临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料.ppt

临床床样本的采集运本的采集运输和保存和保存及核酸提取及核酸提取资料料研究背景研究背景l 样本的采集、处理样本的采集、处理l 样本的保存样本的保存l 样本的运输样本的运输l DNADNA的提取的提取l RNARNA的提取的提取2021/1/122021/1/122 2研究背景研究背景一、样本的采集、处一、样本的采集、处 理、保存及运输理、保存及运输2021/1/122021/1/123 3临床标本的正确采集、运送、保存临床标本的正确采集、运送、保存的重要性的重要性l l临床检验的质量保证关键性环节临床检验的质量保证关键性环节临床检验的质量保证关键性环节临床检验的质量保证关键性环节l l解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一2021/1/122021/1/124 4一、样本的采集一、样本的采集地贫检测样品采集：地贫检测样品采集：l 外周血外周血:5mLl 脐带血脐带血:0.51mLl 羊羊 水：水：2030mLl 绒绒 毛：毛：15mgl 唾唾 液液l 组组 织织2021/1/122021/1/125 5标本采集的本卷须知标本采集的本卷须知l l所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染的原则所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染的原则所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染的原则所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染的原则下进展下进展下进展下进展l l已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送l l采集足够量标本采集足够量标本采集足够量标本采集足够量标本l l每份标本都应标记患者姓名、送检号码、标本来源、详细部位、每份标本都应标记患者姓名、送检号码、标本来源、详细部位、每份标本都应标记患者姓名、送检号码、标本来源、详细部位、每份标本都应标记患者姓名、送检号码、标本来源、详细部位、日期、时间及相关临床信息日期、时间及相关临床信息日期、时间及相关临床信息日期、时间及相关临床信息2021/1/122021/1/126 6全全 血血l l以全血作为待测标本时，必须注意抗凝剂以全血作为待测标本时，必须注意抗凝剂的选择，一般使用的选择，一般使用EDTA-Na2EDTA-Na2或枸椽酸钠，或枸椽酸钠，不可使用肝素不可使用肝素l l全血样本如用于全血样本如用于DNADNA提取检测，可提取检测，可44下短下短期保存期保存,如用于如用于RNARNA检测，则应在取血后，检测，则应在取血后，尽快提取尽快提取RNARNA2021/1/122021/1/127 7血清浆血清浆l lDNADNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大对测定影响不大l lRNARNA测定，标本的获取和保存方式对测定结测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用果，可能有决定性影响。最好是使用EDTAEDTA抗凝抗凝(严禁使用肝素严禁使用肝素)全血标本，抗凝后全血标本，抗凝后6 6小小时内别离血浆，如使用血清标本，则需尽时内别离血浆，如使用血清标本，则需尽快快(2(2小时内小时内)别离血清，标本的短期别离血清，标本的短期1 12 2周保存可在周保存可在-20-20下，较长期保存应在下，较长期保存应在-7070下下 2021/1/122021/1/128 8肝素的作用机理肝素的作用机理l l肝素对肝素对肝素对肝素对MLVMLV逆转录酶和逆转录酶和逆转录酶和逆转录酶和TAQ DNATAQ DNA聚合酶均很强的抑聚合酶均很强的抑聚合酶均很强的抑聚合酶均很强的抑制作用，假如临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过制作用，假如临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过制作用，假如临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过制作用，假如临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，标本中的肝素可结合于程中，标本中的肝素可结合于程中，标本中的肝素可结合于程中，标本中的肝素可结合于DNADNA和和和和RNARNA上上上上l l对标本进展煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、对标本进展煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、对标本进展煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、对标本进展煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用l l每每每每gg核酸标本中参加核酸标本中参加核酸标本中参加核酸标本中参加0.1U0.1U的肝素，即可的肝素，即可的肝素，即可的肝素，即可100%100%的抑制的抑制的抑制的抑制酶活性酶活性酶活性酶活性l l在标本中参加肝素酶在标本中参加肝素酶在标本中参加肝素酶在标本中参加肝素酶I I 或或或或13 U/g13 U/g核酸在于核酸在于核酸在于核酸在于5 mM 5 mM Tris pH7.5,1 mM CaCl2,40 U RNasin 25 Tris pH7.5,1 mM CaCl2,40 U RNasin 25 下作用下作用下作用下作用2 2小时可去除肝素的抑制作用小时可去除肝素的抑制作用小时可去除肝素的抑制作用小时可去除肝素的抑制作用2021/1/122021/1/129 9二、样本的运送二、样本的运送 l l样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室l l样本中如参加了适当的稳定剂，如用于样本中如参加了适当的稳定剂，如用于样本中如参加了适当的稳定剂，如用于样本中如参加了适当的稳定剂，如用于DNADNADNADNA测定的测定的测定的测定的EDTAEDTAEDTAEDTA抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄l l建议：将全血标本或建议：将全血标本或建议：将全血标本或建议：将全血标本或DNADNADNADNA样本用冰袋加泡沫盒快递样本用冰袋加泡沫盒快递样本用冰袋加泡沫盒快递样本用冰袋加泡沫盒快递运送。如需提取运送。如需提取运送。如需提取运送。如需提取RNARNARNARNA的样本需预处理后加的样本需预处理后加的样本需预处理后加的样本需预处理后加lml lml lml lml TrizolTrizolTrizolTrizol在低温运送在低温运送在低温运送在低温运送2021/1/122021/1/121010三、样本的保存三、样本的保存l l常规外周血标本，采集后做血常规，常温常规外周血标本，采集后做血常规，常温常规外周血标本，采集后做血常规，常温常规外周血标本，采集后做血常规，常温2424小时内，小时内，小时内，小时内，4 4可保存可保存可保存可保存1 1周；做血红蛋白电泳常温周；做血红蛋白电泳常温周；做血红蛋白电泳常温周；做血红蛋白电泳常温1 1周，电泳周，电泳周，电泳周，电泳4 4可保存可保存可保存可保存1515天；天；天；天；DNADNA提取样本常温提取样本常温提取样本常温提取样本常温2424小时，小时，小时，小时，4 4保存保存保存保存1 1个星期，个星期，个星期，个星期，20 20 保存保存保存保存3 3个月，个月，个月，个月，70 70 保存半年保存半年保存半年保存半年3 3年；年；年；年；RNARNA提取样本常提取样本常提取样本常提取样本常温温温温6 6小时，小时，小时，小时，4 4保存保存保存保存1212小时，小时，小时，小时，70 70 保存保存保存保存3 3个月，羊水在个月，羊水在个月，羊水在个月，羊水在1212小时内离心可保存同上。小时内离心可保存同上。小时内离心可保存同上。小时内离心可保存同上。2021/1/122021/1/121111研究背景研究背景 二、核酸的提取二、核酸的提取2021/1/122021/1/121212核酸提取的重要性核酸提取的重要性l l核酸提取是临床核酸提取是临床PCRPCR检验最为关键的部分，检验最为关键的部分，亦是手式操作的主要部分亦是手式操作的主要部分l l核酸提取的成败关系到临床核酸提取的成败关系到临床PCRPCR检验的正确检验的正确与否与否l l临床临床PCRPCR检验操作中最易出问题的环节检验操作中最易出问题的环节2021/1/122021/1/121313一、提取核酸总的原则一、提取核酸总的原则l l保证核酸一级构造的完好性；保证核酸一级构造的完好性；保证核酸一级构造的完好性；保证核酸一级构造的完好性；l l其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应分子的污染应分子的污染应分子的污染应降低到最低程度；降低到最低程度；降低到最低程度；降低到最低程度；l l核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；高浓度的金属离子；高浓度的金属离子；高浓度的金属离子；l l其他核酸分子，如提取其他核酸分子，如提取其他核酸分子，如提取其他核酸分子，如提取DNADNADNADNA中的中的中的中的RNARNARNARNA，也应尽量去除。，也应尽量去除。，也应尽量去除。，也应尽量去除。2021/1/122021/1/121414二、核酸提取的根本步骤二、核酸提取的根本步骤1 1、核酸的释放：、核酸的释放：破裂细胞破裂细胞释放核酸释放核酸 机械法与非机械法机械法与非机械法 非机械法中溶胞法是应最广泛的方法非机械法中溶胞法是应最广泛的方法2021/1/122021/1/121515各种组织细胞破碎方法各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法细胞破碎方法细胞破碎方法细胞破碎方法 应用应用应用应用 机械法机械法机械法机械法1.1.1.1.匀浆法匀浆法匀浆法匀浆法机体软组织机体软组织机体软组织机体软组织2.2.2.2.捣碎法捣碎法捣碎法捣碎法动物韧性组织动物韧性组织动物韧性组织动物韧性组织3.3.3.3.研磨法研磨法研磨法研磨法细菌、酵母细菌、酵母细菌、酵母细菌、酵母 物理法物理法物理法物理法1.1.1.1.超声法超声法超声法超声法细胞混悬液细胞混悬液细胞混悬液细胞混悬液2.2.2.2.反复冻融法反复冻融法反复冻融法反复冻融法培养细胞培养细胞培养细胞培养细胞3.3.3.3.冷热交替法冷热交替法冷热交替法冷热交替法细菌、病毒细菌、病毒细菌、病毒细菌、病毒4.4.4.4.低渗裂解低渗裂解低渗裂解低渗裂解红细胞红细胞红细胞红细胞 化学法化学法化学法化学法1.1.1.1.有机溶剂有机溶剂有机溶剂有机溶剂细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液2.2.2.2.去垢剂去垢剂去垢剂去垢剂组织、培养细胞、组织、培养细胞、组织、培养细胞、组织、培养细胞、血液血液血液血液3.3.3.3.酶解法酶解法酶解法酶解法细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液2021/1/122021/1/1216162 2、核酸的别离与纯化：、核酸的别离与纯化：、核酸的别离与纯化：、核酸的别离与纯化：将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质别离他物质别离他物质别离他物质别离 非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖和脂非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖和脂非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖和脂非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖和脂 类分子、非需要的核酸分子、试剂和溶液类分子、非需要的核酸分子、试剂和溶液类分子、非需要的核酸分子、试剂和溶液类分子、非需要的核酸分子、试剂和溶液2021/1/122021/1/1217173 3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤、核酸的浓缩、沉淀与洗涤、核酸的浓缩、沉淀与洗涤、核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除部分杂质与某些盐离子沉淀可去除部分杂质与某些盐离子沉淀可去除部分杂质与某些盐离子沉淀可去除部分杂质与某些盐离子参加一定的盐类醋酸钠、氯化钠等后使用有参加一定的盐类醋酸钠、氯化钠等后使用有参加一定的盐类醋酸钠、氯化钠等后使用有参加一定的盐类醋酸钠、氯化钠等后使用有机溶剂如乙醇、异丙醇等机溶剂如乙醇、异丙醇等机溶剂如乙醇、异丙醇等机溶剂如乙醇、异丙醇等少数盐类可使用少数盐类可使用少数盐类可使用少数盐类可使用70-75%70-75%的乙醇洗涤的乙醇洗涤的乙醇洗涤的乙醇洗涤2021/1/122021/1/121818 4.核酸的鉴定核酸的鉴定 浓度鉴定浓度鉴定 纯度鉴定纯度鉴定 完好性鉴定完好性鉴定2021/1/122021/1/121919浓度鉴定浓度鉴定DNADNA：1 1紫紫外外分分光光光光度度法法：测测定定DNADNA在在A260nmA260nm的的光吸收值。光吸收值。如计算如计算DNADNA浓度浓度 A260 A260稀释倍数稀释倍数5050 g/ml g/ml的核酸溶液。的核酸溶液。(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA，40g/ml单链DNA或RNA，20g/ml单链寡核苷酸2021/1/122021/1/122020RNARNA：l l紫外吸光光度法紫外吸光光度法:A A260260稀释倍数稀释倍数4040 g/ml g/ml(OD260-OD320)(OD260-OD320)稀释倍数稀释倍数4040 g/ml g/ml2021/1/122021/1/1221212 2 2 2荧光光度法荧光光度法荧光光度法荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析适用于低浓度核酸溶液的定量分析适用于低浓度核酸溶液的定量分析适用于低浓度核酸溶液的定量分析1-5ng1-5ng1-5ng1-5ng2021/1/122021/1/122222EB与DNA的结合2021/1/122021/1/122323纯度鉴定纯度鉴定紫外分光光度法：紫外分光光度法：紫外分光光度法：紫外分光光度法：在在在在260nm260nm和和和和280nm280nm处测定处测定处测定处测定DANDAN溶液的光吸收，纯溶液的光吸收，纯溶液的光吸收，纯溶液的光吸收，纯的的的的DNA A260DNA A260与与与与A280A280之比应在之比应在之比应在之比应在1.80(1.601.80)1.80(1.601.80)，低于此值说明制备物中留有蛋白质成份。高于，低于此值说明制备物中留有蛋白质成份。高于，低于此值说明制备物中留有蛋白质成份。高于，低于此值说明制备物中留有蛋白质成份。高于此值说明有此值说明有此值说明有此值说明有RNARNA的残留量的残留量的残留量的残留量纯的纯的纯的纯的RNA A260RNA A260与与与与A280A280之比应在之比应在之比应在之比应在2.0(1.0),2.0(1.0),Ratio1.8:Ratio2.2:RNA;Ratio2.2:RNA可能可能可能可能已经水解成单核苷酸已经水解成单核苷酸已经水解成单核苷酸已经水解成单核苷酸A260/A280比值是纯度检测的重要指标！比值是纯度检测的重要指标！注：注：注：注：测测测测定吸光定吸光定吸光定吸光值值值值，稀，稀，稀，稀释释释释液液液液应应应应使用使用使用使用2021/1/122021/1/122424完好性鉴定完好性鉴定凝胶电泳法：凝胶电泳法：基因组基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，假如发生电泳，在电场中泳动慢，假如发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；降解，可出现电泳图谱脱尾现象；总总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存电泳，观测各条带的含量，提示是否存在在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。污染。2021/1/122021/1/122525DNA完好性鉴定：完好性鉴定：2021/1/122021/1/122626正常时，正常时，28S RNA的荧光强度的荧光强度约为约为18S RNA的的2倍，否则提示倍，否则提示RNA的降解的降解RNA完好性鉴定：完好性鉴定：2021/1/122021/1/1227275 5、核酸的贮存、核酸的贮存、核酸的贮存、核酸的贮存DNADNA保存保存保存保存1 1 1 1短期贮存：短期贮存：短期贮存：短期贮存：4 4 4 4或或或或-20-20-20-20存放于存放于存放于存放于TETETETEtristristristris和和和和EDTAEDTAEDTAEDTA缓冲液中。缓冲液中。缓冲液中。缓冲液中。TETETETE缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液的的的的PHPHPHPH与与与与DNA DNA DNA DNA 贮贮贮贮存存存存有有有有关关关关，PHPHPHPH为为为为8 8 8 8时时时时，可可可可减减减减少少少少DNADNADNADNA脱氨反响，脱氨反响，脱氨反响，脱氨反响，PHPHPHPH低于低于低于低于7.07.07.07.0时时时时DNADNADNADNA容易变性。容易变性。容易变性。容易变性。2 2 2 2长期贮存：长期贮存：长期贮存：长期贮存：TETETETE缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液中中中中-70-70-70-70保保保保存存存存数数数数年年年年；在在在在DNADNADNADNA溶溶溶溶液液液液中中中中加加加加一一一一滴滴滴滴氯氯氯氯仿仿仿仿可有效防止细菌和核酸的污染。可有效防止细菌和核酸的污染。可有效防止细菌和核酸的污染。可有效防止细菌和核酸的污染。2021/1/122021/1/122828核酸的贮存核酸的贮存核酸的贮存核酸的贮存RNARNA保存：保存：保存：保存：l l的醋酸钠溶液或双蒸水，在的醋酸钠溶液或双蒸水，在-70-70保存。保存。l lRNARNA可溶于可溶于70%70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在中，可在-20-20 保存。保存。l lRNARNA假如以假如以DEPCDEPC焦碳酸二乙酯可以抑制焦碳酸二乙酯可以抑制RNARNA酶酶对对RNARNA的降解的降解2021/1/122021/1/122929三、基因组三、基因组DNA的别的别离与纯化离与纯化2021/1/122021/1/123030一、一、DNA样品准备样品准备l l 常见的标本：常见的标本：l l 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等l l 生物组织：生物组织：l l 最好新颖组织，假设不能马上提取，应贮存最好新颖组织，假设不能马上提取，应贮存 l l 70 70或液氮或液氮2021/1/122021/1/123131DNA提取前样本采集、提取前样本采集、预处理和保存：预处理和保存：l l全血全血全血全血 抗凝剂：抗凝剂：EDTA-Na2EDTA-Na2 或枸橼酸钠或枸橼酸钠或枸橼酸钠或枸橼酸钠 作为抗凝剂作为抗凝剂作为抗凝剂作为抗凝剂 不宜使用肝素不宜使用肝素不宜使用肝素不宜使用肝素 抗凝剂处理血抗凝剂处理血肝素肝素柠檬酸柠檬酸*EDTA*EDTA*-80-80保存保存2 2个月，第个月，第1010天收率天收率90%90%4 4 第四天收率第四天收率90%90%第第1010天提取效天提取效果差果差第十天收率第十天收率85%85%室温室温提取效果差提取效果差第四天收率第四天收率90%90%第十天提取效果差第十天提取效果差2021/1/122021/1/123232二、二、DNA提取提取l l一酚抽提法：一酚抽提法：l l 先先用用EDTAEDTA、SDSSDS、蛋蛋白白酶酶K K破破碎碎细细胞胞，消消化化蛋蛋白白，然然后后用用pH8pH8的的TrisTris饱饱和和酚酚或或酚酚-氯氯仿仿抽抽提提DNADNA，最最后后乙乙醇醇或或异异丙丙醇醇进进展展沉沉淀淀。获获DNADNA大小为大小为100100150kb150kb。2021/1/122021/1/123333酚酚抽抽提提法法提提取取步步骤：骤：2021/1/122021/1/123434DNA酚抽提法示意图2021/1/122021/1/123535主要试剂的作用：主要试剂的作用：主要试剂的作用：主要试剂的作用：EDTAEDTA：1.1.二价金属螯合剂，抑制核酸酶；二价金属螯合剂，抑制核酸酶；2.2.降低细胞膜的稳定性降低细胞膜的稳定性2021/1/122021/1/123636SDSSDS的作用：的作用：的作用：的作用：1.1.1.1.溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂2.2.2.2.溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来释放出来释放出来释放出来3.3.3.3.对对对对RNARNARNARNA、DNADNADNADNA酶有抑制作用酶有抑制作用酶有抑制作用酶有抑制作用4.4.4.4.与蛋白质形成与蛋白质形成与蛋白质形成与蛋白质形成R-O-SO3.RR-O-SO3.RR-O-SO3.RR-O-SO3.R蛋白质复合物，蛋白质复合物，蛋白质复合物，蛋白质复合物，使蛋白质变性使蛋白质变性使蛋白质变性使蛋白质变性2021/1/122021/1/123737蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K K：l l水解蛋白质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化DNADNADNADNA酶和细胞中的蛋白质酶和细胞中的蛋白质酶和细胞中的蛋白质酶和细胞中的蛋白质l l蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K K K K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在力，而且在力，而且在力，而且在SDSSDSSDSSDS、EDTAEDTAEDTAEDTA存在时仍保持较高活性，可存在时仍保持较高活性，可存在时仍保持较高活性，可存在时仍保持较高活性，可 同时使用同时使用同时使用同时使用2021/1/122021/1/123838苯酚：苯酚：苯酚：苯酚：l l蛋白质强变性剂、抑制蛋白质强变性剂、抑制蛋白质强变性剂、抑制蛋白质强变性剂、抑制DNADNADNADNA酶活性酶活性酶活性酶活性l l苯酚溶于有机溶剂，微溶于水苯酚溶于有机溶剂，微溶于水苯酚溶于有机溶剂，微溶于水苯酚溶于有机溶剂，微溶于水l l提取提取提取提取DNADNADNADNA前苯酚用前苯酚用前苯酚用前苯酚用Tris-HclTris-HclTris-HclTris-Hcl饱和，防止吸收过多饱和，防止吸收过多饱和，防止吸收过多饱和，防止吸收过多DNADNADNADNA，降低，降低，降低，降低DNADNADNADNA的损失率的损失率的损失率的损失率l l氧化苯酚会破坏氧化苯酚会破坏氧化苯酚会破坏氧化苯酚会破坏DNADNADNADNA2021/1/122021/1/123939DNADNA的沉淀：的沉淀：的沉淀：的沉淀：1 1无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀沉淀前往往参加沉淀前往往参加沉淀前往往参加沉淀前往往参加NaClNaCl等盐离子，作用是中和核酸分子外表的等盐离子，作用是中和核酸分子外表的等盐离子，作用是中和核酸分子外表的等盐离子，作用是中和核酸分子外表的负电荷，有助于分子之间的聚集。负电荷，有助于分子之间的聚集。负电荷，有助于分子之间的聚集。负电荷，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNADNA沉淀析出，无水乙沉淀析出，无水乙沉淀析出，无水乙沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少醇使用前冰冻，可以减少醇使用前冰冻，可以减少醇使用前冰冻，可以减少DNADNA沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对DNADNA的损伤。的损伤。的损伤。的损伤。2 2异丙醇沉淀异丙醇沉淀异丙醇沉淀异丙醇沉淀 除了使除了使除了使除了使DNADNA沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的RNARNA分子分子分子分子2021/1/122021/1/124040二二 甲酰胺解聚法：甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与蛋白质与DNADNA的结合，再透析获得的结合，再透析获得DNADNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNADNA的复的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚屡合物，可以使蛋白质变性。减少了酚屡次抽提的步骤次抽提的步骤甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的量的DNADNA样品。可得样品。可得DNA 200kbDNA 200kb左右。左右。2021/1/122021/1/124141三磁珠法：三磁珠法：磁珠在高盐低磁珠在高盐低pHpH值下吸附核酸，在低盐高值下吸附核酸，在低盐高pHpH值下与核酸别离，再通过挪动磁珠来值下与核酸别离，再通过挪动磁珠来获取获取DNADNA2021/1/122021/1/124242四微柱法四微柱法 ：利用利用DNADNA在高盐、低在高盐、低pHpH的特定溶液环境下可的特定溶液环境下可吸附在固相介质如硅胶膜上，洗涤去吸附在固相介质如硅胶膜上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使除杂质后，再改变溶液环境使DNADNA溶解到纯溶解到纯水或水或TETE中中2021/1/122021/1/124343三、三、DNA的浓缩的浓缩l l固固体体聚聚乙乙二二醇醇PEGPEG浓浓缩缩：用用透透析析袋袋 外敷外敷PEGPEG至适宜量至适宜量l l丁丁醇醇抽抽提提浓浓缩缩：DNADNA溶溶液液中中水水可可分分配配到到正正丁丁醇醇或或仲仲丁丁醇醇，但但DNADNA不不会会。因因此此重重复复几几次可显著减少次可显著减少DNADNA体积体积2021/1/122021/1/124444四、四、DNA回收回收 l l主要是从电泳中别离回收主要是从电泳中别离回收DNADNA片段片段l l回收原则：尽量进步回收率回收原则：尽量进步回收率l l 去除回收去除回收DNADNA样品中的污染物样品中的污染物2021/1/122021/1/124545l lDNADNA降解的原因降解的原因降解的原因降解的原因l l 样本不够新颖，采集材料过陈旧样本不够新颖，采集材料过陈旧样本不够新颖，采集材料过陈旧样本不够新颖，采集材料过陈旧l l 样本本身存在大量样本本身存在大量样本本身存在大量样本本身存在大量DNADNA酶酶酶酶l l提取提取提取提取DNADNA的生物活性差的原因？的生物活性差的原因？的生物活性差的原因？的生物活性差的原因？l l 提取的基因组提取的基因组提取的基因组提取的基因组DNADNA盐浓度过高盐浓度过高盐浓度过高盐浓度过高l l 基因组基因组基因组基因组DNADNA中乙醇未去除净中乙醇未去除净中乙醇未去除净中乙醇未去除净l l 基因组基因组基因组基因组DNADNA中可能存在其他抑制因素中可能存在其他抑制因素中可能存在其他抑制因素中可能存在其他抑制因素l l提取基因组提取基因组提取基因组提取基因组DNADNA，有时参加蔗糖的原因，有时参加蔗糖的原因，有时参加蔗糖的原因，有时参加蔗糖的原因l l 参加多糖，保护参加多糖，保护参加多糖，保护参加多糖，保护DNADNA长度长度长度长度影响影响DNA质量的因素质量的因素2021/1/122021/1/124646四、四、RNA的别离与纯化的别离与纯化2021/1/122021/1/124747一、样本来源一、样本来源l l理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取可以提取RNAl l样本选择取决于试验目的样本选择取决于试验目的l l全血是基因组提取全血是基因组提取RNA最常见的样本最常见的样本2021/1/122021/1/124848每个细胞的每个细胞的每个细胞的每个细胞的RNARNA量约为量约为量约为量约为1010-5-5 g g 80%-85%rRNA 80%-85%rRNA 10%-15%tRNA 10%-15%tRNA 1%-5%mRNA 1%-5%mRNA 其他其他其他其他RNARNA：hnRNAhnRNA、snRNA snRNA、snoRNAsnoRNA2021/1/122021/1/124949组织材料组织材料组织材料组织材料起始样品量起始样品量起始样品量起始样品量Total RNATotal RNA提取量提取量提取量提取量bloodblood1ml1ml15201520ggleukocytesleukocytes1 1101010107 7 7 7个个个个约约约约100 100 ggLiver tissueLiver tissue1g1g约约约约5000 5000 ggCulture cellsCulture cells1 1101010107 7 7 7个个个个约约约约100100ggRenal tissueRenal tissue1g1g约约约约30003000ggSkeleton tissueSkeleton tissue1g1g约约约约15001500ggCerebral tissueCerebral tissue1g1g约约约约15001500gg2021/1/122021/1/125050二、二、RNA提取的独特性提取的独特性关于关于RNase酶酶l l临临床床标标本本及及实实验验室室环环境境中中,存存在在大大量量对对RNARNA具具有有强强烈烈降降解解作作用用的的RNaseRNase，而而RNaseRNase较较耐耐高温高温,不易失活不易失活l l如如何何防防止止RNaseRNase对对标标本本的的污污染染及及防防止止RNaseRNase对对提提取取的的RNARNA的的降降解解,是是保保证证RNARNA成成功功提提取取的的关键之所在关键之所在2021/1/122021/1/125151RNase酶酶l lRNARNARNARNA易易易易被被被被RNaseRNaseRNaseRNase水水水水解解解解，RNaseRNaseRNaseRNase除除除除胞胞胞胞内内内内还还还还广广广广泛泛泛泛存存存存在在在在于于于于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中l lRNaseRNaseRNaseRNase具有水解核糖残基和磷酸二酯键具有水解核糖残基和磷酸二酯键具有水解核糖残基和磷酸二酯键具有水解核糖残基和磷酸二酯键l lRNaseRNaseRNaseRNase分分分分子子子子构构构构造造造造中中中中的的的的二二二二硫硫硫硫键键键键使使使使其其其其生生生生物物物物学学学学活活活活性性性性非非非非常常常常稳定，去除变性剂后，稳定，去除变性剂后，稳定，去除变性剂后，稳定，去除变性剂后，RNaseRNaseRNaseRNase的活性又可恢复的活性又可恢复的活性又可恢复的活性又可恢复2021/1/122021/1/125252l l去去去去除除除除RNaseRNaseRNaseRNase的的的的污污污污染染染染及及及及强强强强有有有有力力力力地地地地抑抑抑抑制制制制其其其其活活活活性性性性是是是是RNARNARNARNA制备成功与否的关键制备成功与否的关键制备成功与否的关键制备成功与否的关键l l必必必必须须须须在在在在总总总总RNARNARNARNA提提提提取取取取别别别别离离离离的的的的最最最最初初初初阶阶阶阶段段段段，尽尽尽尽可可可可能能能能地地地地灭活胞内灭活胞内灭活胞内灭活胞内RNaseRNaseRNaseRNase的活性的活性的活性的活性1.内源性内源性RNA酶酶intrinsic RNase2021/1/122021/1/1253532.外源性外源性RNA酶酶(extrinsic RNase)主要来源：主要来源：l l 被污染的缓冲液被污染的缓冲液细菌或微生物污染，高压不能去除细菌或微生物污染，高压不能去除RNARNA酶酶l l 自动移液装置自动移液装置2021/1/122021/1/1254543.实验室采取防止实验室采取防止RNA酶污染的措施酶污染的措施设置专门设置专门RNA移液装置移液装置小份保存缓冲液小份保存缓冲液设置专门的设置专门的RNA电泳装置电泳装置准备溶液或缓冲液时，使用无准备溶液或缓冲液时，使用无RNA酶的器酶的器皿、皿、DEPC处理水等处理水等别离别离RNA过程中使用过程中使用RNA酶抑制剂酶抑制剂2021/1/122021/1/1255554.RNA酶的去除酶的去除l lDEPC焦碳酸二乙酯l l高度活化的烷基化试剂，破坏RNA酶活性。用来灭活缓冲液或器皿中的RNA酶。l lOC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制备：0.1%DEPC在37C处理1h，并高压灭菌15min。玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%的DEPC水溶液中，37C处理1h或室温下过夜。DEPC非选择性的修饰蛋白质和非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液，且与一些缓冲液不相容，故在别离和纯化不相容，故在别离和纯化RNA的过程中不使用的过程中不使用DEPC2021/1/122021/1/1256565.RNA提取所用器皿的处理提取所用器皿的处理l l经经经经高高高高压压压压灭灭灭灭菌菌菌菌的的的的一一一一次次次次性性性性使使使使用用用用的的的的塑塑塑塑料料料料制制制制品品品品如如如如试试试试管管管管,离离离离心心心心管管管管等等等等根根根根本上无本上无本上无本上无RNase,RNase,RNase,RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存可以不经预处理直接用于制备和贮存可以不经预处理直接用于制备和贮存可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA RNA RNA RNA l l实实实实验验验验室室室室用用用用的的的的普普普普通通通通玻玻玻玻璃璃璃璃器器器器皿皿皿皿经经经经常常常常有有有有RNaseRNaseRNaseRNase污污污污染染染染,使使使使用用用用前前前前必必必必须须须须于于于于180180180180干干干干烤烤烤烤8 8 8 8小小小小时时时时以以以以上上上上,或或或或用用用用0.1%0.1%0.1%0.1%焦焦焦焦碳碳碳碳酸酸酸酸二二二二乙乙乙乙酯酯酯酯(DEPC)(DEPC)(DEPC)(DEPC)的的的的水水水水溶液浸泡用于制备溶液浸泡用于制备溶液浸泡用于制备溶液浸泡用于制备RNARNARNARNA的烧杯的烧杯的烧杯的烧杯,试管和其它用品试管和其它用品试管和其它用品试管和其它用品l lDEPCDEPCDEPCDEPC是是是是RNaseRNaseRNaseRNase的的的的强强强强烈烈烈烈抑抑抑抑制制制制剂剂剂剂。灌灌灌灌满满满满DEPCDEPCDEPCDEPC的的的的器器器器皿皿皿皿于于于于37373737下下下下放放放放置置置置2 2 2 2小小小小时时时时，然然然然后后后后用用用用灭灭灭灭菌菌菌菌水水水水淋淋淋淋洗洗洗洗数数数数次次次次，并并并并于于于于100100100100干干干干烤烤烤烤15151515分分分分钟钟钟钟，最最最最后后后后高高高高压