影响 Table 3 Effect of pretreatment time on the deconstruction of lignocellulosic biomass 预处理时间/min 回收率/%组分含量/%组分保留率/%木质素脱除率/%纤维素 半纤维素 木质素纤维素半纤维素 15 68.13 52.27 26.81 8.68 91.17 82.99 76.52 30 67.70 52.96 26.82 8.23 91.79 82.49 77.88 45 67.00 54.24 27.40 8.10 93.04 83.41 78.46 60 66.00 54.14 27.59 8.16 91.48 82.73 78.62 90 65.00 55.22 27.00 7.81 91.90 79.74 79.85 注：预处理温度为 180，NaOH 浓度为 7.0%，甘油浓度为 80%。2.1.4 甘油添加量 实验最后探究了甘油浓度对生物质预处理特性的影响。如表 4 所示，在 30%低甘油浓度下预处理过程的组分选择性相对较差，纤维素保留率和木质素脱除率分别为 87.6%和 73.5%，过量的水会在预处理中电离氢离子加剧纤维素和半纤维素的损失。这种损失会随着甘油浓度增大而明显减少，从而保护了综纤维素，同时甘油浓度增大也促进了木质素的脱除16。当甘油浓度增大至 80%时，纤维素保留率和木质素脱除率分别提高至 93.0%和 78.5%。进一步增大甘油浓度，生物质组分含量变化并不显著且高黏度溶液传质会受到限制。因此，实验选择 80%作 为预处理过程的甘油浓度。综上所述，碱催化甘油水溶液预处理蔗渣生物质的预处理条件确定为：反应温度 180、NaOH 添加量 7%、反应时间 45 min 及甘油水溶液浓度 80%。在此条件下，预处理过程脱除 78.5%的木质素，同时保留 93.0%的纤维素和 83.4%的半纤维素；预处理固体底物中含有 54.2%的纤维素、27.4%的半纤维素和8.1%的木质素。所建立的相对温和的甘油水溶液预处理方法，其组分选择性显著增强，在实现木质素优先定向脱除的同时可高效保留底物中综纤维素。第 2 期 王 晨等：甘蔗渣的碱催化甘油水溶液预处理 213 表 4 甘油浓度对生物质组分拆解的影响 Table 4 Effect of glycerol percentage on the deconstruction of lignocellulosic biomass 甘油浓度/%回收率/%组分含量/%组分保留率/%木质素脱除率/%纤维素 半纤维素 木质素纤维素半纤维素 30 64.60 52.99 27.13 10.35 87.64 79.63 73.46 45 65.10 53.61 27.34 9.35 89.35 80.86 75.84 60 66.00 53.42 27.38 8.70 90.26 82.10 77.21 75 66.20 53.48 27.36 8.43 90.64 82.29 77.85 80 67.00 54.24 27.40 8.10 93.04 83.41 78.46 90 67.50 54.70 27.51 7.80 94.53 84.37 79.10 100 67.70 54.92 27.59 7.62 95.19 84.86 79.52 注：预处理温度为 180，NaOH 浓度为 7.0%，预处理时间为 45 min。2.2 预处理底物的可酶解性 实验首先在 20 g/L 底物浓度下考察了不同酶载量对碱催化甘油水溶液预处理底物可酶解性的影响。如图 1，当酶载量为 5 FPU/g 时底物 72 h 酶解率仅为 43.1%，较低的酶用量无法实现该预处理底物的高效酶解转化。当酶载量达到 10 FPU/g 时底物72 h 酶解率显著提高至 79.6%，但继续增加酶载量（15 30 FPU/g）对底物酶解率（86.3%92.9%）的提升效果相对有限。考虑到过高的酶用量会大幅增加酶水解的经济成本，实验选择酶载量为 10 FPU/g，进一步探讨不同固体浓度下碱催化甘油水溶液预处理底物的酶解情况。0122436486072020406080100酶解率/%酶解时间/h 5 FPU/g 10 FPU/g 15 FPU/g 20 FPU/g 25 FPU/g 30 FPU/g 图 1 不同酶载量下预处理底物的酶解情况 Fig.1 Enzymatic hydrolysis of the pretreated substrates under different enzyme dosages 如图 2 所示，预处理底物含量分别为 20、50、70 和 100 g/L 时酶解 72 h 的葡萄糖浓度分别达到10、23、30 和 40 g/L，表明酶水解过程中释放的可发酵性糖浓度随着固体含量的增加而增大。与之相反的是，当固体含量从 20 g/L 增加至 100 g/L 时其72 h 酶解率由 79.6%降低至 64.7%，表明底物的酶解率与预处理固体含量呈现负相关。造成该现象的主要原因是随着固体负载量的增加，体系黏度也随之增大，造成传质困难，引起流体力学问题；此外，较高的底物含量通常也对应着高糖浓度，这可能会对纤维素酶活性产生抑制作用，进而导致酶解率降低。尽管如此，与 SHI 等17构建的氨甘油水预处理体系相比（其蔗渣在 20 g/L 底物浓度和纤维素酶载量30 FPU/g 下 72 h 获得的酶解率为 44.5%），本文碱催化甘油水溶液预处理底物表现出良好的可酶解性。61224487201020304050糖浓度/(g/L)酶解时间/h 20 g/L 50 g/L 70 g/L 100 g/L(a)012243648607220304050607080酶解率/%酶解时间/h 20 g/L 50 g/L 70 g/L 100 g/L(b)图 2 预处理底物在不同底物浓度下的酶解情况：（a）糖浓度；（b）酶解率 Fig.2 Enzymatic hydrolysis of the pretreated substrates under different solid loadings:(a)sugar titer;(b)hydrolysis yield 214 新 能 源 进 展 第 12 卷 2.3 底物预处理前后的结构解析 2.3.1 扫描电镜分析 为了阐明碱催化甘油水溶液预处理对甘蔗渣表面形貌的影响，采用扫描电镜观察原料和预处理样品的结构变化，如图 3 所示。图 3 甘蔗渣原料（a）及预处理样品（b）扫描电镜图 Fig.3 Scanning electron microscope diagram of sugarcane bagasse raw material(a)and pretreated sample(b)原始蔗渣生物质呈现出光滑且致密的纤维结构，而经过碱催化甘油水溶液预处理后甘蔗渣结构被明显破坏，出现大量的褶皱和孔洞。在预处理过程中，甘油水溶液在高温和碱性条件下能够渗透到底物中，使大量木质素和少量半纤维素被脱除，增加生物质表面的粗糙度。此外，纤维素的暴露及疏松多孔的表面结构有助于增加酶对底物的可及性，促进组分降解与转化7。2.3.2 红外光谱分析 通过红外光谱表征解析了预处理前后甘蔗渣组分的官能团结构变化特征，如图 4 所示，在 1 744 cm1处的吸收峰代表木质素半纤维素复合物中糖羧酯键的特征峰。在生物质预处理后该峰明显消失，这说明碱催化甘油水溶液预处理过程会显著破坏木质素碳水化合物的内部连接键，实现生物质组分的有效拆解。此外，在 1 607 cm1处的吸收峰代表木质素苯环振动的特征峰；1 515 cm1处的特征峰是苯环骨架和-糖苷键的伸缩振动峰；1 243 cm1处的吸收峰代表-酯键的特征峰；817 cm1处的特征峰为愈创木基木质素 CH 键的伸缩振动峰。经碱催化甘油水溶液预处理后，上述特征峰强度明显减弱或部分消失，该预处理方法对木质素结构具有显著的破坏作用，内部连接键的断裂导致木质素组分的溶解分离15。另外，在甘油水溶液预处理样品中观察到 891 cm1处对应的无定形纤维素特征峰的强度有所增加18，表明预处理过程提高了底物中的纤维素含量，也与前期的组分分析结果相一致。总之，碱催化甘油水溶液预处理可以打破木质纤维素中一些主要化学键和功能性基团，在高效保留纤维素的同时，脱除部分木质素和半纤维素。4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000500原料透过率/%波长/(cm1)3362289817441607151512431037891817预处理后底物 图 4 预处理前后生物质组分的官能团变化 Fig.4 Changes in functional groups of biomass fractions before and after pretreatment 2.3.3 X 射线衍射分析 对预处理前后的固体样品进行 X 射线衍射分析，见图 5。在 16.2、22.4和 34.9的 3 个特征衍射峰分别对应纤维素（101）、（002）及（040）的衍射平面19，表明蔗渣原料和预处理固体底物均属于典型的纤维素 I 型晶体结构。虽然碱催化甘油水溶液预处理并没有改变纤维素的构型，但却对底物的结晶度造成了影响。预处理过程会去除大量木质素和少量半纤维素进而使纤维素组分暴露，使得甘蔗渣原料的结晶度指数从 55.4%增加到预处理后的65.2%。综合来看，纤维素的暴露有助于提高纤维素酶与底物的可及性，显著促进其酶解糖化效率。01020304050原料相对强度/a.u.2/()16.222.434.9预处理后样品 图 5 不同样品的 X 射线衍射分析 Fig.5 X-ray diffraction analysis of different samples 第 2 期 王 晨等：甘蔗渣的碱催化甘油水溶液预处理 215 3 结 论 构建了木质纤维素相对温和的碱催化甘油水溶液预处理方法，确立了预处理条件为：反应温度180、加碱量 7.0%、反应时间 45 min 以及甘油浓度 80%。在预处理过程中添加少量的水提高了组分选择性，该方法可以脱除近 80%木质素，同时保留90%以上纤维素和 80%以上半纤维素。预处理底物的可酶解性显著提高，在 20 g/L 固体浓度和 10 FPU/g干基的酶载量条件下 72 h 酶解率达到 80%。该预处理方法通过选择性断裂生物质表面结构及其内部关键性化学键和官能团，从而大幅提高了底物可酶解性。参考文献：1 孙江纬,郑安庆,蒋丽群,等.有机酸预处理对桉木解构组分热解特性的影响J.新能源进展,2017,5(3):170-176.DOI:10.3969/j.issn.2095-560X.2017.03.002.2 BHATIA S K,KIM S H,YOON J J,et al.Current status and strategies for second generation biofuel production using microbial systemsJ.Energy conversion and 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