番茄黄化曲叶病毒安徽分离物的基因组结构特征及变异分析_蒋磊.pdf

收稿日期:2022-05-03 基金项目:安徽省重点研究与开发计划项目（202004a06020013），大学生创新创业训练计划项目（dg193404）和安徽省博士后基金项目（2019B360）共同资助。共同第一作者:蒋 磊，讲师。E-mail： 徐世强，硕士研究生。E-mail：*通信作者:江 彤，教授。E-mail： 安徽农业大学学报,2023,50(3):446-449 Journal of Anhui Agricultural University DOI 10.13610/ki.1672-352x.20230625.014 网络出版时间：2023-06-27 10:03:22 URL https:/ 番茄黄化曲叶病毒安徽分离物的基因组结构特征及变异分析 蒋 磊1,2,3，徐世强1，徐 凯1，丁 菲1，江 彤1,2,3*(1.安徽农业大学植物保护学院，合肥 230036；2.作物有害生物综合治理安徽省重点实验室，合肥 230036;3.植物病虫害生物学与绿色防控安徽省普通高校重点实验室，合肥 230036)摘 要：利用滚环扩增（RCA）技术从安徽淮北番茄温室表现曲叶症状的番茄上获得番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）的 2 个分离物全基因组。2 个 TYLCV DNA-A 核苷酸序列全长均为 2 781 nts，共编码 6 个 ORF。序列比对结果表明，2 个 TYLCV 安徽分离物 DNA-A 核苷酸序列同源性为 99.7%，与已报道的国内外其他 24 个 TYLCV 各分离物同源性高达 97.8%99.9%。系统进化分析显示，TYLCV 安徽分离物与来自吉林、沈阳、天津、邯郸和山东的 5 个 TYLCV 分离物亲缘关系最近。关键词：滚环扩增；番茄黄化曲叶病毒；序列分析 中图分类号：S432.41 文献标识码：A 文章编号：1672-352X(2023)03-0446-04 Genomic structure characteristics and variation analysis of tomato yellow leaf curl virus Anhui isolate JIANG Lei1,2,3,XU Shiqiang1,XU Kai1,DING Fei1,JIANG Tong1,2,3(1.School of Plant Protection,Anhui Agricultural University,Hefei 230036;2.Anhui Province Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops,Hefei 230036;3.Key Laboratory of Biology and Sustainable Management of Plant Diseases and Pests of Anhui Higher Education Institutes,Hefei 230036)Abstract:The whole genomes of two isolates of tomato yellow leaf curl virus(TYLCV)from the tomatos exhibited curved leaf symptom in greenhouse of Huaibei,Anhui Province were obtained by rolling circle amplifi-cation(RCA).The two nucleic acid sequences of TYLCV DNA-A were both 2 781 nucleotides(nts)in length,containing six potential ORFs.The results of sequence alignment showed that the nucleic acid sequence homology of the two TYLCV Anhui isolates was 99.7%,and they shared identity of 97.8%-99.9%with other 24 TYLCV isolates in domestic and foreign.Phylogenetic analysis showed that TYLCV Anhui isolate had the closest rela-tionships with the other five TYLCV isolates from Jilin,Shenyang,Tianjin,Handan and Shandong.Key words:rolling circle amplification;tomato yellow leaf curl virus;phylogenetic analysis 番茄黄化曲叶病是世界上普遍发生的一种番茄病害1，该病是由番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）引起，主要危害番茄、茄子、黄瓜和烟草等经济作物，感病番茄植株通常表现顶部叶片皱缩、黄化、卷曲，严重时植株矮化，生长停止1-2。番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 属 于 双 生 病 毒 科（Geminiviridae）菜 豆 金 色 花 叶 病 毒 属（Begomovirus）1。根据基因组结构的不同，TYLCV可以分为双组分（DNA-A 和 DNA-B）和单组分（DNA-A）2 种类型，其中 DNA-A 组分约 2.8 kb，由病毒链和互补链共同编码，共有 6 个开放阅读框（opening reading frame,ORFs），能够在寄主细胞核内形成双链 DNA 复制中间体3-4。20 世纪中期，已有关于番茄黄化曲叶病毒病的报道，70 年代末引起该病的 TLYCV 才被正式命名，此后迅速蔓延至非洲、中东、澳洲、美洲的中部和南部以及亚洲的南部等热带和亚热带地区1。200650 卷 3 期 蒋 磊等:番茄黄化曲叶病毒安徽分离物的基因组结构特征及变异分析 447 年，TYLCV 在我国上海首次报道5，随后相继在北京、天津、辽宁、江苏、湖北、四川、新疆等省市和地区检测到该病毒6-7。近年来 TYLCV 已扩散到我国各省市番茄种植区，每年有近 20 万 hm2的番茄受到 TYLCV 的危害，造成的经济损失高达数十亿元，严重危害我国番茄产业的发展8-10。由于番茄种苗的频繁调运，烟粉虱已迅速成为淮北市保护地番茄的主要虫害，烟粉虱传播的番茄黄化曲叶病发生逐年加重，给淮北市的番茄生产造成严重损失。本研究拟采用滚环扩增（rolling circle amplification,RCA）获得引起安徽淮北番茄黄化曲叶病的TYLCV分离物全基因组，进一步进行序列分析，了解其结构特征及与其他地区 TYLCV 间的进化关系，明确安徽番茄上 TYLCV 的起源，为选育和筛选安徽省番茄 TYLCV 抗病品种提供科学依据。1 材料与方法 1.1 病样来源 从安徽省淮北市相山区采集疑似感染 TYLCV的番茄植株，症状表现为叶片褪绿黄化，边缘卷曲，样本保存于80 冰箱备用。1.2 总 DNA 提取 利用CTAB法11提取2 个番茄叶片样本总DNA。1.3 RCA 扩增、RCA-RFLP 分析和 PCR 扩增 利用 Templiphi TM Kit（GE Healthcare），按照试剂盒说明书上的步骤以获得病毒全基因组。扩增产物用 BamH I、Hind III 等限制性内切酶（Promega）处理。酶切体系为：RCA 产物 3 L、内切酶 1 L、内切酶缓冲液 5 L，总体系为 50 L，在 37 条件下酶切 3 h。酶切产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳分离。设计 DNA 特异性引物 beta01（5-GGTACCA CTACGCTACGCAGCAGCC-3）和 beta02（5-GT ACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3）。PCR 反应条件，94 预变性 3 min，94 变性 45 s，55 退火 45 s，72 延伸 2.5 min，30 个循环后，72 延伸 5 min。1.4 序列测定和分析 割胶回收特异性条带，构建到用同样限制性内切酶酶切的 pGEM-7zf 载体上，委托安徽通用生物有限公司测序。利用软件 DNAStar（DNASTAR Inc,Madison,USA）和 DNAMAN Version 5.22（Lynnon Biosoft,Quebe,Canada）进行序列分析。多序列比较采用 DNAStar Clustal V 方法，系统进化树构建采用 DNAMAN 的邻近相连法（Neighbor-joining）。2 结果与分析 2.1 用 RCA-RFLP 分析 TYLCV DNA-A 提取 2 个番茄样本 DNA（AH-HB1 和 AH-HB2）进行 RCA 扩增，分别得到一条 5.4 kb 和 2.7 kb 的片段（图 1）。M：DNA marker；1：AH-HB1；2：AH-HB2。图 1 RCA 产物电泳图 Figure 1 Agarose gel analysis of RCA products 用 BamH I 进一步消化 RCA 产物，酶切后均得到一条约 2.7 kb 的特异性片段（图 2），克隆并测序，序列长度均为 2 781 nts。M：DNA marker；1：AH-HB1；2：AH-HB2。图 2 RCA 产物 BamH I 酶切电泳图 Figure 2 Agarose gel analysis of RCA products digested with BamH I 在 NCBI 上比对序列发现，这 2 个片段确为TYLCV 的 DNA-A 组分，二者的序列相似性为99.7%，2 个 病 毒 安 徽 分 离 物 分 别 命 名 为TYLCV-AH-HB1 和 TYLCV-AH-HB2，其 GenBank登录号分别为 FN650807 和 FN650808。利用 DNA 特异性引物对提取的总 DNA 进行 PCR 检测，未扩增到TYLCV-AH-HB1和TYLCV-AH-HB2的DNA基因组片段，说明番茄黄化曲叶病毒安徽分离物不伴随 DNA 分子。序列测定表明，2 个 TYLCV 安徽分离物的DNA-A 均具有典型的 begomoviruses 结构，分别编码 6 个开放读码框（ORFs），其中病毒链编码 AV1（CP）和 AV2，互补链编码 AC1（Rep）、AC2、AC3 和 AC4，中间被间隔区（IR）隔开。IR 区含有茎环结构和保守的九核苷酸序列 TAATATTAC。448 安 徽 农 业 大 学 学 报 2023 年 2.2 TYLCV-AH-HB1 DNA-A 与其他 TYLCV 分离物 DNA-A 的相似性分析 比对TYLCV-AH-HB1 与 GenBank 已登录的 24个其他地区的 TYLCV 分离物核苷酸序列性，结果发现，TYLCV-AH-HB1 与其他 TYLCV 分离物DNA-A 核苷酸序列相似性为 97.8%99.9%，其中与 TYLCV-Shandong（GQ352537）的序列相似性最高，为 99.9%。另外，比对 TYLCV-AH-HB1 与其他 TYLCV 分离物 IR 区核苷酸序列相似性以及AV1、AV2、AC1、AC2、AC3 和 AC4 氨基酸序列相似性发现，IR 区核苷酸序列相似性为 94.6%99.4%，AV1、AV2、AC1、AC2、AC3 和 AC4 氨基酸序列相似性分别为 96.1%100%、98.3%100%、97.5%100%、94.8%100%、94.0%100%和 95.9%100%，TYLCV-AH-HB1 AV1、AV2、AC2和AC4均与TYLCV-Shandong相应片段的序列相似性最高，达 100%（表 1）。表 1 AH-HB1 与其他 24 个 TYLCV 分离物序列相似性 Table 1 Sequence similarity of Anhui isolate AH-HB1 and 24 isolates of TYLCV 病毒分离物（序列号）病毒来源地 同源性/%DNA-Aa IRa AV1b AV2b AC1b AC2b AC3b AC4b Hubei-KJ850344 湖北 99.4 97.8 99.2 99.1 99.7 98.5 97.8 100 Fujian-KX885028 福建 98.8 95.8 99.2 100 98.0 97.8 97.8 97.9 Guangdong-KJ850344 广东 99.4 97.8 99.2 99.1 99.7 98.5 97.8 100 Handan-GU951437 邯郸 99.7 99.0 100 100 99.4 99.3 99.3 100 Henan-JQ004052 河南 99.0 96.8 99.6 100 98.3 97.8 95.5 97.9 Jiangsu-FN256259 江苏 98.8 97.8 96.1 100 98.3 98.5 97.8 97.9 Liaoning-KJ754191 辽宁 99.0 97.1 99.2 99.1 98.3 97.8 97.8 97.9 Shandong-GQ352537 山东 99.9 99.4 100 100 99.7 100 99.3 100 Shanghai-AM282874 上海 99.8 98.7 100 100 99.7 99.3 100 100 Shenyang-KM506961 沈阳 99.7 98.1 100 100 99.4 100 100 100 Hebei-KX034543 河北 99.1 97.8 99.2 100 98.6 97.0 97.8 97.9 Tianjin-GU563330 天津 99.5 97.8 100 100 98.9 98.5 98.5 100 Xinjiang-JX456640 新疆 99.6 98.4 100 100 99.7 98.5 97.8 100 Yunnan-KU975399 云南 99.0 97.4 99.6 100 97.8 97.8 97.0 96.9 Beijing-KT338295 北京 99.0 96.2 99.6 100 98.6 96.3 97.0 99.0 Henan-KX034543 河南 99.0 97.8 99.2 100 98.6 97.0 978 97.9 Jiling-KC702798 吉林 99.4 98.4 99.6 100 99.2 98.5 98.5 99.0 Spain-AJ489258 西班牙 98.1 96.2 98.4 99.1 98.3 95.6 95.5 95.9 Netherlands-FJ439569 荷兰 97.8 94.6 98.8 98.3 98.0 94.8 94.0 95.9 Australia-GU178819 澳大利亚 99.6 95.2 100 100 100 97.0 96.3 100 Cuba-AJ223505 古巴 97.9 95.1 98.4 99.1 97.5 95.6 94.8 96.9 Egypt-AY594174 埃及 98.2 98.4 98.8 99.1 97.8 95.6 96.3 95.9 Japan-AB192966 日本 99.8 99.0 100 100 100 99.3 97.8 100 Mexico-HM459851 墨西哥 99.1 97.8 99.6 98.3 98.9 98.5 97.8 97.9 注：a 代表核苷酸序列；b 代表氨基酸序列。2.3 TYLCV-AH-HB1 与其他地区 TYLCV 分离物的系统进化分析 构建 TYLCV-AH-HB1 与其他地区 24 个TYLCV 分离物的系统进化树，结果发现，进化树共分成 2 个分支，AH-HB1 与来自日本、澳大利亚、墨西哥和中国其他地区的 17 个分离物聚成一个分支，而来自于西班牙、荷兰、埃及和古巴的 4 个分离物聚成另外一个分支。AH-HB1 与来自于吉林、沈阳、天津、邯郸和山东的 5 个分离物亲缘关系较近，聚成一个单独的小分支（图 3）。3 讨论与结论 扩增双生病毒基因组一般在病毒基因组的 IR区设计一对通用引物 PA/PB，先扩增出一条约 500 bp 的片段，再根据测定的序列设计特异性引物反向扩增剩余的大片段，然后拼接获得理论上的全长基因组。这种方法的缺点是如果一个新的双生病毒序列变异较大，通用引物 PA/PB 不一定能扩增出小片段，大片段更是无法获得。另外，这种方法无法获得客观存在双生病毒全长基因组，如果要进一步构建病毒的侵染性克隆，需要在某个单酶切位点设计一对背靠背引物进行 PCR 扩增，获得全长基因组再构建侵染性克隆，方法比较繁琐。双生病毒的复制先以病毒链 DNA 为模板合成互补链，形成 dsDNA 复制中间体，病毒编码的复制酶蛋白（Rep）切割 dsDNA 后以互补链为模板连50 卷 3 期 蒋 磊等:番茄黄化曲叶病毒安徽分离物的基因组结构特征及变异分析 449 续滚环复制出正义链 DNA12。而滚环扩增（RCA）的原理是建立在滚环复制的基础上，在 DNA 聚合酶的作用下，这种亲代单链 DNA 的延伸可以一直进行下去，产生长短不一的亲代 DNA 多拷贝长链，理论上任何一个酶切位点都可以切割出单拷贝全长基因组。这种方法不需要设计引物，也不需要 PCR仪，扩增后用一个合适的限制性内切酶消化，将获得的单拷贝 DNA 克隆到载体上，无论是测序还是构建侵染性克隆都很方便13。图 3 安徽分离物与其他 24 个TYLCV 分离物的系统进化树 Figure 3 Phylogenetic tree of Anhui isolate and 24 isolate of TYLCV 本研究采用 RCA 扩增及基因克隆方法，获得了侵染安徽淮北番茄的双生病毒 2 个基因组全序列TYLCV-AH-HB1 和 TYLCV-AH-HB2，大小均为 2 781 nts，序列相似性为 99.7%，与国际上已报道的TYLCV 各分离物序列相似性均在 97.8%以上，其中与我国其他地区的 TYLCV 分离物序列相似性均在98.8%以上。利用 PCR 在感染 TYLCV-AH-HB1 和TYLCV-AH-HB2 的番茄样本中，均未检测到 DNA的存在，之前也有一些报道显示 TYLCV 分离物检测不到卫星分子14-16，说明 DNA 分子对TYLCV 田间分离物致病可能不是必须的。根据目前国际双生病毒分类方案，可确定引起安徽淮北番茄黄化曲叶病的病原是 TYLCV 安徽分离物。本文首次对侵染安徽省番茄的 TYLCV 进行分子鉴定和序列分析，明确了 TYLCV 安徽分离物的分子特征，为构建 TYLCV 侵染性克隆鉴定番茄品种抗病性奠定了基础，也将为安徽省番茄抗病品种的选育以及番茄黄化曲叶病的防控提供科学依据。TYLCV 可通过烟粉虱以持久性方式传播。随着皖北地区设施农业的快速发展，为烟粉虱提供越来越多的理想越冬场所，TYLCV 大面积暴发的可能 性 也 大 大 增 加。系 统 进 化 树 分 析 发 现，TYLCV-AH-HB1 与来自东北和华北地区吉林、沈阳、天津、邯郸和山东各个 TYLCV 分离物的亲缘关系最近，安徽淮北属于华北地区，山东省是临近的蔬菜种植大省，山东潍坊和寿光是全国主要的番茄种植地区，安徽皖北部分蔬菜种苗来自于山东省，推测传染安徽番茄黄化曲叶病的烟粉虱可能随蔬菜种苗调运从山东传播到安徽。参考文献：1 PRASAD A,SHARMA N,HARI-GOWTHEM G,et al.Tomato yellow leaf curl virus:impact,challenges,and managementJ.Trends Plant Sci,2020,25(9):897-911.2 姜静,王银磊,李亚茹,等.江苏省及其他地区番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定及序列分析J.江苏农业学报,2018,34(1):238-240.3 BASAK J.Tomato yellow leaf curl virus:a serious threat to tomato plants world wideJ.J Plant Pathol Microbiol,2016,7(4):1000346.4 LEKE W N,MIGNOUNA D B,BROWN J K,et al.Be-gomovirus disease complex:emerging threat to vegetable production systems of West and Central AfricaJ.Agric Food Secur,2015,4(1):1-14.5 WU J B,DAI F M,ZHOU X P.First report of tomato yellow leaf curl virus in ChinaJ.Plant Dis,2006,90(10):1359.6 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