猪丁型冠状病毒截短S蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立与应用.pdf

048-08ChineseVeterinaryScience网络首发时间：2 0 2 3-10-182024,54(01):48-55中国兽医科学D0I:10.16656/j.issn.1673-4696.2024.0009中图分类号：S852.659.6文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 9 6(2 0 2 4)0 1-0猪丁型冠状病毒截短S蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立与应用秦秋英，张政1,黄夏玲1,洪大林1,隆美金1,陈樱1,2,3,韦祖樟1,2.3,黄伟坚1,2,3,欧阳康1.2,3*（1.广西大学动物科学技术学院广西高校动物疫病预防与控制重点实验室，广西南宁530005;2.广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心，广西南宁530005;3.广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室，广西南宁530005)摘要：为建立快速、高效检测猪丁型冠状病毒(Porcinedeltacoronavirus,PDCoV)的血清学方法，构建了pET-32a-S-S1重组质粒，通过原核表达获得重组S1b蛋白，以此为包被抗原建立了检测血清中PDCoVIgA抗体的间接ELISA方法，对该检测方法的反应条件进行优化，验证了其特异性、敏感性和重复性等。结果显示：重组S1b蛋白呈包涵体表达，大小为34.7 ku，反应原性良好；建立的间接ELISA检测方法的最佳反应条件为：2 50 ng/孔抗原4过夜包被，10 g/LBSA37封闭2 h，待检血清1：2 0 0 稀释37 孵育45min，二抗1：10 0 0 0 稀释37 孵育1h，显色时间为10 min。测定2 4份阴性血清，确定临界值为0.38 8。检测阳性血清敏感度为1：16 0 0；批间和批内重复试验的变异系数均小于10%；本方法特异性高，与猪流行性腹泻病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪肠病毒标准血清无交叉反应。选取30 份血清，与Western-blot检测结果比较，该间接ELISA的符合率为96.6 6%。应用该方法对486份临床血清样品进行检测，阳性率为32.7 2%。本研究中建立的方法为PDCoV的防控提供了技术支持关键词：猪丁型冠状病毒；S蛋白S1b；间接ELISA临床检测Prokaryotic expression of truncated S protein of porcinedeltacoronavirus and establishment and application of indirect ELISAdetection methodQIN Qiuying,ZHANG Zheng,HUANG Xialing,HONG Dalin,ONG Meijin,CHEN Ying-3,WEI zuzhang.HUANG eijian-,oUYANGKang.(1.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Prevention and Control for Animal Disease,College of A nimalScience and Technology,Guangxi University,Nanning 530005,China;2.Guangxi Zhuang Autonomous Region EngineeringResearch Center of Veterinary Biologics,Nanning 530005,China;3.Guangxi Key Laboratory of Animal Reproduction,Breeding and Disease Control,Nanning 530005,China)Abstract:In order to establish a rapid and efficient method for serological detection of porcinedeltacoronavirus(PDCoV),the recombinant plasmid pET-32a-S-S1b was constructed,and the recombinantS1 protein was obtained by prokaryotic expression.An indirect ELISA method for detecting PDCoV IgA an-tibody in serum was established.After optimizing the reaction conditions of the method,its specifici-收稿日期：2 0 2 3-0 7-2 1；修回日期：2 0 2 3-0 9-19基金项目：广西重点研发计划项目（桂科AB23026082）；大学生创新创业项目（2 0 2 2 10 59312 1）；广西自然科学基金项目（2 0 2 1G XNSFA A 196 0 6 7）；广西大学巴马产教融合研究院专项（巴人科2 0 2 2 0 0 15）作者简介：秦秋英（1998-），女，广西桂林人，硕士生，预防兽医学专业，E-mail：17 7 2 7 53956 q q.c o m。*通讯作者：欧阳康（198 5-），广西恭城人，副教授，主要从事动物传染病方面的研究，E-mail：o u y a n g k a n g g x u.e d u.c n。49秦秋英等：猪丁型冠状病毒截短S蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立与应用第1期ty,sensitivity and repeatability were verified.The results showed that the recombinant Si protein wasexpressed in inclusion bodies,the size was 34.7 ku and the reactivity was good,and the best reactionconditions of indirect ELISA were as follows:the antigen was coated at a concentration of 250 ng/welland incubated overnight at 4,10 g/L BSA w a s i n c u b a t e d a t 37 f o r 2 h a s a b l o c k i n g s t e p,t h e t e s t e dserum was diluted at a ratio of 1:200 and incubated at 37 C for 45 min,and the secondary antibody wasdiluted at a ratio of 1:10 000 and incubated at 37 f o r 1 h,w i t h a c o lo r a t i o n t i m e o f 10 m i n.T h e c u t o f fvalue was determined to be 0.388 after testing 24 negative sera.The sensitivity of detecting positiveserum was 1:1 600,and the coefficient of variation of 10 PDCoV-positive sera inter-and intra-batchassay of ELISA were both less than 10%.This method demonstrated high specificity and did not showcross reaction with standard sera against porcine epidemic diarrhea virus,pseudorabies virus,classi-cal swine fever virus,porcine reproductive and respiratory syndrome virus,African swine fever virus,porcine circovirus and porcine enterovirus G.Compared to the results obtained from 30 serum samplesusing Western-blot,the coincidence rate was 96.66%.A total of 486 clinical serum samples were detect-ed by this method,with a positive rate of 32.72%.The method established in this study provides techni-cal support for theprevention and control of PDCoV.Key words:porcine deltacoronavirus;S protein Sib;indirect ELISA;clinical testing*Corresponding author:OUYANG Kang,E-mail:猪丁型冠状病毒（Porcinedeltacoronavirus,PD-CoV)是套式病毒目、冠状病毒科、丁型冠状病毒属的成员。它作为一种新出现的猪肠道致病性冠状病毒1-2 ,可引起不同生长阶段的猪发生水样腹泻、呕吐和脱水,甚至引起仔猪的死亡3。PDCoV是单股正链RNA病毒，基因组全长约为2 5.4kb4,包含5和3 非翻译区和7 个开放性阅读框，编码5种结构蛋白。病毒粒子呈不规则形状，外面有包膜包裹，纤突蛋白S位于包膜表面与宿主细胞受体结合介导冠状病毒的感染。在PDCoV人侵宿主时,S蛋白首先被蛋白酶水解成S1和S2两个亚单位,S1含有病毒的受体结合区(RBD)5,可以与宿主细胞的受体结合，介导病毒进人宿主细胞。根据结构分析S1亚基分为4个结构域(S1ad)6,其中S1a具有唾液酸活性主要与糖受体结合帮助病毒附着7 ,S1主要与蛋白质受体结合，且S1b存在与氨基肽酶结合的位点，而氨基肽酶是在体外与PDCoV结合进入宿主细胞的重要受体，可诱导机体产生中和抗体8 临床上,PDCoV可与多种猪腹泻病毒混合感染，其临床症状较为相似9。研究报道，广西地区PDCoV流行率为5.6 7%7.6 3%10 。目前，尚无特效药物和商品化疫苗，因此，研发快速、高效的PD-CoV诊断方法对于该病的防控显得尤为重要。其中，间接ELISA具有灵敏度高、经济、灵活的优点,因此，本研究原核表达PDCoV的蛋白质受体结合区并以其为抗原，建立检测血清中PDCoVIgA抗体的间接ELISA方法，并进行临床应用，为PDCoV流行病学调查和基础研究提供参考1材料与方法1.1病毒与血清猪丁型冠状病毒分离株CHN/20GXNN-1/2020,猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV）、猪瘟病毒(Clas-sical swine fevervirus,CSFV）、非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus，A SFV）、猪圆环病毒（Porcine cir-covirus,PCV)、猪肠病毒(Porcine enterovirus G,EV-G)标准血清及2 0 2 1一2 0 2 2 年从广西部分猪场采集的48 6 份临床血清均由广西大学动物科学技术学院分子与流行病学实验室提供1.2主要试剂AxyPrep Body Fluid Viral RNA/DNA Miniprep Mix（上海百赛生物技术股份有限公司），反转录试剂、PCR试剂、BamHI、Ec o RI、D NA M a r k e r(宝日医生物技术（北京）有限公司），DNA片段纯化回收试剂盒GelExtractionKit、反应液回收试剂盒Cycle-PureKit、质粒小量提取试剂盒PlasmidMiniKitI（O M EG A公司）,BL21、D H 5（北京全式金生物技术有限公司），酶标板（莱恩BIOFIL）,ELISA 试剂（Solarbio公司），HRP-山羊抗猪IgA（A b c a m 公司）1.3引物的设计与合成根据本实验室前期分离的毒株CHN/20GXNN-50第54卷中国兽医科学1/2020（登录号：OL441342），用SnapGene.5.2.0软件设计S基因S1b的扩增引物：S-S1b-F(5-CGC-GGATCCCCCGAGCTTGAAGT-3)和 S-S1b-R(5-CCGGAATTCAGAAGTGTCTGTTGCA-3）。扩增的S基因S1b片段长37 2 bp。1.4S1b的扩增及及pET-32a-S-S1b质粒的构建取CHN/20GXNN-1/2020毒株的细胞上清液，按照AxyPrep BodyFluid Viral RNA/DNAMiniprepMix试剂盒的方法提取病毒的总RNA,获得40 L抽提样品，利用OligodT引物反转录获取病毒的cDNA。反转录体系：OligodT1L,5缓冲液5L,dNTP混合物2 L,RNasin0.5L,M-MLV反转录酶0.5L,抽提产物16 L。反转录程序：42 反应1h。PCR扩增S1b的反应体系为:ddH,O8.5L,GreenPremixExTaqII12.5L,上下游引物各0.5L,cDNA3L。将目的片段与pET-32a载体经BamHI、Ec o RI双酶切,用T4DNA连接酶16 过夜连接,转化至DH5感受态细胞中,构建的质粒经酶切鉴定与测序鉴定,将构建成功的质粒命名为pET-32a-S-S1b1.5S蛋白S1b的原核表达、纯化及鉴定将pET-32a-S-S1b质粒转化至BL21感受态细胞中,经菌液PCR鉴定及测序鉴定的阳性菌液按1%比例在37 培养箱扩大培养，菌液D6o0m值为0.6 0.8时加人IPTG使其终浓度为1mmol/L,在16 下恒温诱导12 h。低温离心诱导结束后的菌液，超声破碎,用SDS-PAGE鉴定表达形式。确定目的蛋白表达后使用镍柱亲和层析法纯化，纯化后的蛋白使用SDS-PAGE鉴定纯化效果。通过BCA蛋白定量试剂盒来测定蛋白浓度。纯化的蛋白样品进行SDS-PAGE后转膜,在50 g/L的脱脂奶粉溶液中37 封闭2 h，一抗使用抗His标签的小鼠单克隆抗体，在37 孵育1h，二抗使用HRP-山羊抗小鼠IgG（1：2 0 0 0 稀释）,37 孵育1h,充分洗涤后将膜浸泡在ECL发光液中避光显色，最后利用蛋白免疫印迹成像仪拍照保存1.6间接ELISA最佳反应条件的筛选用不同量（50、10 0、150、2 0 0、2 50、30 0 ng/孔）的抗原包被酶标板，确定最佳抗原包被浓度；Western-blot鉴定为阴性、阳性的血清以1:50、1：10 0、1:2 0 0、1:400、1:8 0 0、1:16 0 0、1:32 0 0、1：6 40 0 稀释确定最佳一抗稀释度；用棋盘法确定最佳抗原包被条件（4过夜37 1h、37 2 h、37 4h）与最佳酶标二抗稀释度（1：50 0 0、1：10 0 0 0、1：150 0 0 和1：2 0 0 0 0)；选用10 g/LBSA、50 g/LBSA、10 g/L脱脂奶粉溶液和50 g/L脱脂奶粉溶液分别作为封闭液，37 分别封闭1.0、1.5、2.0 2.5h，探索最佳的封闭液及封闭时间；用棋盘法确定最佳一抗孵育时间（30、45、6 0 min）和最佳二抗孵育时间（30、45、6 0min）;每孔加10 0 LTMB显色液，在37 分别避光显色5、10、15和2 0 min，探索最佳显色时间。当阳性血清与阴性血清的D450mm比值（P/N)最大时，确定为该反应的最佳反应条件。1.7特异性、敏感性、重复性试验用优化好的条件对本实验室保存的8 种常见猪病毒（PDCoV、PED V、PRV、CSFV、PRRSV、A SFV、PCV和EV-G)阳性血清样品进行间接ELISA检测，确定其特异性。选取1份阳性血清分别按1：50、1:100、1:2 0 0、1:40 0、1:8 0 0、1:16 0 0、1:32 0 0、1：6 40 0 进行倍比稀释，测定D450mm值，评估其敏感性。应用建立的间接ELISA方法，测定4份PDCoV阳性、4份PDCoV阴性血清样品的D450m值，计算平均值（x）、标准差(SD)与差异系数（CV),分析该间接ELISA方法的板间和板内重复性1.8临界值的确定使用上述试验探索出的最适条件，对Western-blot筛选出的的2 4份猪丁型冠状病毒阴性血清进行间接ELISA检测。酶标仪读数后,计算平均值与标准差。根据统计学原理，当样品D450mmx十3s判定样品为阳性，D450mmx十2 s判定样品为阴性，中间值为可疑样品1.9符合率试验选取基于重组S蛋白间接ELISA方法检测出来的15份阳性血清和15份阴性血清，通过Western-blot进一步验证。将重组蛋白进行 SDS-PAGE,转至PVDF膜，转膜结束后用洗涤液润洗3次,50 g/L的脱脂奶粉溶液过夜封闭，待检血清1：10 0 0 稀释，37孵育2 h,HRP-山羊抗猪IgA1：2 0 0 0 0 稀释，37作用1h，使用TBST充分洗涤后将膜浸泡在ECL发光液中避光显色，用蛋白免疫印迹成像仪拍照并保存。1.10间接ELISA检测方法的临床应用利用本研究中建立的间接ELISA抗体检测方法对本实验室保存的48 6 份临床血清进行检测1.11间接ELISA与中和试验的相关性分析选取16 份D450mm值不同的血清检测PDCoV的中和抗体效价。将16 份D450mm值不同的血清在56 加热30min,在含5g/mL的DMEM培养液中连续稀释10倍，然后与等量的10 0 TCID5o的CHN/20GXNN-1/2020病毒液混合,37 孵育1h。将混合物加人96孔板里的LLC-PK1细胞单层中，在37 下孵育1.551秦秋英等：猪丁丁型冠状病毒截短S蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立与应用第1期h,然后用PBS洗涤细胞加入细胞维持液，在37 50mL/LCOz培养箱中培养。3d后，倒置显微镜下观察细胞病变效应（CPE），中和效价定义为抑制CPE发生的血清中抗体的最低浓度2结果2.1目的基因的扩增与重组质粒的构建经PCR扩增出与预期条带大小一致约37 0 bp的目的片段（图1A）。重组质粒进行双酶切鉴定，条带位置在590 0 bp和37 0 bp处（图1B）。测序后，与CHN/20GXNN-1/2020毒株S基因S1b进行同源性比对,同源性为10 0%。2.2重组蛋白的诱导表达及Western-blot鉴定将重组质粒转化至BL21感受态细胞中，SDS-PAGE结果显示，重组蛋白大小为34.7 ku且以包涵体形式表达。利用包涵体Ni柱纯化包涵体，获得了较为单一的目的条带（图2 A）,蛋白质量浓度为1223.84g/mL。以抗小鼠His单克隆抗体为一抗进行Western-blot验证，发现在34.7 ku处出现特异性反应条带（图2 B）,与目的蛋白大小一致。2.3间接ELISA方法条件的优化及临界值的确定以重组的S1b蛋白作为包被抗原所建立的间接ELISA的最终优化条件如下（图3）：2 50 ng/孔的重组蛋白4过夜包被，10 g/LBSA在37 封闭1h；待检血清最佳稀释度为1：2 0 0 在37 反应45min;HPR标记的山羊抗猪IgA抗体最佳稀释度为1：10 0 0 0,在37 作用1h,TMB避光显色10 min。ABM1122M235000bp2.000bp3 000bp1000bp2000bp750bP1500bp500bp372bp1000bp250bp750bp100bp500bp372bp250bp100bp图1目的片段的PCR扩增及重组质粒的双酶切鉴定Figure 1PCR amplification of target fragment and identi-fication of recombinant plasmid by double en-zyme digestionM1:DL2000DNA分子质量标准；M2：D L50 0 0 D NA 分子质量标准；1:阴性对照；2:CHN/20GXNN-1/2020毒株3:pET-32a-S-S1b重组质粒的双酶切产物。M1:DL2000 DNA Marker;M2:DL5000 DNA Marker;1:Negative con-trol;2:CHN/20GXNN-1/2020 strain;3:Recombinant pET-32a-S-S1bplasmid digested by double enzyme.利用所建立的方法检测2 4份阴性血清后，经计算得出其平均值为0.2 8 6，标准差为0.0 51，故当DAs0mm值0.440 时判定为阳性，D450mm值0.38 8 时判定为阴性，0.38 8 D450mm值 0.440 时判定为可疑，需要重新测定。2.4特异性、敏感性、重复性试验对本实验室保存的8 种常见猪病毒（PDCoV、PEDV、PRV、CSFV、PRRSV、A SFV、PCV、EV-G)的标ABM123456M78100ku50ku70 ku40ku50ku34.7ku30ku40ku34.7ku25ku30ku17 ku25ku14ku图2 重组S1b蛋白的SDS-PAGE分析及Western-blot验证Figure 2SDS-PAGE analysis and Western-blot verification of the recombinant S1 proteinA：重组S1b蛋白的SDS-PAGE分析;B：重组S1b蛋白的Western-blot验证。M:100ku蛋白分子质量标准；l:pET-32a空载体诱导菌液；2:pET-32a-S-S1b未诱导菌液；3:pET-32a-S-S1b诱导菌液；4:pET-32a-S-S1b诱导菌液超声上清；5:pET-32a-S-S1b诱导菌液超声沉淀；6：纯化的重组S1b蛋白；7:pET-32a空载体诱导菌液；8：纯化的重组S1b蛋白。A:SDS-PAGE analysis of the purified S1 protein;B:Western-blot analysis of S1 protein.M:100 ku protein molecular weight Marker;l:pET-32ano-load induced bacteria solution;2:Uninduced bacterial liquid of pET-32a-S-S1;3:Induced bacterial liquid of pET-32a-S-S1b;4:Ultrasonic super-natant of induced bacterial liquid of pET-32a-S-S1;5:Ultrasonic precipitation of induced bacterial liquid of pET-32a-S-S1b;6:Purified recombinantS1 protein;7:pET-32a no-load induced bacteria solution;8:Purified S1 recombinant protein.52第54卷中国兽医科学准阳性血清，采用建立的间接ELISA方法进行检测特异性试验结果（图4A)显示，仅有PDCoV阳性血清D450mm值高于0.440,其余7 种病毒阳性血清样品D450mm值均低于0.38 8，表明所建立的间接ELISA方法与其他病毒血清之间不发生交叉反应，特异性良好。敏感性试验结果（图4B）显示，血清稀释度为1：16 0 0 时P/N值大于2.1，稀释度为1:32 0 0 时P/N值小于2.1,表明该方法的敏感性为1：16 0 0。ELISA重复性试验结果（图4C)显示批间与批内重复试验的变异系数均在10%以下，表明以重组PDCoVS1b蛋白作为检测抗原所建立的ELISA检测方法重复性良好。ABC5.5阳性血清27202715阳性血清1:5.000口阴性血清口阴性血清世5.015+P/N值10+P/N值1:1000-值4.5uuost10N/dN/d4.0551:200003.54C过夜37 1h50100150200250300372h374.h1002004008006003.66.400抗原包被条件Antigen coating condition抗原包被量/ng Coating antigen content-抗稀释度PrimaryantibodydilutionDEF30T-10L脱脂奶粉二抗孵育30 min3阳性血清-50/脱脂奶粉=二抗孵育45min阴性血清620+10g/LBSA-二抗孵育6 0 min8+P/N值+50g/LBSA值N/dN/d104603512315304560755101520封闭时间/hBlocking time一抗孵育时间/min显色时间/minColorationtimeIncubation time of primary antibodyG临界值0.439 7 58平均值0.2 8 6 0 8 3026781920212223244阴性样品编号NegativesamplesNo.图3间接ELISA反应条件的优化及临界值的确定Figure 3Condition optimization and critical value determination of indirect ELISAA：最佳抗原包被浓度的确定；B：待检血清最佳稀释度的确定；C：一抗最佳孵育条件及二抗最佳稀释度的确定；D：一抗、二抗最佳孵育时间的确定；E：最佳封闭条件的确定；F：底物最佳显色时间的确定；G：临界值的确定。A:Determination of optimal concentration of the antigen coating;B:Determination of optimal dilution of serum to be tested;C:Determination ofoptimal incubation conditions of primary antibody and optimal dilution of secondary antibody;D:Determination of optimal incubation time of primary andsecondary antibodies;E:Determination of closure conditions;F:Determination of optimal reaction time of substrate;G:Determination of critical value.ABC批内均值22100批间均值批内变异系数80批间变异系数tuu(60口840临界值0.438 5临界值0.438 52010002468102004008006样品编号SampleNo.一抗稀释度常见猪病毒标准血清Primary antibody dilution图4间接ELISA的特异性、敏感性、重复性试验Figure 4 Specificity,sensitivity and repeatability test of indirect ELISAA：特异性试验;B：敏感性试验;C：重复性试验。A:Specificity test;B:Sensitivity test;C:Repeatability test.53型冠状病毒截短S蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立与应用秦秋英等：猪第1期2.5符合率试验为了验证基于重组S1b蛋白的间接ELISA方法的准确性，采用该间接ELISA与Western-blot检测了30 份血清样品，结果如表1所示：Western-blot检测结果为14份阳性，16 份阴性；间接ELISA方法检测结果为15份阳性，15份阴性，总符合率为96.66%。表1间接ELISA与Western-blot试验符合率的比较Table 1 Comparison of coincidence rate between indirect ELISA and Western-blot testWestern-blot合计符合率/%阳性Positive阴性NegativeTotalCoincidencerate阳性Positive1411593.75本试验建立的方法The method established阴性Negative01515100.00inthisexperiment合计Total14163096.662.6临床样品的检测对48 6 份临床血清样品进行间接ELISA检测，结果（表2)显示总阳性率为32.7 2%，其中公猪、母猪、育肥猪血清样品阳性率分别为53.33%、38.46%、24.68%。育肥猪血清中的PDCoVIgA抗体阳性率显著低于公猪与母猪表2应用建立的间接ELISA检测血清样品中PDCoV的IgA抗体阳性率Table22Detection of IgA antibody positive rate of PDCoVin serum samples by indirect ELISA类别阳性阴性合计阳性率/%CategoryPositiveNegativeTotalPositiverate公猪16143053.33Boar母猪8513622138.46Sow育肥猪5817723524.68Fattening pig合计15932748632.72Total2.7PDCoV间接ELISA与中和试验的相关性分析对16 份血清样品分别进行间接ELISA和病毒中和试验，分析D450mm值与病毒中和抗体效价的相关性，结果（图5）显示，D450m值与中和抗体效价呈线性相关，相关系数较高为0.8 952。3讨论PDCoV自2 0 12 年被发现之后全球都有报道，近年来由PDCoV引起的腹泻在仔猪中发病率较高，且发现其可以感染多种物种，包括猪、鸡、火鸡、牛和人类12-13。因此,对PDCoV的持续监测非常有必要，间接ELISA是一种快速、高效、灵敏的检测方法，可为PDCoV的防控提供技术支持。目前研究中有建立检测血清中PDCoVIgG的140120100806040y=91.098x-13.4R2=0.895 22000.20.40.60.81.01.21.41.6D450 m图5PDCoV间接ELISA方法和中和试验的相关性分析Figure 5 Correlation between indirect ELISA Das0 m and neu-tralization titer间接ELISA方法，IgG在血清中的含量较高，且半衰期较长，有利于监测PDCoV的感染水平。但PDCoV是一种肠道病原体，机体黏膜局部抗感染免疫的主要抗体IgA对阻止肠道病原的侵人非常重要，病毒突破黏膜屏障时可在血清和乳汁中检测到IgA，因此，针对肠道病原体的血清IgA抗体可作为检测指标14。同时在对SARS-CoV-2的研究中发现,早期的SARS-CoV-2特异性体液反应以IgA抗体为主，IgA抗体在对SARS-CoV-2的早期反应中占主导地位，与IgG相比，IgA对病毒中和的贡献更大15-16 。PDCoV同样作为冠状病毒，人侵机体时也可能存在类似现象。本研究也分析了间接ELISA的D450mm值与中和抗体效价的相关性，发现其有较高的线性相关性，说明IgA对PDCoV有中和作用，但这也可能与本研究采用的的样品量较少有关PDCoV目前未有商品化疫苗，检测出PDCoV的抗原或抗体就可认为感染了PDCoV。目前PDCoV抗原的检出率为11.56%41.55%7-18 1,抗体检出率为49.11%50.92%19-2 0 1。本研究检测的广西地区PDCoVIgA抗体的阳性率为32.7 2%，高于广西地区PDCoV的抗原检出率10。PDCoV的感染率较高,且54第54卷中国兽医科学症状与其他猪腹泻病原相似，只有快速地确定病原才可能尽早地介入治疗降低经济损失。本实验中建立的间接ELISA检测方法与常见猪病病毒标准血清无交叉反应，可用于确定PDCoV的感染。综上所述，本研究原核表达了PDCoVS1b蛋白，以此蛋白为包被抗原建立了检测血清中PDCoVIgA的间接ELISA方法，优化了该方法的条件，进行了临床样品的检测，并与中和抗体效价进行了比较，为PDCoV的防控提供了技术支持。参考文献(References)1CHEN Q,GAUGER P,STAFNE M,et al.Pathogenicity andpathogenesis of a United States porcine delta-coronavirus cell culture isolate in 5-day-oldneonatal pigletsJ.Virology,2015,482:51-59.2ZHANG M J,LIU D J,LIU X L,et al.Genomic characte-rization and pathogenicity of porcine deltacoro-navirus strain CHN-HG-2017 from China JJ.Archi-ves of Virology,2019,164(2):413-425.3MA Y,ZHANG Y,LIANG X,et al.Origin,evolution,andvirulence of porcine deltacoronaviruses in theUnited StatesJ.mBio,2015,6(2):e00064-15.4MAI K,FENG J,CHEN G,et al.The detection and phylo-genetic analysis of porcine deltacoronavirus fromGuangdong Province in Southern China JJ.Trans-boundary and Emerging Diseases,2018,65(1):166-173.5JI W,PENG Q,FANG X,et al.Structures of a 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