基于高通量测序技术的蓝莓果...菌和真菌菌群多样性分析研究_缪承杜.pdf

第 14 卷 第 11 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.14 No.11 2023 年 6 月 Journal of Food Safety and Quality Jun.,2023 基金项目:国家自然科学基金项目(32202175)、广东省基础与应用基础研究基金项目(2021A1515110608)、“十四五”广东省农业科技创新十大主攻方向“揭榜挂帅”项目(2022SDZG04)、广州市南沙区民生科技项目(2021MS012)、仲恺农业工程学院大学生创新创业训练计划项目(X202211347160)Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China(32202175),the Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation(2021A1515110608),the“14th Five Year Plan”Guangdong Province Agricultural Science and Technology Innovation Top Ten Main Attack Directions“Unveiling and Leading”Project(2022SDZG04),the Minsheng Science and Technology Project of Nansha District of Guangzhou(2021MS012),and the Innovation and Entrepreneurship Training Projects for College Students of Zhongkai University of Agriculture and Engineering(X202211347160)*通信作者:王 锋,博士,副教授,主要研究方向为食品检测与微生物安全。E-mail:wangfeng_ 马路凯,博士,副教授,主要研究方向为食品加工安全与组分互作。E-mail:*Corresponding author:WANG Feng,Ph.D,Associate Professor,College of Light Industry and Food Technology,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,No.24,Dongsha Street,Haizhu District,Guangzhou 510225,China.E-mail:wangfeng_ MA Lu-Kai,Ph.D,Associate Professor,College of Light Industry and Food Technology,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,No.24,Dongsha Street,Haizhu District,Guangzhou 510225,China.E-mail: 基于高通量测序技术的蓝莓果实中细菌和 真菌菌群多样性分析研究 缪承杜1,叶沛铭2,赵培静3,王 锋2*,刘东杰2,马路凯2*,蓝碧锋1,王 琴2,肖更生2(1.广州辐锐高能技术有限公司,广东省工业钴-60 伽玛射线应用工程技术研究中心,广州 511458;2.仲恺农业 工程学院轻工食品学院,农业农村部岭南特色食品绿色加工与智能制造重点实验室,广东省岭南特色 食品科学与技术重点实验,广州 510225;3.广东省华微检测股份有限公司,广州 510663)摘摘 要要:目的目的 分析蓝莓中细菌和真菌菌群的组成及其多样性,探究不同蓝莓样品中微生物的暴露水平。方法方法 构建了蓝莓中微生物菌群的基因组文库,利用高通量测序技术分析 5 种蓝莓中细菌和真菌菌群的组成及其多样性,借助微生物属水平和种水平分析比较蓝莓中细菌和真菌菌群组成及丰度信息。结果结果 5 种蓝莓中微生物菌群的多样性较高,但其细菌和真菌菌群组成仍存在共有特征,细菌和真菌中共有的操作分类单元数量分别为 76 和 42。蓝莓中优势细菌主要归属于放线菌门、拟杆菌门、蓝藻菌门、厚壁菌门和变形菌门,优势真菌主要归属于子囊菌门、担子菌门和被孢霉门。结论结论 不同蓝莓样品中微生物菌群的组成变化较大,真菌菌群的多样性比细菌更丰富,这对蓝莓的腐烂变质、贮藏保鲜和生物防控研究具有重要意义。关键词关键词:蓝莓;高通量测序;微生物菌群;组成;多样性;丰度 Study on the diversity analysis of bacterial communities and fungal communities in Vaccinium spp.based on high-throughput sequencing technology MIAO Cheng-Du1,YE Pei-Ming2,ZHAO Pei-Jing3,WANG Feng2*,LIU Dong-Jie2,MA Lu-Kai2*,LAN Bi-Feng1,WANG Qin2,XIAO Geng-Sheng2(1.Guangzhou Furui High Energy Technology Co.,Ltd.,Guangdong Industrial 60Co Gamma Ray Application Engineering Technology Research Center,Guangzhou 511458,China;2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Lingnan Specialty Food Science and Technology,Key Laboratory of Green Processing and Intelligent Manufacturing of Lingnan Specialty Food,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,College of Light Industry and Food Technology,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China;3.Guangdong Huawei Testing Co.,Ltd.,Guangzhou 510663,China)DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956/ts.2023.11.043148 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 第 14 卷 ABSTRACT:Objective To explore the exposure level of microorganisms in different Vaccinium spp.samples with the analysis of the composition and diversity of bacterial and fungal communities.Methods The genomic library of microbial communities in Vaccinium spp.was developed,and the composition and diversity of bacterial and fungal communities in 5 kinds of Vaccinium spp.samples were analyzed by high-throughput sequencing technique.Results The diversities of microbial communities among the 5 kinds of Vaccinium spp.samples were relatively high,but common characteristics in the composition of the bacterial and fungal communities were observed with the 76 and 42 common operational taxonomic units separately for bacteria and fungi.The dominant bacteria in Vaccinium spp.mainly belonged to Actinobacteriota,Bacteroidota,Cyanobacteria,Firmicutes,and Proteobacteria.The dominant fungi mainly belonged to Ascomycota,Basidiomycota,and Mmortierellomycota.Conclusion The composition of microbial communities in different Vaccinium spp.samples varies greatly,and the diversity of fungal communities in Vaccinium spp.is richer than that of bacterial communities,which has great significance for the study of deterioration,storage and biological control of Vaccinium spp.KEY WORDS:Vaccinium spp.;high-throughput sequencing;microbial communities;composition;diversity;abundance 0 引 言 蓝莓是一种营养丰富、风味独特的浆果类水果,具有多种生物活性功能12。然而,由于蓝莓皮薄汁多,很容易受到机械损伤而遭受微生物的污染35。有研究表明,真菌侵染是造成水果采后腐败的主要微生物,对水果品质和人类健康造成严重危害6。戴启东等7从蓝莓病果中分离得到灰葡萄孢菌、链格孢菌、青霉菌和粉红单端孢菌,发现不同品种蓝莓对它们的敏感性有很大的差异。MUNITZ 等8从新鲜蓝莓中分离出黄曲霉、链格孢菌、暗孢节菱孢菌、枝孢菌、黑附球菌、禾谷镰刀菌等多种真菌,分析了不同品种蓝莓对真菌污染的影响。然而,目前蓝莓的研究主要集中在采后保鲜和品质变化等方面,其内源微生物菌群组成和多样性分析的研究较少。通过对蓝莓中典型微生物的评价分析,可进一步探究微生物对蓝莓贮藏保鲜特性及货架期预测的影响。不同来源的蓝莓中微生物菌群存在很大差异,其微生物组成对腐烂变质具有重要的影响5。引起蓝莓腐烂的真菌主要有链格孢菌、灰霉病、禾谷镰刀菌、青霉、葡萄座腔菌、酵母菌等4,911,不同真菌之间存在协同作用或拮抗作用1213。此外,细菌菌群能够通过改变微生物菌群的组成,进而影响水果的腐烂进程1416。本研究借助高通量测序技术分析 5 种蓝莓中微生物菌群组成,探究不同蓝莓中细菌和真菌菌群的多样性,并对其中优势菌群的归属性和样品的相似性进行分析,以期为蓝莓的采后贮藏保鲜和致腐微生物相互作用等提供研究基础。1 材料与方法 1.1 材料与试剂 5 种不同地区来源的同品种蓝莓样品,分别采摘于山东省日照市、辽宁省大连市、辽宁省丹东市、山东省青岛市和山东省威海市的当地蓝莓种植园。DNA 提取试剂盒、DNA 纯化试剂盒天根生化科技(北京)有限公司;琼脂糖(广州兆天生物科技有限公司);扩增液(美国 New England Biolabs 公司)。1.2 仪器与设备 ME104E 电子天平精度 0.1 mg,梅特勒托利多科技(中国)有限公司;NovaSeq6000 测序仪(美国 Illumina 公司)。1.3 实验方法 1.3.1 蓝莓样品的采集和预处理 5 种蓝莓果实(B1、B2、B3、B4 和 B5)分别采摘于 5个不同地区的种植园,将蓝莓样品保存于无菌袋中,在冷藏条件下运输至实验室进行80贮藏。从每种蓝莓样品中随机选取 10 个完好的蓝莓全果,并将作为生物学样本用于微生物菌群分析。1.3.2 蓝莓中微生物菌群的测定 利用 DNA 试剂盒提取蓝莓样品中微生物基因组 DNA,并对其纯度和浓度进行鉴定分析。以总基因组 DNA 为模板,分别利用 16S RNA 的 V5-V7 区引物和 ITS1 区引物构建微生物的基因组文库。蓝莓中微生物基因组文库经过定量分析后,使用 Illumina NovaSeq6000 平台进行高通量测序17。1.3.3 蓝莓中微生物菌群组成及其多样性分析 蓝莓中微生物的原始测序数据经拼接和过滤得到有效数据,基于有效数据进行操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)聚类和微生物菌群分类分析,对微生物 OTU 进行分析得到菌群注释和丰度,并绘制维恩图、丰度聚类图和聚类热图等研究蓝莓中微生物菌群组成和多样性。1.4 数据处理 利用 Microsoft Excel 2016 处理数据,利用迈维分析第 11 期 缪承杜,等:基于高通量测序技术的蓝莓果实中细菌和真菌菌群多样性分析研究 149 云平台绘制维恩图、丰度聚类图和聚类热图。2 结果与分析 2.1 蓝莓样品的微生物基因组文库构建与分析 蓝莓中微生物基因组DNA经扩增后构建基因组文库,对基因组文库的参数指标进行分析(表 1)。5 种蓝莓细菌和真菌的基因组文库中有效序列数量均大于 150,但这远不及桃、猕猴桃、凉果及发酵蔬菜等食品中微生物的有效序列数量1720,说明了蓝莓样品中仅存在极少量的微生物菌群。B1、B4 和 B5 中真菌的 Chao1 指数明显大于细菌的Chao1 指数,B2 和 B3 中真菌和细菌的 Chao1 指数相近,说明 B1、B4 和 B5 中真菌丰度较高。B1、B2、B3 和 B4 中细菌的 Shannon 指数、Simpson 指数明显大于真菌的这两个指数,说明这 4 个样品中细菌多样性较高。5 种蓝莓的细菌和真菌基因组文库 Coverage 指数反映了文库具有较高的样品菌群代表性。图 1 显示了蓝莓中细菌和真菌的稀释曲线和等级分布曲线,表明微生物测序数据合理,菌群分布均匀、丰度较高2122。上述结果表明,5 种蓝莓细菌和真菌的基因组文库满足微生物菌群分析和多样性研究。2.2 蓝莓中微生物菌群的 OTUs 特征分析 图 2 维恩图显示了不同蓝莓中细菌和真菌的微生物组成特征,并以细菌和真菌中共有/特有的 OTUs 数量进行展示。5 种蓝莓中细菌和真菌的共有 OTUs 个数分别为 76和 42。其中,5 种不同蓝莓中细菌特有 OTUs 个数分别为22、74、124、23 和 17,真菌特有的 OTUs 个数分别为 103、42、64、94 和 156。这与葡萄23、枸杞24等植物果实中微生物菌群的研究结果类似,5 种蓝莓中细菌和真菌菌群的组成和多样性具有较大的差异。表 1 蓝莓中细菌和真菌的基因组文库分析 Table 1 Genomic library analysis of bacteria and fungi in Vaccinium spp.样品 细菌基因组文库 真菌基因组文库 有效序列 ShannonSimpson Chao1 Coverage有效序列ShannonSimpson Chao1 CoverageB1 174 3.150 0.768 201.3530.999 404 2.806 0.662 428.5850.999 B2 290 5.317 0.946 296.1291.000 256 2.495 0.601 273.4470.999 B3 312 4.566 0.908 317.3830.999 267 2.710 0.749 285.6790.999 B4 185 3.458 0.837 195.6360.999 325 2.346 0.647 351.2640.999 B5 174 3.263 0.772 177.2431.000 493 4.183 0.885 543.2820.999 图 1 蓝莓中细菌和真菌的稀释曲线(a1、a2)和等级分布曲线(b1、b2)Fig.1 Dilution curves(a1,a2)and rank abundance curves(b1,b2)of bacteria and fungi in Vaccinium spp.150 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 第 14 卷 图 2 不同蓝莓样品中细菌(a)和真菌(b)的维恩图 Fig.2 Venn diagrams of bacteria(a)and fungi(b)in different Vaccinium spp.samples 2.3 蓝莓中细菌菌群的组成及多样性分析 5 种蓝莓中细菌菌群组成如图 3 所示,分别以属水平和种水平展示。对细菌属水平进行分析(图 3a),蓝莓 B1、B4 和 B5 中主要有泛菌属(Pantoea),蓝莓 B2 和 B3 中主要有弧菌属(Vibrio)。对细菌种水平进行分析(图 3b),蓝莓 B1和 B4 中主要有痰塔特姆菌(Tatumella ptyseos)和麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)等。为深入了解 5 种蓝莓中优势细菌的菌群归属特征,选取丰度排名前 35 的属水平细菌进行聚类分析(图 3c),5 种蓝莓中优势细菌归属于放线菌门(Actinobacteriota)、拟杆菌门(Bacteroidota)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)、厚 壁 菌 门(Firmicutes)和 变 形 菌 门(Proteobacteria)。B1 中优势细菌主要归属于变形菌门,B2中优势细菌主要归属于放线菌门、拟杆菌门、蓝藻菌门、厚壁菌门和变形菌门,B3 中优势细菌主要归属于拟杆菌门和变形菌门,B4 中优势细菌门水平归属不明显,B5 中优势细菌主要归属于变形菌门。5 种蓝莓中细菌菌群的组成与桃、苹果、柑橘等水果附着细菌菌群较为相似,肠球菌、短小杆菌、嗜盐菌、雷尔氏菌、金黄杆菌、假单胞菌等细菌参与植物生长、营养组分转化、腐烂变质及生物防控等15,2527。2.4 蓝莓中真菌菌群的组成及多样性分析 5 种蓝莓中真菌菌群组成如图 4 所示,分别以属水平和种水平展示。对真菌属水平进行分析(图 4a),5 种蓝莓中主要有枝孢属(Cladosporium)、链格孢霉属(Alternaria)和短柄霉属(Aureobasidium)等真菌。对真菌种水平进行分析(图4b),蓝莓中主要有枝孢霉(Cladosporium sp.)、链格孢菌(Alternaria alternata)和 Aureobasidium_leucospermi 等。为深入了解 5 种蓝莓中优势真菌的菌群信息,选取丰度排名前 35 的属水平真菌进行聚类分析(图 4c),5 种蓝莓中优势真菌归属于子囊菌门、担子菌门和被孢霉门。B1 中优势真菌主要归属于子囊菌门和担子菌门,B2 中优势真菌主要归属于子囊菌门和担子菌门,B3 中优势真菌主要归属于子囊菌门和担子菌门,B4 中优势真菌门水平归属于子囊菌门,B5 中优势真菌主要归属于子囊菌门、担子菌门和被孢霉门。霉菌和酵母菌是水果的主要致腐真菌,而且真菌与细菌之间存在共生互作关系,对于水果保鲜和食用安全具有重要影响6,28。由图 4 可知,蓝莓真菌菌群多样性较高,其中存在枝孢霉、链格孢菌、炭疽菌、果生月盾霉等易致腐真菌,掷孢酵母和附球菌等多种真菌也可用于水果腐败微生物的生物防治2830。2.5 蓝莓中微生物菌群的相似性分析 为了分析蓝莓中微生物菌群的相似性,计算得到Weighted UniFrac 距离31。蓝莓中细菌之间的 Weighted UniFrac 距离为 0.1010.382,真菌之间 Weighted UniFrac距离为 0.3400.929。基于 Weighted UniFrac 距离指标,绘制得到基于非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)的聚类树(图 5)。UPGMA聚类树上存在多个分支,基于细菌菌群特征可将 5 种蓝莓聚类于图 5a 的聚类树,基于真菌菌群特征可将 5 种蓝莓聚类于图 5b 的聚类树。结果表明,不同蓝莓样品间微生物的菌群差异性较大,蓝莓中真菌菌群的多样性比细菌更丰富,但仍可依据微生物特征形成一个完整的聚类树。3 结 论 本研究利用高通量测序技术测定了 5 种蓝莓样品中微生物菌群组成及其多样性,并利用生物信息学方法探究了蓝莓中主要细菌菌群和优势真菌菌群特征。与蓝莓中细菌菌群的组成相比,蓝莓中真菌菌群的组成更为丰富。蓝莓中门水平的细菌主要有放线菌门、拟杆菌门、蓝藻菌门、第 11 期 缪承杜,等:基于高通量测序技术的蓝莓果实中细菌和真菌菌群多样性分析研究 151 厚壁菌门和变形菌门,门水平的真菌主要有子囊菌门、担子菌门和被孢霉门。然而,真菌是造成水果腐败的主要病原菌,可针对蓝莓中致腐真菌进行分离培养,进一步研究致腐真菌对蓝莓采后保鲜的影响和细菌-真菌共存体系的相互作用,对蓝莓采后保鲜工艺和微生物菌群互作机制研究具有重要意义。图 3 蓝莓中细菌的属水平(a)、种水平分析(b)和属水平丰度聚类热图(c)Fig.3 Analysis of bacterial genus level(a)and species level(b),and clustering heatmap of genus level abundance(c)of bacterial in Vaccinium spp.图 4 蓝莓中真菌的属水平(a)、种水平分析(b)和属水平丰度聚类热图(c)Fig.4 Analysis of fungi genus level(c)and species level(b),and clustering heatmap of genus level abundance(c)of fungi in Vaccinium spp.图 5 蓝莓中细菌(a)和真菌(b)的聚类树分析 Fig.5 Cluster tree analysis of bacteria(a)and fungi(b)in Vaccinium spp.参考文献 1 MILLER K,FEUCHT W,SCHMID M.Bioactive compounds of strawberry and blueberry and their potential health effects based on human intervention studies:A brief overview J.Nutrients,2019,11(7):1510.2 YANG W,GUO Y,LIU M,et al.Structure and function of blueberry anthocyanins:A review of recent advances J.J Funct Foods,2022,88:104864.152 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 第 14 卷 3 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