菌根真菌对-(60)Co-...射后铁皮石斛种子萌发的影响_王淑华.pdf

核 农 学 报 2023，37（5）：08890896Journal of Nuclear Agricultural Sciences菌根真菌对60Co-辐射后铁皮石斛种子萌发的影响王淑华1 马艳军1，3 姚娜2 范可可1 胡晓萌1 江泽慧1，*胡陶1，3，*（1国际竹藤中心/国家林业和草原管理局重点实验室/北京竹藤科技研究中心，北京 100102；2中国林业科学研究院林业研究所/国家林业和草原局林木培育重点实验室，北京 100091；3广西凭祥竹林生态系统国家定位观测研究站，广西 凭祥 532600）摘 要：为了解60Co-射线对铁皮石斛种子萌发和幼苗形成产生的辐射效应，以及胶膜菌属（Tulasnella）菌根真菌对辐射后铁皮石斛种子萌发的影响，本研究采用不同梯度剂量（20120 Gy）60Co-射线辐射处理铁皮石斛种子，对辐射种子分别进行非共生萌发 1/2MS、燕麦培养基（OMA）、菌根真菌共生萌发（OMA接种菌株JL4、JL2）培养，比较分析非共生和共生培养方法对辐射种子萌发率和成苗率的影响，观察幼苗表型变化。结果表明，在非共生萌发（1/2MS）条件下，铁皮石斛种子半致死剂量为62 Gy，在与不同胶膜菌属菌株共生萌发后，半致死剂量为69 Gy（JL2）和63 Gy（JL4）。种子萌发率随辐射剂量的增高而降低，低剂量（20 Gy）处理加速了幼苗形成，高剂量处理（90、120 Gy）抑制了幼苗形成；培养115 d后，20 Gy处理成苗率较对照显著提高，分别达到18.26%（1/2MS）、15.00%（JL2）和17.86%（JL4）；高剂量（90、120 Gy）处理种子在共生萌发条件下可获得表型变化更明显的幼苗，具体表现为幼苗高长、假鳞茎粗壮。本研究将种子辐射与兰科菌根真菌共生萌发相结合，为促进铁皮石斛辐射种子恢复、提高辐射诱变效率、高效创造铁皮石斛新种质提供了技术参考和科学依据。关键词：兰科植物；胶膜菌属；辐射效应；共生萌发DOI：10.11869/j.issn.1000-8551.2023.05.0889铁皮石斛（Dendrobium candidum）为兰科多年生草本植物，是我国传统名贵药材，同时具有重要的生态价值和观赏价值1-2。当前，野生铁皮石斛资源濒临灭绝3，在保护铁皮石斛野生资源的前提下培育新品种将有助于石斛产业的发展4。60Co-辐射诱变因其成本低、穿透力强、突变率高等优势，与常规育种技术结合，在百合、牡丹、菊花等观赏植物中已得到广泛应用5-7。种子是辐射诱变中常用的材料8-10，但目前兰科植物诱变育种中多利用幼苗11、根状茎12和原球茎13作为辐射材料，辐射处理种子的相关研究较少。原因之一在于兰科植物种子细小，较难萌发，辐射对其损伤严重，显著降低其萌发率。有报道表明化学处理（水杨酸、褪黑素、赤霉素等）、光谱处理及激光或微波处理等可在一定程度上缓解植物辐射损伤，并提高其诱变率14-16。此外，60Co-辐射会显著降低植物内生真菌种群的多样性，破坏内生真菌群落的稳定性17，而对于真菌共生型植物，菌根真菌可增强植物的抗辐射能力18。其中铁皮石斛是典型的菌根真菌共生植物，自然条件下菌根真菌对铁皮石斛种子萌发和幼苗生长具有重要作用19。鉴于此，本研究选取显著促进铁皮石斛种子萌发的胶膜菌属菌株JL2、JL4，使其与60Co-辐射后的铁皮石斛种子建立共生关系，比较与菌株JL2、JL4共生萌发和在1/2MS培养基上非共生萌发这两类不同处理条件下，种子萌发率、成苗率的差异，分析菌根真菌对辐射后种子萌发和幼苗生长的影响，探索菌根真菌共生对促进铁皮石斛辐射突变材料的恢复培养和扩繁培养的潜在作用，以期为提高兰科植物种子辐射诱变育种效率提供数据依据。1材料与方法1.1试验材料铁皮石斛（Dendrobium candidum）、建兰（Cymbidium 文章编号：1000-8551（2023）05-0889-08收稿日期：2022-08-22 接受日期：2022-10-18基金项目：基本科研业务费专项资金（1632020001），国家自然科学基金（31700547），“十四五”国家重点研发计划（2021YFD2200505_1）作者简介：王淑华，女，主要从事园林植物遗传育种研究。E-mail：*通讯作者：江泽慧，女，教授，主要从事木材科学与技术研究。E-mail：；胡陶，男，副研究员，主要从事园林植物与观赏园艺研究。E-mail：。同为通讯作者。889核农学报37 卷 ensifolium）栽培于国际竹藤中心温室，植株生长健康。于2021年45月对铁皮石斛进行授粉，同年11月前收集成熟未开裂蒴果（图1-A），于4 条件下保存。供试菌株JL2与JL4为分离自建兰根部的两株菌根真菌（图1-B、C），将其与铁皮石斛种子共生萌发，为确定菌株在铁皮石斛原球茎中的定殖情况，对其进行真菌特异性染色20。1.2仪器与设备YT-CJ-2N型超净工作台，北京亚泰科隆实验科技开发中心；Axiocam Erc 5s Rev.2.0体视显微镜，德国Cart Zeiss显微镜有限公司。1.3试验方法1.3.1辐射处理将兰花蒴果表面用75%乙醇擦拭消毒，在超净工作台内剖开分装至1.5 mL无菌离心管中，在安徽合肥（国家）林业辐照中心进行60Co-辐射处理，辐射剂量为0（CK）、20、40、60、90、120 Gy，剂量率为32.2 Gyh-1，不同剂量梯度通过辐射时间控制。1.3.2辐射后种子萌发在超净工作台内，用无菌水将各剂量辐射后的种子制成悬浮液，播种于4种不同条件的培养基。依据是否接种真菌，培养条件可分为非共生萌发 1/2MS培养基（murashige and skoog medium with half strength MS macronutrients）、燕麦培养基（oat meal agar medium，OMA）和共生萌发（OMA 培养基+菌株JL2、OMA培养基+菌株JL4）。培养基主要成分如下：1/2MS 培养基1/2MS+6-苯甲基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）0.5 mg+-萘乙酸（-Naphthaleneacetic acid，NAA）0.1 mg+蔗糖30.0 g+琼脂6.0 g+活性炭 0.03 g+去离子水 1 000 mL，pH值6.36.5 和OMA培养基 1.0 g燕麦粉（Solarbio，北京）+6.0 g 琼脂+1 000 mL去离子水，自然pH值。在辐射种子共生萌发中，将各剂量辐射处理种子播于OMA培养基上，并接种培养7 d的真菌菌株。每个培养皿中播种 8001 000颗种子，各处理设 3 个重复。培养条件：温度（232），光照强度1 6002 000 lx，光周期14 h光/10 h暗。1.3.3菌根真菌的培养与鉴定菌株JL2（NCBI登录号：OP132532）和JL4（NCBI登录号：OP132533）培养在马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基（Difco，美国）上，（252）暗培养。为了确定菌株JL2和JL4在胶膜菌属真菌中的分类地位，从 NCBI数据库中下载已报道的胶膜菌属菌株的 ITS 序列，采用 MEGA-X 软件中的最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发育树，选用K2+G模型，设1 000次重复。1.3.4铁皮石斛种子萌发率、成苗率统计参照Stewart等21的方法，并进行适当修改，用05个阶段对种子萌发和原球茎生长情况进行分级描述，将发育至第2阶段的种子视为萌发（图2），在体视显微镜下统计种子的萌发率和成苗率，计算相对萌发率。种子萌发率=(S2+S3+S4+S5)/(S0+S1+S2+S3+S4+S5)100%；（1）成苗率=(S4+S5)/()S0+S1+S2+S3+S4+S5100%；（2）相对萌发率=（种子萌发率）/（0 Gy处理的种子萌发率）100%（3）式中，S0S5分别代表铁皮石斛种子萌发的第0阶段至第5阶段。1.4统计分析利用 SPSS 22.0软件，对不同萌发条件下辐射剂量0（CK）、20、40、60、90、120 Gy及其对应的种子相对萌发率进行线性回归分析。建立拟合线性回归方程Y=bX+a，求算参数 a、b的值和决定系数（R2），以检注：A：铁皮石斛蒴果；B：菌株JL2；C：菌株JL4。Note：A：Capsules of D.candidum.B：Strain JL2.C：Strain JL4.图1 铁皮石斛蒴果与菌根真菌菌落形态Fig.1Capsules of D.candidum and morphology of mycorrhizal fungi注：0：种子未萌发；1：胚形成假根；2：胚变大，种皮破裂；3：原分生组织出现；4：第一片真叶出现；5：第二片真叶出现。Note：0：No germination.1：Production of rhizoids by the embryo.2：Rupture of testa by enlarged embryo.3：Appearance of promeristem.4：Appearance of first ture leaf.5：Appearance of second ture leaf.图2 种子萌发阶段标准Fig.2Standard of seed germination stages8905 期菌根真菌对60Co-辐射后铁皮石斛种子萌发的影响验方程拟合优度；其中，Y为种子相对萌发率，X为辐射剂量；Y=50%时的X值为半致死剂量（LD50）22。运用 SPSS 22.0 软件，将种子萌发率和成苗率的百分数结果进行反正弦转换：y=sin-1 x；将转换后的数据进行方差分析和事后多重比较。当方差齐性时，事后多重比较采用 LSD 法；方差不齐时，采用 Games-Howell法。2结果与分析2.1菌根真菌分子鉴定与定殖观察由系统发育树（图 3）可知，JL2、JL4 为胶膜菌属（Tulasnella sp.）菌株。对与真菌共生萌发的原球茎进行染色，结果表明，真菌菌丝可定殖在原球茎基部细胞内，形成兰科菌根典型的胞内菌丝团结构（图4）。2.260Co-辐射对铁皮石斛种子萌发的影响培养50 d时统计铁皮石斛种子的萌发率，计算相对萌发率。由表1可知，不同剂量辐射后的铁皮石斛种子在非共生萌发（1/2MS）和共生萌发（菌株 JL2、JL4）培养条件下，萌发率均随辐射剂量的升高而降低，其中，20 Gy处理的种子萌发率显著高于其他辐射剂量处理种子萌发率，40和60 Gy处理下的种子萌发率差异不显著（表1）；在OMA培养基上非共生萌发的种子均未萌发；辐射剂量为40、60和120 Gy时，与菌株JL2注：采用基于内部转录间隔区序列（ITS）的最大似然法（ML）构建菌株JL2、JL4与胶膜菌属真菌系统发育树。标记ML自展值（bootstrap value）50的分支结点。Note：The phylogeny tree of Tulasnella isolates JL2 and JL4 and related fungi based on maximum likelihoods（ML）analysis based on internal transcribes spacer（ITS）sequences.Branches are labeled based on ML bootstrap 50%.图3 菌根真菌菌株JL2、JL4的系统发育树Fig.3Phylogenetic tree of mycorrhizal fungi JL2 and JL4注：SC：盾片（原球茎阶段）；P：菌丝团；C：单细胞。Note：SC：Scutellum（protocorm stage）.P：Peloton.C：Single cell.图4 真菌在铁皮石斛原球茎和细胞内的定殖Fig.4Fungal colonization in D.candidum protocorm and cell891核农学报37 卷 共生萌发的种子相对萌发率最高；辐射剂量为 20和90 Gy 时，非共生萌发（1/2MS）的种子相对萌发率最高。以表1中6个辐射剂量梯度和相对萌发率为基础，得 到 1/2MS 萌 发 条 件 下 的 线 性 回 归 方 程 为y=-0.809x+100.266（R2=0.962），LD50为 62 Gy；与菌株JL2共生萌发条件下的线性回归方程为y=-0.739x+100.973（R2=0.946），LD50为69 Gy；与菌株JL4共生萌发条件下的线性回归方程为y=-0.786x+99.253（R2=0.978），LD50为 63 Gy（图 5）。结果表明，与菌株JL2、JL4共生萌发的铁皮石斛种子半致死剂量均高于1/2MS培养基上萌发的种子，其中与菌株JL2共生萌发的种子半致死剂量较1/2MS培养基上萌发种子提高了7 Gy。2.360Co-辐射对铁皮石斛成苗率的影响分别在培养 50 和 115 d 时统计铁皮石斛的成苗率，以确定不同培养条件下辐射对早期幼苗形成的影响（表2）。培养50 d时，在1/2MS培养基上仅20 Gy处理有幼苗形成，成苗率为 3.02%（图 6、表 2）；与菌株JL2、JL4共生萌发条件下，20 Gy处理种子的成苗率显著高于对照（0 Gy）和其他辐射剂量，分别为11.92%和36.94%，在非共生培养OMA培养基上所有处理均无幼苗形成（图6、表2）。培养115 d时，在1/2MS、JL2和JL4三种培养条件下，0 Gy和20 Gy处理成苗率差异不显著，但显著高于其他辐射剂量（表2）；在与半致死剂量最接近的60 Gy处理下，石斛种子与菌株JL2、JL4共生萌发的成苗率显著高于1/2MS培养基上的种子成苗率（P0.05），其中与菌株JL4共生萌发成苗率可高达3.74%；当辐射剂量提高至90 Gy时，共生萌发种子的成苗率依然显著高于1/2MS培养基上萌发的种子（P60 Gy）下的成苗率。表1不同60Co-辐射剂量对铁皮石斛种子萌发率的影响Table 1Effects of different radiation doses on germination rates of D.candidum seeds/%辐射剂量Irradiation dose/Gy0204060901201/2MS萌发率Germination rate81.711.28a77.302.01a51.055.47b35.561.07b19.961.54c7.901.81d相对萌发率Relative germination rate100.0094.6062.4843.5224.439.66OMA+JL2萌发率Germination rate92.602.13a84.282.66b61.186.56c59.276.68c20.309.53d17.655.66d相对萌发率Relative germination rate100.0091.0166.0764.0021.9219.06OMA+JL4萌发率Germination rate86.284.95a71.504.40b54.105.12c52.695.03c20.037.65d5.280.73e相对萌发率Relative germination rate100.0082.8762.7161.0723.226.12OMA萌发率Germination rate0.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00相对萌发率Relative germination rate0.000.000.000.000.000.00注：同列不同小写字母表示不同辐射剂量之间差异显著（P60 Gy）处理的种子与菌株JL2、JL4共生萌发后可获得更多的诱变幼苗，表明菌株JL2和JL4对辐射处理后种子的生长具有一定的恢复作用。这与其他研究者关于内生真菌和丛枝菌根真菌通过侵染植物形成共生体以增强宿主在逆境条件下生存能力的报道相一致32。同时也表明，今后可通过与适宜真菌菌株共生培养，来提高铁皮石斛诱变材料在后期生长中的恢复能力和成活率。4结论共生与非共生培养下，铁皮石斛种子萌发率随辐射剂量的增加呈下降趋势，较高剂量对幼苗形成有抑制作用，20 Gy处理可促进铁皮石斛种子快速成苗，为缩短育种周期、快速扩繁提供技术参考。菌株JL2和JL4可在一定程度上提高铁皮石斛种子的辐射耐受能力，恢复辐射处理种子的生长分化能力。高剂量（90、图7 各剂量辐射处理的铁皮石斛种子在不同培养条件下形成的幼苗形态Fig.7Seedlings morphology of D.candidum seeds treated with various radiation doses under different culture conditions8945 期菌根真菌对60Co-辐射后铁皮石斛种子萌发的影响120 Gy）辐射的种子与JL4共生萌发可获得表型变化更明显的幼苗。兰科植物种子细小且数量多，因此为获得表型变化明显的突变株，可适当提高辐射剂量，并对辐射种子进行菌根真菌共生萌发培养。参考文献：1 Lin X L，Zhou Y J，Zhong J H，Zhu J H，Chen X R，Lin Y G，Huang M C，Yang L H，Zhang Z.Imitated ecological cultivation technology of Dendrobium offcinale：A case study of Longshitou Village，Longmen County J.Plant Diseases and Pests，2021，12（2）：24-262 王兆春.铁皮石斛接种枝孢霉菌的响应机制及其种子萌发关键环境因子研究 D.重庆：西南大学，20193 陈晓梅，田丽霞，单婷婷，孙乐，郭顺星.铁皮石斛种质资源和遗传育种研究进展 J.药学学报，2018，53（9）：1493-15034 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Grassland Administration，Beijing 100091；3Pingxiang Bamboo Forest Ecosystem Research Station，Pingxiang，Guangxi 532600）Abstract：To understand the effects of 60Co-irradiation on seed germination and seedling formation of Dendrobium candidum，as well as the effect of orchid mycorrhizal fungi on the germination of irradiated seeds，D.candidum seeds were irradiated with 60Co-rays at doses ranging from 20 to 120 Gy.The irradiated seeds were then treated with two methods：asymbiotic germination on 1/2 MS medium or OMA medium and symbiotic germination with Tulasnella sp.JL2 or JL4.The germination rates and seedling formation rates of irradiated seeds with two culture methods were compared and analyzed，and the phenotypic changes of seedlings were observed.The results showed that the semi-lethal dose of asymbiotically germinated seeds on 1/2 MS medium was 62 Gy，and the semi-lethal dose of symbiotically germinated seeds was 69 Gy（JL2）and 63 Gy（JL4），respectively.With increasing irradiation dose，seed germination rates were decreased.Low dose（20 Gy）treatment increased seedling formation rates，while high dose treatments inhibited seedling formation rates（90，120 Gy）.After 115 days of growth，the seedling formation of seeds treated with 20 Gy ray was much improved than the 0 Gy control，reached up to 18.26%（1/2 MS），15.00%（JL2），and 17.86%（JL4），respectively.Seedlings germinated after high dose（90，120 Gy）treatments had more pronounced phenotypic changes during symbiotic germination，including taller seedlings and sturdier pseudobulb.We combined seed irradiation with orchid mycorrhizal fungi symbiotic germination in this study，which offers a technical reference and scientific foundation to promote the recovery of irradiated D.candidum seeds，improve the irradiation mutagenesis efficiency，and effectively produce new D.candidum germplasm.Keywords：Orchidaceae，Tulasnella，irradiation effect，symbiotic germination896