猪伪狂犬病灭活苗和弱毒苗联合免疫小鼠的免疫效果研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第9期2023年9月Vol.45，No.9Sep.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202212006猪伪狂犬病灭活苗和弱毒苗联合免疫小鼠的免疫效果研究陈雨1，张晓晓1，苗信永1，崔志莹1，赵睿杰1，陈静1，张宜娜1，李新生1，张红英1，夏平安1*，吴斌2(1.河南农业大学 动物医学院，河南 郑州 450002；2.华中农业大学 动物医学院，湖北 武汉 430070)摘要：为了优化猪伪狂犬病(PR)免疫程序，本研究将SPF级昆明雌鼠分为JZ-45组(单免灭活苗)、HB-98组(单免弱毒苗)、JZ-45/JZ-45组(两次均免灭活苗)、JZ-45/HB-98组(首免灭活苗，二免弱毒苗)、HB-98/JZ-45组(首免弱毒苗，二免灭活苗)、HB-98/HB-98组(两次均免弱毒苗)和对照组，共7组，采用猪伪狂犬病病毒(PRV)JZ-45分离株灭活苗和商品化HB-98弱毒苗，以上述相应组免疫物对小鼠免疫，在免疫后0、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d分别采血，分离血清利用间接ELISA和中和试验对小鼠血清PRV特异性和中和抗体水平进行检测；并在免疫后42 d利用PRV JZ-45株对小鼠攻毒(攻毒剂量：100 LD50，LD50=102.681/0.1 mL，100滋L/只)，观察其临床症状，计算小鼠存活率，并对各组小鼠剖检观察各脏器剖检病变。取小鼠脑、脾脏制备病理切片，观察各组小鼠各组织的病变。结果显示：免疫组小鼠血清PRV抗体及中和抗体水平在042 d均呈持续上升趋势，且HB-98/JZ-45组小鼠血清PRV抗体水平在各时间点均高于其它组。攻毒结果显示：单免组小鼠存活率均为80%，其余免疫组小鼠均无明显临床症状，对照组小鼠全部死亡。组织病理切片结果显示：除HB-98/JZ-45免疫组小鼠脾脏、脑部无明显异常外，其他免疫组小鼠脾脏组织均有少量中性粒细胞浸润，对照组小鼠脾脏白髓灶性坏死，有大量中性粒细胞浸润，脑部组织出现炎性细胞浸润，胞质空泡化等。结果表明，在首次免疫HB-98弱毒苗的基础上加强免疫1次JZ-45灭活苗，可对小鼠获得更好的免疫保护效果。本实验比较了不同的免疫程序对小鼠免疫保护效果的差异，为后续PRV免疫程序的改进提供指导，也为更好地控制PR提供参考。关键词：猪伪狂犬病；灭活苗；弱毒苗；免疫效果；攻毒保护中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)09-0930-06Protective efficacy of combined immunization of porcinepseudorabies inactivated vaccine and attenuated vaccine in miceCHEN Yu1,ZHANG Xiao-xiao1,MIAO Xin-yong1,CUI Zhi-ying1,ZHAO Rui-jie1,CHEN Jing1,ZHANG Yi-na1,LI Xin-sheng1,ZHANG Hong-ying1,XIA Ping-an1*,WU Bin2(1.College of veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;2.College of veterinary Medicine,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)Abstract:In order to optimize the immunization procedure for porcine pseudorabies,this experiment used pseudorabies virus(PRV)JZ-45 isolate inactivated vaccine and commercial HB-98 attenuated vaccine to immunize SPF grade Kunming female micewith different immunization procedures.Briefly,SPF Kunming female mice were divided into JZ-45(inactivated vaccine收稿日期：2022-12-06基金项目：“十三五”国家重点研发计划资助项目(2018YFD0500800)；河南省高校科技创新团队支持计划项目(19IRTSTHN007)；中原千人计划科技创新领军人才资助项目(204200510015)作者简介：陈雨(1998-)，女，河南郑州人，硕士研究生，主要从事分子免疫学研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authorimmunization once),HB-98(attenuated vaccine immunization once),JZ-45/JZ-45(inactivated vaccine immunization twice),JZ-45/HB-98(inactivated vaccine immunization and then attenuated vaccine immunization),HB-98/JZ-45(attenuated vaccineimmunization and then inactivated vaccine immunization),HB-98/HB-98(attenuated vaccine immunization twice),and the controlgroup.Subsequently,blood samples were collected at 0,7,14,21,28,35,and 42 days post-immunization(dpi),and the PRVantibody level in mouse serum was detected by using indirect ELISA and neutralization test.On the 42 dpi,mice were challengedwith PRV JZ-45 strain to observe their clinical symptoms and calculate the mortality rate.Mice in each group were dissected toexamine organ lesions(challenge dose:100 LD50,LD50=102.681/0.1mL,100滋L/piece).The pathological sections of brain and spleenof mice were prepared to observe the pathological changes of each group.The results showed that the level of serum PRV antibodyand neutralizing antibody in immunized mice had a continuous upward trend from 0 to 42 days,and the level of serum PRVantibody in HB-98/JZ-45 group was higher than that in other groups.The results of challenge showed that the survival rate of micein the single immunization group was 80%,whereas the other immunized groups had no obvious clinical symptom and the mice inthe control group all died.Pathological sections showed that there was no obvious abnormality in the spleen and brain ofHB-98/JZ-45 immunized mice,and there was a small amount of neutrophil infiltration in the spleen and brain of other immunizedmice.In the control group,the white pulp of the spleen showed focal necrosis with a large number of neutrophils infiltrating,andinflammatory cell infiltration and cytoplasmic vacuolization occurred in brain tissue.The overall results showed that a betterimmune protection effect could be obtained by strengthening immunization with JZ-45 inactivated vaccine once on the basis ofHB-98 attenuated vaccine.This experiment provides guidance for the improvement of the subsequent PRV immunization programand also provides a reference for better control of pig pseudorabies disease by understanding the differences in the protectiveeffects of different immunization programs in mice.Key words:pseudorabies;inactivated vaccine;weak vaccine;immunization effect;virus attack protection伪狂犬病(Herpesviridae，PR)是由PR病毒(PRV)引起的一种高度接触性传染病。该病毒无特定宿主嗜性，可感染多种哺乳动物，包括猪、牛、羊、水貂、啮齿动物等1。1947年，中国东部报告了第一例家猫PRV感染病例，此后该病在我国不同物种间广泛传播2-3。1979年我国通过引进Bartha-K61疫苗，使得PR在中国的流行得到了很大程度的控制4。但从2011年开始，我国许多已经接种PR疫苗的规模化养猪场再次出现PR疫情，此后经学者证明，上述疫情均由PRV变异株引起，且PRV变异株的抗原表位与经典株相比，产生了一定程度的变异，毒力较经典株有所增强5-8，导致经典的Bartha-K61疫苗株不能为仔猪提供完全保护9-10。且原有的免疫程序需要做出适当的调整，以刺激机体产生更强、更持久的免疫保护，从而达到有效抵御PRV变异株的感染11。因此，本实验采用从河南省猪场分离的PRV JZ-45株为亲本株所制的PRV JZ-45灭活苗和河南省当地猪场经常使用的以Ea株为亲本株的商品化HB-98弱毒苗，通过不同免疫程序免疫小鼠，并检测小鼠体内抗体水平以及攻毒后小鼠的临床症状、存活率及其各组织病理切片观察评估各免疫程序的免疫效果，以探究更合理的免疫程序，为后续更好的防制PR提供参考。1材料与方法1.1主要实验材料猪肾细胞(PK-15)和JZ-45灭活疫苗由河南农业大学动物医学院分子免疫学实验室保存；HB-98()弱毒苗购自武汉科前生物股份有限公司；4周龄6周龄SPF级昆明雌鼠购自郑州大学实验动物中心；10号药用白油、Span-80和硬脂酸铝购自上海麦克林生化科技有限公司；Tween-80购自北京鼎国昌盛生物科技有限公司。1.2小鼠免疫试验选取70只小鼠，随机均分为7组，JZ-45、HB-98单次免疫组只免疫相应疫苗一次，JZ-45/JZ-45、JZ-45/HB-98、HB-98/JZ-45、HB-98/HB-98联合免疫组采用相应疫苗在首免14 d后二免，对照组两次均接种DMEM培养液，免疫剂量均为200滋L(活疫苗含100 TCID50的活病毒)，免疫程序见表1；免疫后人工隔离饲养，并在0、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d对各组小鼠采血，分离血清后-20保存备用。陈雨，等.猪伪狂犬病灭活苗和弱毒苗联合免疫小鼠的免疫效果研究第9期9311.3各组小鼠血清PRV抗体及中和抗体水平的检测参照文献12中间接ELISA检测方法检测各组小鼠血清中的PRV抗体水平，判定标准按照S/N2.1时判为阳性。另外，将各组小鼠血清灭活后2倍倍比稀释(2129)，并与100 TCID50PRV JZ-45株病毒液混合(TCID50=10-6.58/0.1 mL)，37孵育1 h，接种至96孔板中的单层PK-15细胞，100滋L/孔。48 h72 h后观察各孔细胞病变效应(CPE)，依据CPE结果，测定上述各组小鼠血清的中和抗体效价，分析不同免疫组小鼠所产生的中和抗体水平。1.4小鼠攻毒保护试验最后一次免疫后42 d，利用PRV JZ-45株经腹股沟皮下注射方式对上述7组实验组小鼠攻毒(攻毒剂量：100 LD50，LD50=102.681/0.1 mL，100滋L/只)，攻毒后014 d内，观察小鼠临床症状，并统计其存活率，对比不同免疫组对小鼠攻毒后的免疫保护效果。1.5小鼠各组织病变观察对1.4中攻毒后14 d的各组小鼠剖杀，观察各脏器的剖检病变，并取小鼠脾脏和脑部组织制作组织病理切片，观察脾、脑组织的病理变化，并对不同免疫组小鼠攻毒后脏器的免疫保护效果进行分析。2结果2.1各组小鼠血清PRV抗体水平的检测结果采用PRV JZ-45灭活苗和HB-98弱毒苗以不同免疫程序免疫小鼠后，于不同时间对各组小鼠采血分离血清，采用间接ELISA检测各组小鼠血清PRV抗体水平。结 果 显 示，免 疫 后14 d，JZ-45、HB-98、JZ-45/JZ-45、JZ-45/HB-98、HB-98/JZ-45和HB-98/HB-98免疫组小鼠血清PRV抗体均转阳，而对照组小鼠血清抗体均为阴性。比较单次免疫组小鼠抗体水平的检测结果显示：免疫后028 d，单次免疫组小鼠血清的PRV抗体水平呈持续上升趋势，且在28 d达到峰值，随后逐渐下降；相较于JZ-45免疫组，HB-98免疫组小鼠PRV抗体水平不仅上升速度更快，且抗体水平更高。比较联合免疫组的检测结果显示：免疫后042 d，各联合免疫组小鼠血清PRV抗体水平均一直呈持续上升趋势；其中JZ-45/HB-98免疫组小鼠 血 清PRV抗 体 水 平 在 免 疫 后21 d42 d高 于JZ-45/JZ-45灭活疫苗免疫组，HB-98/JZ-45免疫组小鼠血清PRV抗体水平在免疫后21 d42 d高于HB-98/HB-98免疫组。比较单次免疫和联合免疫检测结果显示：联合免疫组小鼠血清PRV抗体水平从免疫后14 d起均极高于单次免疫组，且HB-98/JZ-45免疫组小鼠血清PRV抗体水平在免疫后21 d42 d，要高于其它免疫组(图1)。上述结果表明，6组免疫组小鼠均产生体液免疫反应，但联合免疫组小鼠产生的抗体水平极高于单次免疫组，且在联合免疫组中，HB-98/JZ-45免疫组小鼠血清中抗体水平最高。2.2各组小鼠血清PRV中和抗体水平的检测结果将小鼠血清灭活后2倍倍比稀释(2129)后与100TCID50PRV JZ-45株病毒液混合进行中和试验，每日观察CPE结果。结果显示：从免疫后7 d开始，均可从JZ-45、HB-98、JZ-45/JZ-45、JZ-45/HB-98、HB-98/JZ-45和HB-98/HB-98免疫组小鼠血清中检测到PRV中和抗体，且中和抗体水平持续上升，而对照组小鼠血清中和抗体水平均为0。比较单次免疫组的结果显示：相较于JZ-45免疫组，HB-98免疫组产生的中和抗体水平更高，速度更快，两组中和抗体水平均于免疫后28 d达到顶峰，随后下降。比较联合免疫组的结果显示：JZ-45/JZ-45、JZ-45/HB-98、HB-98/JZ-45HB-98JZ-45/JZ-45JZ-45/HB-98HB-98/JZ-45HB-98/HB-98Negativecontrol表1疫苗免疫程序10101010101010免疫剂量Immunizingdose200滋L200滋L200滋L200滋L200滋L200滋L200滋L首次免疫FirstimmunizationJZ-45HB-98JZ-45JZ-45HB-98HB-98DMEM二次免疫Secondaryimmunization/JZ-45HB-98JZ-45HB-98DMEM图1各组小鼠血清PRV抗体水平的检测结果Days after the first immunizationNegative controlHB-98/HB-98HB-98/JZ-45JZ-45/HB-98JZ-45/JZ-45HB-98JZ-451310741423528211470中 国 预 防 兽 医 学 报2023年932组别Group数量AmountJZ-45和HB-98/HB-98免疫组小鼠血清PRV中和抗体水平在042 d均呈持续上升趋势，且HB-98/JZ-45免疫组小鼠产生的中和抗体水平要高于其它组。比较单次免疫和联合免疫的结果显示：联合免疫组小鼠血清PRV中和抗体水平从免疫后14 d起均高于单次免疫组(图2)。该检测结果与间接ELISA方法检测的各组小鼠血清PRV抗体的检测结果一致，且两次免疫组小鼠产生的中和抗体水平均极高于单次免疫组，且在联合免疫组中，HB-98/JZ-45免疫组小鼠血清中和抗体水平最高，表明首免弱毒苗，二免灭活苗的免疫程序更有利于刺激小鼠机体产生中和抗体。2.3小鼠攻毒保护试验结果将上述各组小鼠攻毒后，在014 d内，观察各组小鼠临床症状，并记录其存活率，绘制小鼠生存曲线。结果显示：JZ-45免疫组小鼠在攻毒后3 d出现舔舐、啃咬注射部位的临床症状，第4 d有2只小鼠死亡，存活率为80%；HB-98免疫组小鼠在攻毒后3 d出现震颤，啃咬注射部位等症状，第4 d、5 d各死亡1只，存活率为80%；而联合免疫组小鼠，在持续观察的14 d内，均未出现明显临床症状及死亡。对照组小鼠在攻毒2 d开始出现PR典型临床症状，如舔舐、啃咬注射部位，四肢痉挛等；在第3 d开始出现死亡，第4 d对照组小鼠完全死亡(图3)。上述结果表明：联合免疫组比单免组免疫保护效果更好，攻毒后无死亡且无临床症状。2.4各组小鼠脾脏组织病变结果攻毒后14 d将各组小鼠剖杀，观察其剖检病变，并取其脾脏制作病理切片，观察其组织病理变化。结果显示：单免组小鼠脾脏有出血点，脾脏肿大；对照组小鼠脾脏明显肿大，出血，出现坏死灶；其他免疫组小鼠脾脏无明显症状。组织病理切片显示：JZ-45免疫组小鼠脾脏白髓细胞坏死，红髓有少量中性粒细胞浸润；HB-98免疫组脾脏生发中心扩张，红髓有大量多核巨细胞及中量的中性粒细胞；JZ-45/JZ-45免疫组脾脏白髓实质细胞减少，红髓有少量的中性粒细胞；JZ-45/HB-98免疫组脾脏白髓细胞灶性坏死,红髓有少量中性粒细胞；HB-98/JZ-45免疫组脾脏白髓有少量凋亡小体；HB-98/HB-98免疫组脾脏生发中心扩张，红髓有少量中性粒细胞；而对照组脾脏白髓灶性坏死，红髓中有大量中性粒细胞浸润(图4)。上述结果表明，免疫组小鼠脾脏病变程度明显轻于对照组，且6组免疫组小鼠脾脏组织病变中，HB-98/JZ-45免疫组病变程度最轻，表明该免疫程序对小鼠的免疫保护效果最好，能减少病毒对脾脏组织造成的损伤。2.5各组小鼠脑部组织病变结果攻毒后14 d将各组小鼠剖杀，观察其剖检病变，并取其脑组织制作病理切片，观察脑组织的病理变化。结果显示：除对照组小鼠脑组织脑膜处可见明显出血外其他免疫图2各组小鼠血清PRV中和抗体水平的检测结果陈雨，等.猪伪狂犬病灭活苗和弱毒苗联合免疫小鼠效果研究第9期933Days after the first immunizationNegative controlHB-98/HB-98HB-98/JZ-45JZ-45/HB-98JZ-45/JZ-45HB-98JZ-456543210423528211470图3各组小鼠攻毒后的生存曲线图4各组小鼠脾脏组织病理变化观察(HE伊200)Days after challengeNegative controlHB-98/HB-98HB-98/JZ-45JZ-45/HB-98JZ-45/JZ-45HB-98JZ-451008060402001412108642Negative controlHB-98/HB-98HB-98/JZ-45JZ-45/HB-98JZ-45/JZ-45HB-98JZ-4512组均无明显剖检。组织病理切片观察显示：JZ-45、HB-98和JZ-45/JZ-45免疫组均可观察到海马细胞胞核固缩深染，HB-98/HB-98免疫组可观察到脑组织的皮层 神 经 细 胞 核 固 缩 深 染；HB-98/JZ-45免 疫 组 和JZ-45/HB-98免疫组则无明显病变；对照组小鼠脑组织有炎性细胞点状浸润，海马细胞形状不规则，锥体细胞气球样变，核居中，胞质空泡化等病变(图5)。上述结果表明：与脾脏组织病变结果相同，免疫组小鼠脑组织病变程度明显轻于对照组，且HB-98/JZ-45免疫组和JZ-45/HB-98免疫组保护效果最佳。3讨论目前，疫苗免疫是防制PR的最有效措施。然而在2011年底，中国北方一些大型养猪场发生了严重的PR疫情，接种Bartha-K61疫苗的猪发病率和死亡率仍然较高13，且严重危害了仔猪和生长猪。而随后在中国北方的PR疫情导致全国一些被根除的猪场再次暴发PR疫情14。后经学者证明，该疫情的流行为PRV变异株引起，且变异株较经典株毒力更强15，不同的免疫程序对PR的防控存在差异，不同的疫苗接种次数与接种剂量，可以刺激机体产生针对PR变异株的更强、更持久的免疫保护效果16。弱毒苗的免疫原性良好，免疫期长；灭活苗的安全性好，但免疫效果不如灭活疫苗。本研究对比了两种疫苗的单次免疫效果，HB-98弱毒苗的免疫原性优于JZ-45灭活苗，该结论也与刘承军等得出的结论相符17。究其原因可能由于两种疫苗免疫机制存在差异，JZ-45灭活苗仅能诱导机体产生体液免疫反应，免疫效果明显差于弱毒苗，而HB-98弱毒苗相对于JZ-45灭活苗，不仅能够刺激小鼠产生体液免疫反应，还可以诱导其的细胞免疫反应，从而使小鼠血清中PRV抗体水平上升速度相对更快，抗体水平更高。因此，单次接种弱毒苗可以产生更快、更有效的保护效果。疫苗免疫需要多次免疫才能诱导机体产生良好的免疫保护。本实验通过对比不同疫苗组合免疫小鼠后的血清PRV抗体水平，发现在首次免疫的基础上加强免疫1次，小鼠血清PRV抗体水平要显著高于单次免疫组。为了使疫苗对机体产生的保护更持久，有研究表明，与使用针对相同抗原的同源疫苗相比，使用异源疫苗初免再加强免疫，其免疫原性及诱导机体产生的免疫应答更强18。此外，有研究发现，同源疫苗免疫易于诱导机体产生体液免疫反应，但诱导细胞免疫反应的能力较弱，而包含两种免疫原的联合免疫比单一免疫原疫苗的免疫效果更好19。本研究在首次免疫HB-98株弱毒苗的基础上再加强免疫JZ-45株灭活苗诱导小鼠产生的抗体水平高于其他免疫组，且后期组织病理切片观察结果与其相对应。该实验结果与吴志金等的研究结果相符20。表明不同疫苗的联合免疫方式相较于同种疫苗反复免疫的方式，更能激发机体产生独特的免疫反应，从而提高疫苗的免疫原性和免疫保护作用，诱导更高水平T细胞的产生，显著提高小鼠的免疫力，起到了良好的免疫效果21。据报道，引起PRV株的变异主要原因可能由于某些规模化养猪场免疫不同基因缺失减毒苗导致的不同疫苗株之间发生了重组，从而使其毒力返强。目前，PRV变异株的流行仍然对我国养猪业经济影响严重。本研究通过了解不同PRV免疫程序对小鼠免疫保护效果的差异，为后续PRV免疫程序的改进提供指导与借鉴，也为更好的控制PR提供参考。参考文献：TAN 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