PCR标准体系优化.docx

因为Taq DNA聚合酶是现在PCR反应体系中应用最广泛酶，所以此文关键讨论使用该酶PCR反应体系。
A 镁离子浓度
镁离子是热稳定DNA聚合酶辅因子，其浓度对PCR至关关键。模板DNA浓度，鳌合物（如EDTA和柠檬酸盐）、dNTP浓度和蛋白全部会影响反应体系中游离镁离子量。假如游离镁离子含量不够，那么Taq DNA聚合酶则无法行使功效(figure1)。过多游离镁离子则会降低酶保真度，可能会增加非特异性扩增。所以，研究者应该依据实际试验结果来优化每一反应中镁离子浓度。能够用一系列镁离子浓度梯度来验证，镁离子浓度范围为1~4mM，每次增加或降低0.5~1 mM。扩增产量最高，非特异性产物最低时镁离子浓度即为最优。最优镁离子浓度范围跟DNA聚合酶类型相关，比如，Pfu DNA 聚合酶似乎对镁离子依靠性更低，但其优化范围通常为2~6mM。
很多DNA聚合酶产品提供Mg-free reaction buffer和单独一管25mM MgCl2，这么就能够自行调整Mg2+浓度，优化反应体系。MgCl2溶液在反复冻融后会出现浓度分层，为取得均一溶液，在配液时候，要确保MgCl2溶液完全溶解并充足震荡混匀。很简单两步，溶解和混匀，常常会造成试验失败。
有些科学家倾向于使用包含MgCl2buffer，MgCl2终浓度为1.5mM。值得注意是有文件报道发觉使用这类buffer结果并不稳定，有时体系内游离镁离子浓度会有0.6mM改变，假如在90℃加热10min，则结果趋于稳定，所以作者假设反复冻融buffer中MgCl2可能会有沉淀现象发生。

Figure 1.镁离子浓度对PCR扩增影响。用不一样浓度 Mg 2+测试，产物大小为1.8kb
琼脂糖凝胶电泳，EB染色泳道M为MAKER; Lane 1, 0mM Mg 2+ ; Lane 2, 0.5mM Mg 2+ ;Lane 3, 1mM Mg 2+ ; Lane 4, 1.5mM Mg 2+ ; Lane 5, 2mM Mg 2+ ; Lane6, 2.5mM Mg 2+ ; Lane 7, 3mM Mg 2+ and Lane 8, 3.5mM Mg 2+

B Buffer 缓冲液
大多数Buffer里含有一个缓冲试剂，多数为基于Tris缓试剂。另外还有盐类，通常为KCL。缓冲试剂调整反应体系pH值，pH值会影响DNA聚合酶活性和保真度。和不添加KCL比，适量KCL能够增加50~60%DNA聚合酶活性。通常来说，KCL浓度为 50mM。
C 酶浓度
我们推荐（promega科研人员）在50微升体系中使用1-1.25units Taq DNA聚合酶。多数情况下，这些酶是过量，再添加酶并不能显著提升产物量。实际上，酶量不停升高会增加Taq DNA聚合酶5′→3′外切酶活性，跑胶时候会观察到弥散条带。
想要正确吸收少许含50%甘油酶溶液是很困难，所以提议一次配置大量预混液，这么酶加量便会很大，降低误差。
D PCR 引物设计
引物决定扩增区域和扩增子大小，引物长度通常在15~30bp。理想状态下引物其GC含量应该在40~60%，避免在引物3’端出现三个连续G或C以降低非特异性结合。还要避免本身或引物间互补，以降低引物二聚体。引物本身二级机构干扰退火时引物和模板结合。正反向两条引物之间Tm值相差不超出5℃，方便两条引物在同一退火温度下拥有相同扩增效率。能够在引物上添加其它用途序列，比如在5’端添加酶切位点序列，方便下一步克隆，或添加T7 RNA聚合酶开启子，方便进行体外转录。
实际应用中会发觉不一样软件给出Tm值不一样，同一软件不一样参数得出Tm值也不一样。无须纠结于此，只需要使用同一个软件统一参数去评定一个项目中所用引物就好，Tm值只是一个相正确标准，不管哪种软件只要你全部引物全部在一个标准体系内评定，不会影响后续试验分析。就好比你带两块表反而不知道具体时间，只需要有一个标准参考体系即可。
E 模板质量
扩增依靠DNA模板数量和质量。核酸纯化过程中常常使用试剂（盐类、胍、蛋白酶、有机溶液和SDS）是潜在DNA聚合酶抑制剂。比如0.01% SDS会造成90% Taq DNA聚合酶活性被抑制，而0.1% SDS则会抑制99.9%Taq DNA聚合酶活性。其它PCR抑制剂有苯酚、肝素、二甲苯蓝、溴酚蓝、植物多糖和多胺类物质精胺和亚精胺。有些情况下，抑制剂并不是伴随核酸模板进入反应体系内，比如紫外照射下聚苯乙烯和聚丙烯会释放抑制物，假如使用这类物质作为反应管，有可能干扰PCR。
假如你认为扩增失败是因为模板溶液中存在抑制剂，那么向反应液中再加入以前扩很好对照DNA模板和引物对，假如扩增效果变差，那可能就有干扰物质，清理DNA模板，关键检验苯酚、氯仿和乙醇等。
F 模板量
扩增所需模板量依靠于DNA样本复杂性。比如，4kb质粒含1kb目标序列，那么靶序列含量就是25%。相反假如1kb目标序列存在于人基因组中（3.3×109bp），那么靶序列含量就是0.00003%。通常常犯错误就是使用太多质粒DNA，太多PCR产物或太少基因组DNA作为模板。
加太少模板扩增产物极少，而加太多模板则会造成非特异性扩增过多。在使用PCR产物作为模板时候，应该稀释10至10000倍然后再进行PCR扩增。
1μg of human genomic DNA = 3.04 × 105 molecules
G 循环参数
退火温度和延伸时间是常常需要改动两个参数。其它步骤时长和温度通常改变不大。不过在部分情况下，循环过程中变性温度会降低，时间会降低，以减低脱嘌呤作用（脱嘌呤作用可所以产物突变）。
退火温度通常设在引物Tm值5℃左右，使用比引物Tm值稍高退火温度能够提升特异性，降低非特异扩增。不过较低退火温度会增加扩增产物量，因为引物在较低温度下更能有效退火。提议以低于引物5℃Tm值为退火温度，逐步升高以找到最优退火温度。热开启酶在一定程度上能够降低非特异扩增和引物二聚体。
延伸时间要依据扩增产物大小来优化，通常情况下1min扩增1kb。时间不要过长，过长轻易增加5′→3′外切酶活性，造成条带弥散。
H PCR促进剂和添加剂
PCR促进剂能够增加目标产物扩增量，降低非特异性产物扩增量。现有很多作用机理各不相同PCR促进剂，这些促进剂并不会对全部PCR反应有促进作用。模板和引物不一样，促进剂效用也不尽相同，所以需要经过具体试验来验证。以下讨论常见促进剂：
甜菜碱、DMSO和甲酰胺能够促进高GC含量模板扩增。高GC模板通常会形成较强二级结构，DNA聚合酶扩增停止，造成扩增失败。高GC模板之所以会成为一个难点是因为其两条链不轻易分离，分离后又很轻易结合。而高GC含量引物会在分子间形成二级结构，和模板结合过程竞争。甜菜碱能够降低模板解链所需能量。DMSO和甲酰胺作用相同，全部是干扰两条单链DNA间氢键形成，阻止模板两条单链互补结合。
假如扩增效率很差，添加适量促进剂能够增加扩增产物量，促进剂加量范围为：甜菜碱（1M）、1—10% DMSO /甲酰胺。DMSO含量超出10%，或甲酰胺含量超出5%则会抑制Taq DNA聚合酶活性。
有些情况下，通用添加稳定剂如BSA（0.1mg/ml），明胶（0.1-1.0%）和非离子型去垢剂（0-0.5%）能够处理扩增失败问题。这些稳定剂能够增加DNA聚合酶稳定性，降低管壁吸附造成试剂损失。BSA还能帮助克服黑色素对反应抑制。非离子型去垢剂如Tween-20，NP-40和TritonX-100能够克服反应体系中残留痕量离子型去垢剂（如0.01%SDS）对PCR反应抑制作用。铵离子能偶增加扩增反应对非优条件耐受性，所以部分PCR反应试剂中包含10-20mM (NH4 )2SO4。其它PCR促进剂有 甘油（5-20%），聚乙二醇（5-15%）和氯化四甲基铵（60mM）
I 核酸交叉污染
尽可能降低核酸在试验间交叉污染相当关键。要对试验场所进行分区，并在每一区配置专属移液器等器材。使用低吸附枪头或项目专用移液枪也能降低交叉污染。
异补骨脂素，一个光敏交联试剂，能够嵌入DNA双链，可阻止DNA双链变性和复制。所以预先用异补骨脂素处理PCR试剂，可有效预防试剂中存在污染双链DNA在PCR过程中变性，只能扩增添加未经过异补骨脂素处理样本DNA。
尿苷酶(UNG)，一个DNA修复酶，能够把尿嘧啶从核糖上水解下来。利用其这一特征，在PCR体系中使用尿嘧啶（dUTP）替换胸腺嘧啶dTTP，那么扩增产物中便包含dUTP。在反应体系中加入UNG，运行PCR程序时候（通常在PCR反应程序前加入10min 37℃预处理，来使UNG发挥作用），UNG将会切割体系内混入含dUTP扩增产物，阻止其扩增，以达成降低污染目标。有校正功效聚合酶假如使用dUTP效率将会降低（高保真酶），而没有校正功效聚合酶在含有dUTP体系内能够稳定扩增（比如Taq酶）。使用dUTP对EB染色和电泳迁移率无显著影响（很多企业有含UNGTaqman探针反应体系，dUTP对Taqman探针应该无显著影响，需查文件）。UNG处理还有一个优势就是它能够处理单链DNA也能够处理双链DNA。

降低错误最好方法永远是规范化操作。污染也是如此，规范化标准化试验室操作会尽可能降低污染可能性。有两方面需要注意，一是加样时候，一定要左手拿离心管，右手去开盖，而且动作要慢稳，避免管内液体飞溅；二是废弃枪头一定要打入含水垃圾袋内，试验操作完成后，立即密封垃圾袋，并丢弃到垃圾桶内。工作台整齐直接表现试验操作人员专业素养，关乎试验成败。请在每次试验操作完成后认真整理试验台。
规范化标准化操作可能会花费更多时间和金钱，不过这是值得。从短期来看，能够避免失误、污染和其它轻易造成试验失败原因；从长远来看，规范化标准化操作能够提升试验人员专业素养， 增加试验结果正确性、反复性和分析性，反而能够高效快速完成研发项目。千万不要在专业素养还没有形成前，就急不可耐随意操作。不坚持标准，爱走捷径，被毁掉不止是一次试验、一个项目，更是你职业生命和前途。在无法看到结果，没有些人指导你情况下，坚持标准是你唯一正确选择。