重组小反刍兽疫病毒血凝素蛋白纯化体系的优化.pdf

D79-08ChineseVeterinaryScience网络首发时间：2 0 2 2-12-142024,54(01):79-86中国兽医科学0l:10.16656/j.issn.1673-4696.2023.0043中图分类号：S852.659.5文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 9 6(2 0 2 4)0 1-0 0重组小反兽疫病毒血凝素蛋白纯化体系的优化胡林杰朱学亮彭泓蛟邓瑞雪潘春容孙跃峰蒙学莲*（中国农业科学院完兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室，甘肃青兰州730046)摘要：本试验利用发酵技术诱导表达了小反幺兽疫病毒H蛋白胞外区（PPRVtH)，优化建立了一套纯化重组PPRVtH的完整工艺体系。通过发酵表达获得的10 L菌液，菌体湿重约达30 g/L,，均质机破碎菌体获得包涵体；Tris-0缓冲液（pH=8.0）洗涤包涵体3次，每1g包涵体加入5mL含2 0 mmol/L咪唑的Tris-E缓冲液(pH=8.0)重悬，4温和旋转溶解过夜，离心收集上清；按体积比1：2 将层析填料ChelaingSepharoseFastFlow与上清混匀，以流速12 mL/min加入层析柱；依次通过10 倍柱体积含50、10 0、40 0 和50 0 mmol/L咪唑的Tris-E缓冲液（pH=8.0）,4静置2 h进行洗脱。优化后的纯化体系可得到较纯的重组PPRVtH蛋白，利用灰度分析可知纯化后的重组PPRVtH蛋白纯度能达到8 5%。本试验提供的纯化体系可快速、简便、低成本、大批量纯化重组PPRVtH蛋白，而且纯化获得的PPRVtH蛋白具有良好的反应原性关键词：小反幺兽疫病毒；血凝素蛋白；蛋白纯化；优化Optimization of the purification system of recombinant hemagglutininprotein from peste des petits ruminants virusHU Linjie,ZHU Xueliang,PENG Hongjiao,DENG Ruixue,PAN Chunrong,SUN Yuefeng,MENG Xuelian*(State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention/Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academyof Agricultural Sciences,Lanzhou 730046,China)Abstract:In this experiment,the extracellular domain of hemagglutinin of peste des petits ruminantsvirus(PPRV tH)was expressed by fermentation technology,and a complete purification system for PPRV tHwas established by optimization.The cell wet weight was about 30 g per liter of culture broth by fermentation.The inclusion body was obtained by homogenizer and washed three times with Tris-0 buffer(pH=8.O).Thenper l g of inclusion bodies was resuspended with 5 mL Tris-E buffer(pH=8.0)containing 20 mmol/L imidazole,and dissolved overnight at 4 C by gentle rotation.The supernatant was retained by centrifugation.TheChelaing Sepharose Fast Flow was mixed with the supernatant at a volume ratio of 1:2 and added to thecolumn at a flow rate of 12 mL/min.The recombinant PPRV tH was eluted by passing through 10 times thecolumn volume of Tris-E buffer(pH=8.0)with a stepwise gradient of imidazole(50,100,400 and 500 mmol/L)for2 h at 4 C.The purity of purified recombinant PPRV tH protein using optimized purification system canreach 85%by gray scale analysis.Its fast,simple,low cost and higher final purity properties make itexcellent for purifing the recombinant PPRV tH in this experiment and the purified PPRV tH protein hasgoodreactogenicity.Key words:peste des petits ruminants virus;haemagglutinin protein;protein purification;opti-mization收稿日期：2 0 2 2-11-14；修回日期：2 0 2 2-12-0 7基金项目：边境地区和重要口岸动物病原监测溯源技术研究项目（2 0 2 1YFD1800500）；兰州市人才创新创业项目（2 0 2 2-RC-22）作者简介：胡林杰（1998-），男，湖北利川人，硕士生，主要从事动物传染病预防和控制相关研究，E-mail：h u l i n j i e 0 315 16 。*通讯作者：蒙学莲（197 5-），女，甘肃靖远人，副研究员，博士，主要从事病原分子生物学与免疫学方面的研究,E-mail:。80第54卷中国兽医科学*Corresponding author:MENG Xuelian,E-mail:小反台兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV）属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属（Morbillivirus）,是一种有囊膜的单股负链RNA病毒，感染山羊、绵羊等小反台动物引起一种具有高度传染性的烈性疾病-与小反含兽疫（pestedespetitsruminants,PPR）。PPR最早记载发生于非洲，现已蔓延到包括中东、亚洲和欧洲在内的约7 0 个国家和地区2-31,每年造成15亿2 0 亿美元的经济损失。PPR被OIE列为法定必须报告的动物疫病，我国将其规定为一类动物疫病。PPR于2 0 0 7 年首次传人我国，虽然在有效的措施下控制了疫情，但2 0 13年该病再次从新疆传人并迅速波及全国，严重危害了我国的养羊业，成为困扰养殖业持续健康发展的一个突出问题4。2 0 12 年国务院办公厅明确将PPR列人13种重点防范的外来动物疫病。2 0 15年,FAO和OIE组织在科特迪瓦召开全球部长级会议，通过并启动全球小反台兽疫控制与根除策略。PPRV基因组从3 端至5 端依次分布着6 个基因 N-P-M-F-H-L,对应编码6 种结构蛋白和2 种非结构蛋白5-7 ,其中H基因编码含有6 0 9个氨基酸的血凝素（hemagglutinin,H)蛋白，包括N末端胞质尾区、跨膜区（TM）、茎区（Stalk）和与受体结合的C末端头结构域(headdomain)8)。H 蛋白是一种I型跨膜糖蛋白，构成病毒粒子表面的纤突,具有神经氨酸酶活性和血凝素作用,且含有T细胞决定簇,是麻疹病毒属结构蛋白中最易变异的蛋白。作为病毒表面的主要抗原成分,H蛋白与宿主细胞表面病毒受体发生结合，调节病毒吸附并侵人细胞，诱导机体产生中和抗体，参与体液保护性免疫9随着对PPRV研究的不断深入，关于表达PPRVH蛋白的报道日益增多。Seth10等利用哺乳动物细胞表达的PPRVH蛋白也具有生物活性。Balamurugan等1 通过Vero细胞系表达了PPRVH蛋白，并评估了其作为酶联免疫吸附反应诊断抗原的潜力。蒙学莲等12 1分别利用原核和真核表达系统研究了PPRVtH蛋白的表达特点。李丹等13 利用原核表达系统制备的PPRVH蛋白具有良好的免疫原性及反应原性，能诱导小鼠产生保护性中和抗体。虽然国内外学者利用多种表达系统对重组PPRVH蛋白的表达条件进行了研究，但关于重组PPRVH蛋白的纯化条件还没有确定，尤其是适用于批量化纯化工艺参数。在生物材料和技术的发展下，蛋白纯化通用型工艺已成熟，但就特定蛋白的个性化纯化工艺仍需确定。因此，本试验从蛋白纯化技术的各个环节着手，利用不同的生物材料，优化建立了一种操作简单、效率高、成本低廉的重组PPRVtH蛋白纯化工艺体系。1材料与方法1.1重组菌株、血清携带pET30a-tH重组菌BL21（D E3）和绵羊抗PPRV阳性血清均由本实验室保存1.2主要试剂HRP标记的家兔抗小鼠IgG、H RP标记的家兔抗山羊IgG购自武汉三鹰生物技术有限公司。Ni-NTAAgarose 购自QIAGEN公司。Ni Sepharose FastFlow购自cytiva公司。Chelaing SepharoseFastFlow购自百川开泰生物技术（北京）有限公司。其它试剂均为国产分析纯1.3主要溶液Tris-0缓冲液：Tris2.42g,NaCl11.6g,加适量水溶解，分别调pH值至6.5、7.4、8.0、8.3，定容到1 000mL。PBS-0 缓冲液:0.5mol/LNaH,PO19mL,0.5mol/LNazHPO481mL,NaCl29.3g,加适量水溶解，分别调pH值至6.57.4、8.0、8.3，定容到10 0 0 mL；Tris-1缓冲液：Urea360g,加Tris-0缓冲液（pH值为8.0)溶解，定容至10 0 0 mL；T r is-2 缓冲液：咪唑34g,Urea360g,加Tris-0缓冲液（pH值为8.0)溶解，定容至10 0 0 mL；PBS-1缓冲液：Urea480g，加PBS-0缓冲液(pH值为7.4)溶解，定容至10 0 0 mL；PBS-2缓冲液：咪唑34g,Urea480g,加PBS-0缓冲液(pH值为7.4)溶解，定容至10 0 0 mL。表1不同咪唑浓度Tris-E/PBS-E缓冲液配制Table1Preparation of Tris-E/PBS-E buffer with differentimidazole concentrationsTris-1/PBS-1Tris-2/PBS-2咪唑浓度/(mmol-L-)缓冲液/mL缓冲液/mL10982209645090108084161008020200604030040604002080500010081胡林杰等：重组小反乌兽疫病毒血凝素蛋白纯化体系的优化第1期1.4重组蛋白诱导表达条件的优化将复苏的携带pET30a-tH重组菌BL21(DE3)按照1%接人含卡那霉素的LB培养基中,37 培养3h，加人0.2 mmol/LIPTG30诱导8 h。按照此条件分别利用摇床、发酵罐进行诱导表达，分别收集、称重两种条件下表达的菌体。每1g湿重菌体重悬于10 mLPBS-0（p H=7.4），均质机（ATS)破碎(1 000 bar,100mL/min)2次,130 0 0 r/min离心15min，收集沉淀（即包涵体）。取1g包涵体溶解于5mLPBS-1缓冲液中,4温和旋转过夜，4、12 0 0 0r/min、离心30 min，收集上清；取上清液7 5L与2 5L4蛋白Loadingbuffer混匀后制样，每孔上样15L进行SDS-PAGE分析1.5蛋白纯化缓冲液的优化取两等份包涵体，分别用pH值为7.4的PBS缓冲液和Tris缓冲液进行纯化，具体步骤如下：分别利用Tris-0、PBS-0 缓冲液洗涤包涵体,4、4000r/min、离心30 min，弃上清，收集沉淀，重复洗涤3次；称取洗涤后的包涵体，每1g包涵体溶解于5mL含2 0 mmol/L咪唑的Tris-E或PBS-E缓冲液中，4温和旋转过夜，4、12 0 0 0 r/min、离心30min，收集上清（即粗蛋白溶液）；按体积比1：8 将层析填料与上清混匀，亲和结合，形成结合悬液；将结合悬液以流速12 mL/min加入层析柱；依次通过10 个柱体积含不同浓度（2 0、50、8 0、10 0、2 0 0、400、50 0 m m o l/L)咪唑的Tris-E或PBS-E缓冲液进行洗脱，除去未结合的PPRVtH蛋白和其他蛋白，得到纯化的重组PPRVtH蛋白，进行SDS-PAGE检测1.6蛋白纯化缓冲液pH值的优化取4g包涵体，分成4等份。配制含不同咪唑浓度的Tris-E缓冲液各4等份，分别将pH值调至6.5、7.58.0、8.3,按照1.5的操作步骤进行纯化和检测1.7蛋白和填料结合时间的优化取40 mL粗蛋白溶液，分成5等份，分别在直接加入层析柱(0 h)及4温和旋转1、2、4、8 h条件下与1mL的填料结合，结合后按照1.5步骤操作，依次用含40、8 0、10 0、50 0 mmol/L咪唑的洗脱液(pH=8.0)进行洗脱,SDS-PAGE检测1.8蛋白洗脱时间的优化取2 4mL粗蛋白溶液，分成3等份，每份粗蛋白溶液与层析填料混匀后直接加人层析柱，加人洗脱液后分别于4静置0、2、4h后再收集洗脱的蛋白溶液，依次加入的不同咪唑浓度洗脱液均根据组别静置相同的时间，其余纯化步骤同1.5，进行SDS-PAGE检测1.9层析填料的筛选取2 4mL粗蛋白溶液，分成3等份，分别与三种不同公司的填料（Ni-NTAAgarose、c y t i v a Ni Se p h a r o s eFastFlow、Ch e l a i n g Se p h a r o s e Fa s t Fl o w)进行结合；加人洗脱液后静置2 h后再收集蛋白溶液，其余纯化步骤同1.5,进行SDS-PAGE检测1.10层析填料用量的优化取14mL粗蛋白溶液，分成3等份，按不同体积比(1:2、1：4、1：8)将层析填料ChelaingSepharoseFastFlow与粗蛋白溶液分别结合，按照1.9步骤进行纯化，SDS-PAGE检测1.11Western-blot检验将未诱导菌体、诱导表达菌体、纯化的tH蛋白的样品进行Western-blot试验，一抗选用绵羊抗PPRV阳性血清，二抗选用HRP标记家兔抗山羊IgG。2结果2.1重组蛋白诱导表达条件的优化在摇床中小量诱导表达的菌体湿重约3g/L，大量发酵诱导表达的菌体湿重约30 g/L，可知发酵大量诱导表达菌体约为小量诱导表达的10 倍。重组PPRVtH蛋白的相对分子量约6 8 ku(图1）,发酵诱导的蛋白表达量明显大于在摇床中诱导的。M12M3475ku50ku图1不同条件下诱导表达重组pET30a-tH蛋白的比较Figure 1 Comparison of expression levels of recombinant pro-tein pET30a-tHinduced under different conditionsM：预染蛋白Marker;l：在摇床中诱导表达的pET30a-tH;2：在摇床中用IPTG诱导表达的pET30a-Th；3：在发酵罐中诱导表达的pET30a-Th;4:在发酵罐中用IPTG诱导表达的pET30a-tH。M:Pre-stained protein marker;1:pET30a-tH without induction in shaker;2:pET30a-tH induced with IPTG in shaker;3:pET30a-tH without induc-tion in fermentor;4:pET30a-tH induced with IPTG in fermentor.2.2蛋白纯化缓冲液的优化本研究对比了磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液对蛋白纯化效果的影响。由结果可知（图2）,利用磷酸82第54卷中国兽医科学盐缓冲液进行纯化时，2 0 mmol/L咪唑洗脱出现了明显的目的条带，但是杂蛋白比较多，其他咪唑浓度洗脱蛋白条带很弱或没有条带；Tris缓冲液纯化时，不同浓度咪唑洗脱均出现了目的蛋白条带，其中40 0 和50 0 mmol/L咪唑洗脱的目的蛋白纯度较高。因此，确定Tris缓冲液更适合用于PPRVtH重组蛋白的纯化。M123456M789101112131475ku75ku一60 ku60ku一图2 缓冲液对pET30a-tH重组蛋白纯化效果比较Figure 2 Comparison of purification effect of recombinant protein pET30a-H using different buffersM：预染蛋白Marker;1、7：流穿液；2 6：分别用含2 0、8 0、10 0、40 0 和50 0 mmol/L咪唑的PBS缓冲液洗脱的产物；8 14：分别用含2 0、50、8 0、100、2 0 0、40 0 和50 0 mmol/L咪唑的Tris缓冲液洗脱的产物。M:Pre-stained protein marker;land 7:Flow through liquid;2-6:Products eluted by PBS buffer with imidazole at 20,80,100,400 and 500mmol/L,respectively;814:Products eluted by Tris buffer with imidazole at 20,50,80,100,200,400 and 500mmol/L,respectively.2.3缓冲液pH的优化本研究对比了Tris缓冲液分别在pH值为6.5、7.5、8.0、8.3时对重组PPRVtH蛋白纯化的影响。由结果可知(图3),虽然4个pH值缓冲液在含2 0 mmol/L咪唑时洗脱目的蛋白的条带明显，但杂蛋白较多；在含50 0 mmol/L咪唑洗脱时杂蛋白较2 0 mmol/L咪唑洗脱的少;pH值为8.0 和8.3缓冲液洗脱目的蛋白的量较pH值为6.5和7.5的高。综合考虑，选择pH值为8.0 Tris缓冲液用于纯化PPRVtH重组蛋白。2.4蛋白和填料结合时间的优化本研究比较了表达产物和填料结合0、1、2、4、8h后纯化获得重组PPRVtH蛋白的效果。由结果可知（图4），在结合时间为0 h,500mmol/L咪唑缓冲液洗脱重组PPRVtH蛋白的量最大，随着结合时间的增加，目的蛋白的洗脱量随之降低。因此,确定用于纯化重组PPRVtH蛋白的结合时间优选Oh，即粗蛋白溶液与层析填料混匀后直接加入层析柱2.5蛋白洗脱时间的优化本研究比较分析了加人洗脱液后静置0、2 和4 h对纯化重组PPRVtH蛋白的影响。由结果可知（图5），加人洗脱液静置4h后再收集洗脱液，其所含目的蛋白量达到最大，但是杂蛋白的含量也随之增加；静置2 h后获得的目的蛋白量相对于4h的少，但是纯度更高。综合考虑，选择加人洗脱液于M1234567870ku50ku图3不同pH值Tris缓冲液纯化重组PPRVtH蛋白的效果比较Figure 3 Comparison of purification effects of recombinantH protein by Tris buffer with different pH valueM预染蛋白Marker;1、3、5、7:分别在pH值为6.5、7.5、8.0 和8.3用含有2 0 mmol/L咪唑的Tris-E缓冲液洗脱的产物;2、4、6.8：分别在pH值为6.5、7.5、8.0 和8.3用含有50 0 mmol/L咪唑的Tris缓冲液洗脱的产物。M:Pre-stained protein marker;1,3,5,7:Products eluted with Tris-Ebuffer containing 20 mmol/L imidazole at pH 6.5,7.5,8.0 and 8.3,re-spectively;2,4,6,8:Products eluted with Tris buffer containing 500mmol/L imidazole at pH 6.5,7.5,8.0 and 8.3,respectively.4静置2 h后再收集洗脱的重组PPRVtH蛋白2.6层析填料的筛选本研究比较了三种填料（A：Ni-NT A A g a r o s e、B:cytiva Ni Sepharose 6 Fast Flow,C:Chelaing SepharoseFastFlow)对重组PPRVtH蛋白的纯化效果。由图683胡林杰等：重组小反台兽疫病毒血凝素蛋白纯化体系的优化第1期0h1h2h4h8hM 1 2 345M12345M12345M12.345M 1 2 34575ku-75ku75kur75ku75ku60ku60kur60kur60ku60ku-图4结合0、1、2、4、8 h对纯化重组PPRVtH蛋白的效果比较Figure 4Comparison of the effect of binding 0,1,2,4 and 8 h on purification of recombinant PPRV tHM：预染蛋白Marker;1流穿液；2 5：分别用含40、8 0、10 0 和50 0 mmol/L咪唑的Tris-E缓冲液洗脱的产物。M:Pre-stained protein marker;1:Flow through liquid;25:Products eluted with Tris-E buffer with imidazole at 40,80,100 and 500 mmol/L,re-spectively.0h2h4hM 1 2 3 4M2.341M123470ku-70 kur70ku50ku-50kur50ku-图5洗脱时间对重组PPRVtH蛋白纯化效果的影响Figure5Effect of elution time on purification of of recom-binant PPRV tHM：预染蛋白Marker；1：流穿液；2 4：分别用含40 10 0 和50 0 mmol/L咪唑的Tris-E缓冲液洗脱的产物。M:Pre-stained protein marker;1:Flow through liquid;2-4:Productseluted by Tris-E buffer with imidazole at 40,100 and 500mmol/L,re-spectively.ABCM123M1234M2370 ku-70ku70ku-50ku-50ku-50ku-图6 层析填料的筛选Figure 6 Screening of chromatographic packingM：预染蛋白Marker;1：流穿液；2 4：分别用含40、10 0 和50 0 mmol/L咪唑的Tris-E缓冲液洗脱的产物。M:Pre-stained protein marker;1:Flow through liquid;24:Productseluted with Tris-E buffer with imidazole at 40,100 and 500 mmol/L,re-spectively.可知，相对比其他两种层析填料，Chelaing SepharoseFastFlow更适合用于重组PPRVtH蛋白的纯化2.7层析填料用量的优化本研究比较了层析填料Chelaing SepharoseFastFloW与粗蛋白溶液不同结合比例对纯化重组PPRVtH蛋白的影响。由图7 可见，发现层析填料与包涵体溶液的体积比为1：2 时较1：4、1：8 的纯化效率更高。所以，优选Chelaing SepharoseFast Flow与包涵体溶液以体积比1：2 用于纯化重组PPRVtH蛋白。2.8重组蛋白的鉴定纯化的PPRVtH经10%聚丙酰胺凝胶电泳后转印到NC膜上，利用山羊抗PPRV阳性血清进行Western-blot检测，在约6 5ku处出现一反应条带，说明纯化的重组PPRVtH蛋白具有良好的反应原性(图8)。3讨论随着基因工程技术的不断发展，重组蛋白的生产可通过上游表达和下游纯化技术来实现，其中下游的分离纯化技术是重组蛋白生产的关键。大肠杆菌表达系统作为常见的原核表达系统广泛应用于蛋白药物的表达以及基因工程疫苗的研制14,大肠杆菌具有生长快速、培养简单、遗传背景清晰等特点，有利于规模化大批量表达。层析分离技术是目前用于蛋白纯化的核心技术手段，包括离子交换层析、亲和层析、疏水层析以及凝胶过滤层析等15-16 。亲和层析是利用固定相配基与蛋白质配体间的特异性亲和力的差异而分离配体的方法，其二者的结合是可逆的17 。金属鳌合亲和层析技术是近几十年来建立的84第54卷中国兽医科学1:21:41:8M123456M 1 2 3 4 56M12345670 ku70ku-70ku-50ku-一50ku-50ku图7 层析填料用量的优化Figure 7Optimization of chromatographic packing dosageM：预染蛋白Marker;1：流穿液；2 6：分别用含2 0、50、10 0、40 0 和50 0 mmol/L咪唑的Tris-E缓冲液洗脱的产物。M:Pre-stained protein marker;1:Flow through liquid;2-6:Products eluted with Tris-E buffer with imidazole at 20,50,100,400 and 500 mmol/L,respectively.M12370ku50ku一图8 重组蛋白的鉴定Figure 8Identification of recombinant proteinM：预染蛋白Marker；1：未诱导的PPRVtH;2：诱导表达的PPRVtH；3:纯化的PPRVtH。M:Pre-dyed protein marker;l:Recombinant PPRV tH without induc-tion;2:Unpurified recombinant PPRV tH;3:Purified recombinantPPRV tH.一种蛋白分离纯化技术，具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为重组蛋白产品最有效的技术之一。由于重组蛋白的性质以及自身结构功能的差异性，目前还没有一套可以完全适用于所有重组蛋白纯化的工艺体系18 。目前的蛋白纯化方法除了根据蛋白的分子量、pI值、疏水性、带电性等特性选择适合的纯化方法外，还需结合研究对象的具体情况选择合适的亲和标签，合适的亲和标签不仅可以提高蛋白的产量，还能增强重组蛋白的可溶性和促进重组蛋白的正确折叠，极大的提高了纯化蛋白的浓度和纯度。亲和标签可以分为以His、FLA G 为代表的结合固定化配基的短肽标签和以GST、M BP为代表识别小分子配基的蛋白标签，其中His标签是重组蛋白表达纯化中使用最为广泛的亲和标签，具有不影响目标蛋白理化性质、不改变目标蛋白的可溶性以及对目标蛋白结构几乎也没有影响等特点，而且当我们采用金属螯合亲和层析纯化带有His标签的蛋白时,操作非常简便高效19。因此，通过对目标蛋白特征、用途和纯化技术特点的综合考量，设计最优的纯化工艺，来获得最大的回收率。PPRVH蛋白是重要的多功能糖蛋白，是PPRV病毒蛋白中最重要的抗原决定簇和免疫原性最强的蛋白，能够刺激机体产生中和抗体，诱导宿主细胞产生体液免疫应答,在病毒感染初期,H蛋白与SLAM和Nectin-4两个细胞受体相互结合，介导病毒侵人宿主细胞。PPRVN蛋白因其丰富的含量和强免疫原性常被作为病毒诊断方法的研究对象，但由于N蛋白在麻疹病毒属中具有高保守性且不能诱导机体产生保护性抗体，所以基于N蛋白建立的检测方法和同属的其他病毒具有交叉反应，而且不能评判现用疫苗的保护率。H蛋白作为检测抗原的优势在于能够检测临床样本中的中和抗体，可实现对疫情的精准防控和疫苗评价。因此，本试验旨在优化建立一套完整的适用于纯化重组PPRVtH蛋白的工艺体系，为PPRV的诊断和感染机制研究提供技术支持。虽然国内外学者在不同的条件探究了重组PPRVH蛋白的表达，但其表达量仍没有明显提高，这对于下游纯化参数的确定造成了阻碍。在本试验中，我们利用发酵技术将PPRVtH基因的表达量从摇床3g/L产量提高到了30 g/L，且融合表达了His标签；使用高压均质化破碎法破碎细胞，明显提高了破碎率2 0 ,为后续纯化工艺的确立提供了充足的蛋白原料。在综合PPRVH蛋白的pI值、疏水性、带电性等特点的基础上，我们选择分离生物产品最有效的方法之一一金属鳌合亲和层析技术建立纯化重组PPRVtH蛋白的工艺参数。通过对纯化工艺体系中缓冲液种类、缓冲液pH值、层析填料、结合时间、洗脱时间及层析填料用量进行优化、筛选，确定纯化85胡林杰等：重组小反兽疫病毒血凝素蛋白纯化体系的优化第1期重组PPRVtH蛋白的材料组分和工艺参数为：Tris缓冲液(pH值为8.0）、Chelaing Sepharose Fast Flow层析填料、层析填料与粗蛋白液体积比1：2、4静置2 h后收集洗脱液。本研究建立的工艺体系，可获得纯度达到8 5%的重组PPRVtH蛋白，且具有良好的反应原性。综上所述，本试验高效表达了PPRVtH蛋白，建立了其个性化的纯化体系，该体系可稳定用于纯化PPRVtH蛋白。与通用型纯化工艺相比，本试验提供的纯化体系可快速、简便、低成本、大批量纯化重组PPRVtH蛋白。参考文献(References)1DHAR P,SREENIVASA B P,BARRETT T,et al.Recent epi-demiology of peste des petits ruminants virus(PPRV)J1.Veterinary Microbiology,2002,88(2):153-159.2KUMAR N,MAHERCHANDANI S,KASHYAP S K,et al.Pestedes petits ruminants virus infection of small ru-minants:a comprehensive reviewJ.Viruses,2014,6(6):2287-2327.3BANYARD A C,PARIDA S,BATTEN C,et al.Global distri-bution of peste des petits ruminants virus andprospects for improved diagnosis and control J.Journal of General Virology,2010,91(Pt 12):2885-2897.4王志亮，包静月，吴晓东，等.我国首例小反台兽疫诊断报告J.中国动物检疫，2 0 0 7，（8）：2 4-2 6.WANG Zhiliang,BAO Jingyue,WU Xiaodong,et al.Diagnosis of the first outbr eak of peste des petitsruminants in TibetJ.China Animal Health Inspec-tion,2007,(8):24-26.(in Chinese)5BAILEY D,CHARD L S,DASH P,et al.Reverse geneticsfor peste-des-petits-ruminants virus(PPRV):pro-moter and protein 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