金葡素SEC2改构蛋白2M...吐、致热毒性和免疫原性作用_潘梦.pdf

第 30 卷第 2 期2023 年 4 月海南热带海洋学院学报Journal of Hainan Tropical Ocean UniversityVol 30 No 2Apr 2023收稿日期:2022 10 12基金项目:海南省高层次人才基金项目(2019RC244)第一作者:潘梦，女，河北石家庄人，在读硕士研究生，研究方向为天然活性物质应用。通信作者:宋宇，女，吉林长春人，教授，博士，研究方向为中药、天然活性成分的应用基础研究。金葡素 SEC2 改构蛋白 2M-118 对小鼠的致呕吐、致热毒性和免疫原性作用潘梦1a，b，c;2a，王义山1a，b，c;2b，宋颖3，李洪义4，周锦3，艾永兴2b，宋宇1a，b，c(1 海南热带海洋学院 a 热带海洋生物资源利用与保护教育部重点实验室;b 海南热带海洋渔业资源保护与利用重点实验室;c 水产与生命学院，海南 三亚 572022;2 吉林大学 a 生命科学学院;b 动物科学学院，长春 130062;3 长春市宽城区医院，长春 130052;4 沈阳协合生物制药股份有限公司，沈阳 110179)摘要:为了探究金葡素 SEC2(Staphylococcal enterotoxins C 2)改构蛋白2M-118 对小鼠的致呕吐、致热毒性和免疫原性作用，将 BALB/c 小鼠分为正常组、2M-118 腹腔给药组和灌胃给药组，每组 10 只;通过观察小鼠给药前后状态变化及记录小鼠体质量和体温，评价 2M-118 对小鼠的致呕吐和致热毒性;采用 MTT 法检测 2M-118 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响;由 ELISA 法检测小鼠给药 2M-118 后血清产生中和抗体的情况。结果表明，2M-118 并未致小鼠呕吐或致小鼠体温升高;2M-118 可以刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，促进脾组织中 IFN-、TNF-和 IL-2 等细胞因子的表达，并刺激机体产生针对 2M-118 的中和抗体。关键词:SEC2;2M-118;细胞因子;免疫原性中图分类号:R99文献标识码:A文章编号:2096 3122(2023)02 0122 07DOI:10 13307/j issn 2096 3122 2023 02 150引言超抗原(Super antigen，SAg)主要由细菌外毒素和逆转录病毒产物组成，它可以产生强烈免疫应答蛋白分子，并以极低的量非特异性地刺激 T 细胞活化增殖1。金葡素(Staphylococcal enterotoxins C，SEC)是金黄色葡萄球菌产生的外源性超抗原，它通过产生多种细胞因子参与身体免疫应答2 3。超抗原 SEC 可依赖细胞介导的细胞毒发挥抗肿瘤作用4，SEC 共有6 个亚型，其中 SEC2 作为金葡素注射液的主要成分，用于治疗胸瘘、乳糜胸、气胸、皮下积液和腹瘘等病症5，亦可用于治疗骨科疾病，如促进骨折愈合，改善骨坏死6 等。尽管研究人员发现 SEC2 拥有强大而广泛的药理作用，但 SEC 作为一种天然肠毒素，具有一定的毒性，可引起发热、呕吐、腹泻等不良反应7，甚至致命性休克，其临床应用受到限制，因此需要对 SEC蛋白突变体不断进行深入研究8。SEC2 的晶体结构表明，第 47、118 和 122 位上的组氨酸残基是形成两个 Zn 结合域的必要因素9。第47 位残基的突变可能削弱 SEC2 对 T 淋巴细胞增殖的刺激活性10。第118 和122 位的组氨酸与致呕吐和致热毒性相关，取代这两个位点的组氨酸可以降低此类副作用而不影响其超抗原活性11。有研究表明，第 20 和 22 位的残基在 T 细胞表面受体复合物(T-cell receptor complex，TCR)结合和多克隆 T 淋巴细胞活化中起重要作用12。为了获得更低毒性的重组蛋白突变体，研究人员设计并纯化了一种新型突变的SEC2，即 2M-118，其中第 118 位的组氨酸被丙氨酸取代，第 20 位苏氨酸被亮氨酸取代，第 22 位甘氨酸被谷氨酰胺取代。无论是预测功能，还是实验验证都显示，该变体不会降低超抗原活性13 359，并具有一定的抗肿瘤作用14。本研究考察 2M-118 对小鼠的致呕吐、致热毒性及免疫原性作用，为其制剂研发及指导临221潘梦等:金葡素 SEC2 改构蛋白 2M-118 对小鼠的致呕吐、致热毒性和免疫原性作用2023 年第 2 期床应用奠定基础。1 材料与方法1 1 动物50 只无特定病原体 SPF(Specefic pathogen free)级 5 周龄雌性 BALB/c 小鼠采购于北京维通利华实验动物技术有限公司(体质量 17 19 g)，动物许可证号:SCXK(苏)2018-0008。在吉林大学动物伦理福利委员会监督下，本研究在吉林大学实验动物中心屏障设施内开展实验，并遵守吉林大学及国家对实验动物伦理福利的要求。实验过程中小鼠自由采食饮水。1 2 主要试剂超抗原 SEC 改构蛋白 2M-118 和 Mouse Anti-2M-118(14C6)由沈阳协和生物制药股份有限公司提供;Goat Anti-Mouse IgG/HRP 购自 Solarbio 生物公司;细胞因子 ELISA 检测试剂盒购自 Biolegend 生物技术有限公司。1 3 仪器小型动物气体麻醉机(上海玉研科学仪器有限公司);组织匀浆机(M P Biomedicals);全波长酶标仪(Biotek，Epoch);CO2恒温培养箱(YAMATO，BNA610)。1 4 动物实验设计小鼠购入后于 SPF 级实验动物设施中适应性喂养 1 周后，随机将其分为 5 组:正常组(CTL)、腹腔给药低(ML)、中(MM)、高(MH)剂量组和灌胃给药组(Mg)，每组 10 只。整体动物实验设计如图 1 所示。适应性喂养结束后，分别采取腹腔注射或灌胃处理各组小鼠，给药体积为 200 L/只，1 次/3d。CTL 组腹腔注射等体积生理盐水;ML、MM、MH 组分别腹腔注射 1、2、4 mgkg12M-118;Mg 组灌胃 2 5 mgkg12M-118。每日观察小鼠生存状态，每次给药 2 h 后测量小鼠体温，实验周期为 26 d。在末次给药 0 5 h 和2 h 分别处死 5 只小鼠，收集脾组织和血清，80 保存备用。08111417202326Days（天）2M-118Sacrifice（鼠）图 12M-118 对小鼠毒性和免疫原性作用的动物实验设计1 5 MTT 法检测脾细胞增殖能力无菌取小鼠脾，制备单个脾细胞悬液，调整细胞浓度为 5 106个/mL，100 L/孔接种于 96 孔培养板中，同时设阴性对照组和空白对照组，实验结束前 4 h 加入 MTT 溶液，酶标仪570 nm 处测吸光值。小鼠脾细胞增殖率(%)的计算公式为=Ad AyAy A0100%，其中:Ad为药物组吸光值;Ay为阴性组吸光值;A0为空白组吸光值。1 6 ELISA 法检测脾组织中细胞因子取保存于 80 冰箱的小鼠脾组织，提取蛋白并定量蛋白浓度后，按照 ELISA 试剂盒说明书检测组织中 IFN-、TNF-及 IL-2 的表达情况。1 7 ELISA 法检测血清中 2M-118 含量及中和抗体取保存于 80 冰箱的血清，采用 ELISA 法检测 2M-118 的血药浓度，其中包被一抗为 Mouse Anti-2M-118(14C6)抗体，HRP 标记二抗为 HRP Mouse Anti-2M-118(HRP-1C11)抗体;采用 ELISA 法检测血清中 2M-118 中和抗体浓度，其中包被一抗为 2M-118，二抗为 Goat anti-Mouse IgG/HRP 抗体，其他参考 1 6细胞因子检测操作。321第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报1 8 统计学分析实验数据用 Graphpad Prism 9 软件进行分析，采用 Mean SD 表示，组间差异采用 One-way ANOVA 比较分析，P 0 05 代表与 CTL 组有显著性差异。2 结果与分析2 1 2M-118 对小鼠的致呕吐和致热毒性给药2M-118 后，每日观察小鼠的生存状态并记录。经观察，腹腔注射与灌胃两种给药方式下，实验组小鼠毛色均正常顺滑，行动活泼，采食饮水正常，未出现死亡和呕吐症状;且各组小鼠体质量均有所增加 图 2(a)，尤其灌胃2M-118 显著提高小鼠体质量。小鼠体温变化如图2(b)所示，给药后均未见高热反应。体质量/g20222426288111417202326MHMMMLMgCTL时间/d8111417202326时间/d3738394041体温/MHMMMLMgCTL(a)体质量(b)体温CTL，正常组;ML、MM、MH 分别为腹腔注射给药低、中、高剂量组;Mg，灌胃给药组。图 22M-118 对小鼠体质重(a)与体温(b)的影响2 22M-118 对脾淋巴细胞增殖的影响各组脾淋巴细胞增殖情况如图 3 所示。与正常组相比，2M-118 可刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，但不同剂量组之间并未呈明显的量效关系。脾细胞增殖率/%051015CTLMLMMMHCTL，正常组;ML、MM、MH 分别为腹腔注射给药低、中、高剂量组;与 CTL 组相比P 0 000 1。图 32M-118 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响2 32M-118 对脾淋巴细胞因子表达水平的影响用 ELISA 法检测各组小鼠脾组织中淋巴细胞因子的表达情况(图 4)。腹腔注射和灌胃 2M-118 均能使小鼠脾组织中 IFN-、TNF-和 IL-2 的表达量增加，尤其是腹腔注射各剂量组 IFN-、TNF-和 IL-2 的表达与 CTL 组比较均有显著性差异;灌胃给药组 IFN-的表达虽有所增加但差异不明显，TNF-和 IL-2 的表达也不及注射组明显。421潘梦等:金葡素 SEC2 改构蛋白 2M-118 对小鼠的致呕吐、致热毒性和免疫原性作用2023 年第 2 期浓度/（pg mL-1）0102030CTLMLMMMHMgCTLMLMMMHMg浓度/（pg mL-1）01015520(a)IFN-(b)TNF-浓度/（pg mL-1）010155CTLMLMMMHMg(c)IL-2CTL，正常组;ML、MM、MH 分别为腹腔注射给药低、中、高剂量组;Mg，灌胃给药组;与 CTL 组相比，*P 0 05，P 0 000 5，P 0 000 1。图 42M-118 对小鼠脾淋巴细胞因子表达的影响2 4 小鼠血清中 2M-118 的浓度及中和抗体含量ELISA 法检测小鼠血清中 2M-118 的含量(图 5)。腹腔注射组在给药后 0 5 h 血药浓度即达到2000 ngmL1，2 h 后血药浓度降低到 100 ngmL1;灌胃给药组在小鼠给药 0 5 h 后未检测到其血药浓度，2 h 后血药浓度为 650 pgmL1。以上结果表明，小鼠注射给药的血药浓度很快升高但药物作用维持时间较短;而灌胃给药的药物吸收入血时间相对较长，血药浓度水平较低。浓度/（ng mL-1）01000200030002h0.5hMLMMMHMg0.5h 2h10008006004002000浓度/（pg mL-1）(a)ML、MM、MH 分别为腹腔注射给药低、中、高剂量组(b)灌胃给药组图 5小鼠血清中 2M-118 的浓度图 6 为腹腔注射和灌胃给药各组小鼠血清中均检测到中和抗体，但其产生量未见明显差异，表明 2M-118 在血药浓度较低的情况下也能刺激机体免疫应答，并产生中和抗体。521第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报浓度/（ng mL-1）010155CTLMLMMMHMg20CTL，正常组;ML、MM、MH 分别为腹腔注射给药低、中、高剂量组;Mg，灌胃给药组;与 CTL 组相比，P 0 000 1。图 6小鼠血清中 2M-118 中和抗体浓度3 讨论通过以上体内外实验研究 2M-118 对小鼠的致呕吐和致热毒性作用。结果表明，不同给药方式、不同剂量的2M-118 均未导致小鼠呕吐或体温升高。药物干预后，小鼠脾组织中淋巴细胞因子 TNF-、IFN-和IL-2 等表达显著升高，提示 2M-118 促进小鼠脾淋巴细胞增殖，激发机体免疫应答并产生一定量的中和抗体。SEC2 突变体 2M-118(H118A/T20L/G22E)的开发旨在通过对野生型 SEC2 第 118 位氨基酸残基的替换降低其致呕吐毒性和致热毒性;通过对其第 20 位和 22 位氨基酸残基的替换以促进 SEC2 的超抗原性，即与 TCR 和 MHC 蛋白复合体结合以增强其对外来刺激的免疫反应能力。天津药物研究院新药评价有限公司的相关研究也证明了这一结果13 359。小鼠经注射给药 2M-118 后血药浓度下降较快，提示注射 2M-118 的体内作用时间较短。小鼠经灌胃给药(2 5 mgkg1)2 h 后 2M-118 血药浓度达到 600 pgmL1以上，灌胃给药的起效时间和药物浓度均不及注射给药。腹腔注射和灌胃给药均使得小鼠产生一定量的中和抗体，其中和抗体产生量与给药方式和给药剂量未见明显相关性，表明 2M-118 在血药浓度较低的情况下也能刺激机体免疫应答，这在一定程度上也反映了超抗原以极低剂量具有强大免疫活性的特点。2M-118 虽然是金葡素超抗原突变体，但其仍然具有普通抗原所具有的特性15。2M-118 仍可刺激免疫系统，多次免疫后可以使适应性免疫系统在短时间内产生抗体 IgG 等来中和抗原。而这种超抗原与普通异体抗原的最大区别在于其以极低剂量就可以刺激大量的淋巴细胞活化和增殖16 17。如上述结果显示，2M-118 可以促进脾淋巴细胞增殖，且促进脾淋巴细胞因子 IFN-、TNF-和 IL-2 等的表达。但以上结果均与 2M-118 的给药剂量相关性不显著，可能归因于 2M-118 的超抗原活性较强，实验中药物浓度梯度设计不足以表现出明显的量效关系;此外，也可能是由于啮齿类实验动物对药物剂量反应敏感性不强，不同物种对于 SEs 超抗原的敏感性不同，对于 SEC2 毒性耐受产生的免疫反应也有较大差异18。啮齿类动物对 SE 的敏感性是最低的，且越是高级的哺乳动物对 SE 的敏感性越高，如狗、牛、猪、猴、猩猩和人类对 SE的敏感性有明显的提升13 359。例如，在口服给药条件下，猪尾猴的 SEC 口服中毒剂量大于或等于10 gkg1;而猩猩的 SEC 口服中毒剂量大于或等于 2 05 gkg1，其敏感性是猴子的 5 10 倍19。而猩猩是比猴子更高级的灵长类动物，人是与猩猩更为相似的灵长类，所以有学者推断人的口服中毒剂量(人体质量以 50 kg 来计算)可能大于或等于 2 gkg1 20。由此引申出一个问题:与人类相差甚远的啮齿类等动物对 SEC2 敏感度实验所得的毒性结果是否可以代表 SEC2 相关药物对人类临床具有可用性?因而需要开展更高级实验动物(如恒河猴等)的毒性研究。此外，由于不同给药途径使得药物在机体内的血药浓度不同，注射给药的血药浓度比灌胃给药方式的血药浓度高，因此，注射 2M-118 能更明显促进脾组织中 IFN-、TNF-和 IL-2 等细胞因子的表达。虽然灌621潘梦等:金葡素 SEC2 改构蛋白 2M-118 对小鼠的致呕吐、致热毒性和免疫原性作用2023 年第 2 期胃 2M-118 血药浓度极低，但依然刺激机体产生抗体。无论哪种给药方式，机体对外来刺激都做出免疫应答，因此表明 2M-118 仍具有超抗原特性。4 结论通过离体和在体实验探究 2M-118 对小鼠的致呕吐、致热毒性和免疫原性作用。2M-118 并未致小鼠呕吐或体温升高，可刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，促进脾组织中 IFN-、TNF-和 IL-2 等细胞因子的表达，并产生一定量的中和抗体，改构蛋白 2M-118 仍具有超抗原特性且具有低免疫毒性。本研究为进一步探究金葡素 SEC2 改构蛋白 2M-118 的免疫活性及临床指导用药奠定了一定的基础。参考文献:1杨斌 超抗原疫苗对移植重建小鼠乳腺肿瘤的干预作用研究 D 沈阳:沈阳农业大学，2018 2胡风庆，彭雪 金黄色葡萄球菌超抗原肠毒素临床应用研究进展 J 微生物学杂志，2016(5):1 3付煊赫 肠毒素 SEC2 非 MHC 依赖型突变体激活小鼠 T 淋巴细胞信号机制的研究 D 沈阳:沈阳药科大学，2018 4ZHANG G J，XU M K，ZHANG H W，et al Up-regulation of granzyme B and perforin by staphylococcal enterotoxin C2 mutantinduces 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Changchun City，Changchun 130052，China;4 Shenyang Xiehe Biopharmaceutical Co Ltd，Shenyang 130052，China)Abstract:To explore the effects of SEC2(Staphylococcal enterotoxins C 2)modified protein 2M-118 on vomiting，heat toxicityand immunogenicity in mice，BALB/c mice were randomly divided into control group，2M-118 intraperitoneal administration groupsand gavage administration group，with 10 mice in each group The toxicogenic immunogenicity of 2M-118 was evaluated by measuringthe body weight and body temperature of mice That whether 2M-118 can stimulate lymphocyte proliferation of mouse in vitro and pro-duce neutralizing antibodies against 2M-118 antigen was verified The serum production of neutralizing antibodies was measured byELISA after the administration of 2M-118 The results showed that 2M-118 does not induce vomiting or increase body temperature inmice Meanwhile 2M-118 stimulates the proliferation of spleen lymphocytes in mice and enhances the expression of cytokines such asIFN-，TNF-and IL-2 in spleen tissue，and stimulates the body to produce neutralizing antibodies against 2M-118Keywords:SEC2;2M-118;cytokines;immunogenicity(上接第 114 页)19WINKLER M Aggregation vs global diffusive behavior in the higher-dimensional Keller-Segel model J Journal of differentialequations，2010(12):2893 20LADYENSKAJA O A，SOLONNIKOV V A，URALCEVA N N Linear and quasi-linear equations of parabolic type M Prov-idence，Rhode Island:American mathematical society，1988:585 21杨阶慧，蒋敏 一类分数阶伪抛物方程解的存在性和唯一性 J 海南热带海洋学院学报，2022(2):60(责任编辑:吴炎)Global Boundedness of the Quasilinear Chemotaxis Model with IndirectSignals and Logical SourcesJIANG Liqing，JIANG Min(School of Data Science and Information Engineering，Guizhou Minzu University，Guiyang 550025，China)Abstract:For a class of quasilinear chemotaxis models with indirect signals and logical sources，the solution isglobally bounded using Youngs inequality，Gagliardo-Nirenberg inequality，Neumann thermal semigroup estimationand constant commutation method when the initial data，diffusion coefficient，chemotaxis sensitivity and logicalsource satisfy the relevant conditionsKeywords:chemotaxis model;indirect signal;logical source;global boundedness821