巨大芽孢杆菌表达系统研究进展综述_姚婉议.pdf

48科技视界Science&Technology VisionD科普综述Overview of Popular Science引言蛋白质是重要的生物大分子，蛋白质种类繁多，功能各异。生物体内的许多蛋白质的含量都非常少，为了大量获得具有某种特定用途的蛋白质，可以通过基因克隆将目的蛋白的核酸序列导入某种宿主细胞中，使宿主细胞大量合成该种蛋白质。这种将基因与合适质粒载体重组后转入宿主细胞以大量合成蛋白质的技术称为蛋白质表达。蛋白质表达在生物技术、食品、医药卫生、养殖和环保等行业均有广泛的应用。蛋白质表达技术所涉及的各个要素（表达载体、宿主、启动子和信号肽等）可以统称为蛋白质表达系统。蛋白质表达系统的常用表达宿主包括属于真核生物的酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞以及属于原核生物的大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。其中大肠杆菌是被研究最早、最深入、应用最广的。巨大芽孢杆菌作为革兰氏阳性杆菌，其无内毒素和胞外蛋白酶，能高效地将蛋白质分泌到胞外，在蛋白表达方面具有较大的优势。本文介绍了巨大芽孢杆菌的生理特征和表达系统各关键元素的研究现状，为进一步开展巨大芽孢杆菌表达系统及其应用的研究提供参考。一、巨大芽孢杆菌概述巨大芽孢杆菌（Priestia megaterium）是革兰氏阳性杆菌，属于需氧芽孢杆菌。如图 1 所示，它的体积约是大肠杆菌的 100 倍，由此在 1884 年被命名为巨大芽孢杆菌1。它广泛存在于植物、土壤、海水和人类口腔等各种环境中2。它可以利用的碳源包括单糖、二糖、多糖、甘油以及甘蔗糖蜜等，基于其体积大、高渗透耐受性、可适应多种环境和利用多种碳源的特点，巨大芽孢杆菌可作为蛋白质和细胞各组成部分的生产宿主或载体3。巨大芽孢杆菌是革兰氏阳性杆菌，缺乏外细胞膜，则巨大芽孢杆菌表达系统研究进展综述姚婉议刘 欣杨晓雯林伯坤*邹堂斌*（广东医科大学公共卫生学院东莞市环境医学重点实验室,广东东莞523808）【摘要】蛋白质表达系统是大量制备目的蛋白质的主要技术手段。巨大芽孢杆菌不产生内毒素和胞外蛋白酶，能高效地分泌蛋白质到胞外，具有体积大、高渗透耐受性、环境适应性强、可利用多种碳源以及可以稳定地维持各种质粒载体等特点，是理想的蛋白质表达系统宿主，目前已得到较系统地开发，用于生产重组蛋白质以及其他大分子和小分子。文章具体介绍了巨大芽孢杆菌的生理特征，综述了巨大芽孢杆菌表达系统各关键元素（表达载体、宿主、启动子和信号肽等）的研究进展，为进一步开展巨大芽孢杆菌表达系统及其应用的研究提供参考。【关键词】巨大芽孢杆菌；研究进展；表达系统；载体；启动子；信号肽基金项目：广东省扬帆计划（4YF16003G）；广东省区域联合基金（2019A1515110994）。作者简介：姚婉议，硕士研究生，研究方向为卫生微生物学。*通信作者：林伯坤、邹堂斌。23年04期.indd 4823年04期.indd 482023/5/4 15:52:162023/5/4 15:52:1649科技视界Science&Technology VisionD科普综述Overview of Popular Science其分泌的蛋白质较易分泌到胞外。巨大芽孢杆菌主要通过两个途径分泌蛋白质，分别是 SEC 途径和 TAT 途径（双精氨酸转运系统）。SEC 途径是以 SecY 通道与驱动伴侣相关联后开始运输，再与翻译核糖体结合后同时进行翻译和易位，然后 SecA ATP 酶通过水解 ATP 酶运输多肽至胞外；TAT 途径则是以全折叠的活性构象转运已结合辅助因子的蛋白质4。巨大芽孢杆菌并无碱性蛋白酶，因此有利于异源蛋白质的稳定表达和积累。图 1巨大芽孢杆菌的电子显微镜图像 二、巨大芽孢杆菌表达系统2.1表达宿主巨大芽孢杆菌表达系统的常用宿主菌株有 DSM319、MS941、WH320、WH323、YYBm1、QM B1551 和PV361，目前 MS941、YYBm1 和 WH320 菌株被广泛应用于蛋白的表达。菌株 DSM319 是无质粒菌株，有很大潜力成为理想的表达蛋白的受体菌株5；菌株 MS941 区别于 DSM319 的特点在于没有胞外蛋白酶 nprM，基于该菌株相较于 DSM319 可更高效地表达异源蛋白；菌株WH320、WH323 和 YYBm1 作为宿主在表达异源蛋白的过程中有一定的受限，即菌株 WH320 需在特定的条件下补给半乳糖苷酶，菌株 WH323 和 YYBm1 则在木糖诱导启动子系统存在限速阶段；菌株 QM B1551 和其衍生的PV361 也适合作为表达宿主，前者的质粒处于稳态，后者与菌株 DSM319 同为无质粒菌株6。2.2载体表达载体主要是 pWH1520，它是由芽孢杆菌质粒pBC16 和大肠杆菌质粒 PBR322 两者构成的穿梭质粒，目前已成功用于巨大芽孢杆菌重组表达原核和真核蛋白。目前可通过在载体 pWH1520 中插入、替换、敲除元件或定点诱变得到新的载体，从而增加表达载体的数量，例如 pMM1520、pMM1522、pMM1525、pADBm20 等 载体，不同于前面的载体，pWH32 是由化学品甲基乙基砜（C3H8O2S）诱变得到的载体，而由于缺乏相关的酶，在选择 pWH32 作为载体时不能选择木糖作为碳源7。2.3启动子巨大芽孢杆菌表达系统的启动子主要有诱导型启动子、噬菌体 RNA 聚合酶驱动的启动子和其他启动子；重组蛋白和多亚单位蛋白复合物的高水平生产需要诱导型启动子来调节，主要有木糖和蔗糖诱导型启动子。2.3.1诱导型启动子系统（1）木糖诱导型启动子系统如图 2 所示，该启动子系统有两个调节方向，一个主要由 XylR（木糖阻遏物）、PxylA（启动子）和 XylA（木糖异构酶）组成，另一个由分解代谢物阻遏蛋白 CcpA 介导8。操纵子由不同种类的木糖酶XylA、XylB和XylT组成，是否添加木糖直接影响重组蛋白的表达。（2）蔗糖诱导型启动子系统该启动子系统主要由启动子PsacB和SacB基因组成。目前，蔗糖诱导表达主要用于以下两种酶，LB 培养基中的蔗糖量的多少对果聚糖聚合酶（SacB）的分泌有不同的影响；蔗糖诱导的绿色荧光蛋白（GFP）的表达量明显低于木糖诱导表达量，但是蔗糖诱导表达系统即使没有诱导物诱导仍能产生 GFP9。可见该系统可适应于更多不同环境，未来有一定的应用前景。23年04期.indd 4923年04期.indd 492023/5/4 15:52:182023/5/4 15:52:1850科技视界Science&Technology VisionD科普综述Overview of Popular Science2.3.2噬菌体 RNA 聚合酶驱动的启动子1984 年，首先使用该启动子的细菌表达系统是基于噬菌体 T7 的 RNA 聚合酶（T7 RNAP）、启动子 PT7 和终止子形成的10。有研究将 T7 RNAP 和其噬菌体的 RNA聚合酶基因克隆到 pBC16-PBR322 穿梭质粒中，该启动子的基因表达虽受木糖诱导启动子控制，但噬菌体依赖型启动子表达蛋白的量仍低于木糖启动子系统，研究表明这两种系统可以互相融合，用于巨大芽孢杆菌表达蛋白具有较大前景。2.3.3其他启动子除了上述的 3 种类型启动子，还有淀粉诱导型启动子PamyL，其与木糖诱导启动子的蛋白表达量和表达效率相差不大。此外，Meinhardt 等人从巨大芽孢杆菌 M1286分离出强表达的 gdhA 启动子，其蛋白表达效率与来自革兰氏阴性大肠杆菌的启动子相近11。2.4信号肽信号肽是指位于分泌蛋白质氮末端可以引导蛋白穿过细胞膜的一段氨基酸序列。信号肽一般由 5 40 个左右的氨基酸残基构成，主要包括氨基端区、疏水端区和羧基端 3 个区域。巨大芽孢杆菌用于异源蛋白的胞外分泌的信号肽包括来自脂肪酶 A、青霉素 G 酰胺酶、左聚蔗糖酶、中性蛋白酶、细胞外蛋白酶的信号肽以及人工信号肽。当巨大芽孢杆菌中青霉素 G 酰胺酶的天然信号肽被替换成脂肪酶 A 的信号肽 SPLipA 时，蛋白分泌会增强12。信号肽SPLipA 是目前在巨大芽孢杆菌表达系统中应用最为广泛的信号肽，与青霉素酰化酶原始信号肽相比能生产更多的青霉素酰化酶。此外，信号肽 SPLipA 也已成功应用于罗伊氏乳杆菌的蔗糖 6-果糖基转移酶和褐藻胶水解酶的异源表达。图 2木糖启动子系统示意图23年04期.indd 5023年04期.indd 502023/5/4 15:52:182023/5/4 15:52:1851科技视界Science&Technology VisionD科普综述Overview of Popular Science 参考文献1Vary PS，Biedendieck R，Fuerch T，et al.Bacillus megaterium-from simple soil bacterium to industrial protein production hostJ.Appl Microbiol Biotechnol，2007，76（5）：957-967.2Dobrzanski T，Gravina F，Steckling B，et al.Bacillus megaterium strains derived from water and soil exhibit differential responses to the herbicide mesotrioneJ.PLoS One，2018，13（4）：e0196166.3McCool GJ，Cannon MC.PhaC and PhaR are required for polyhydroxyalkanoic acid synthase activity in Bacillus megateriumJ.J Bacteriol，2001，183（14）：4235-4243.4Rapoport TA，Li L，Park E.Structural and Mechanistic Insights into Protein TranslocationJ.Annu Rev Cell Dev Biol，2017（33）：369-390.5 周潮洋，易忠权，裴涛，等.巨大芽胞杆菌：一个大型微生物细胞工厂 J.氨基酸和生物资源，2014，36（3）：7-11.6Malten M，Hollmann R，Deckwer WD，et al.Production and secretion of recombinant Leuconostoc mesenteroides dextransucrase DsrS in Bacillus megateriumJ.Biotechnol Bioeng，2005，89（2）：206-218.7Malten M，Biedendieck R，Gamer M，et al.A Bacillus megaterium plasmid system for the production，export，and one-step purification of affinity-tagged heterologous levansucrase from growth mediumJ.Appl Environ Microbiol，2006，72（2）：1677-1679.8Biedendieck R.A Bacillus megaterium System for the Production of Recombinant Proteins and Protein ComplexesJ.Adv Exp Med Biol，2016（896）：97-113.9Biedendieck R，Gamer M，Jaensch L，et al.A sucrose-inducible promoter system for the intra-and extracellular protein production in Bacillus megateriumJ.J Biotechnol，2007，132（4）：426-430.10Bumchen，C，Roth，A，Biedendieck，R，et al.D-mannitol production by resting state whole cell biotrans-formation of D-fructose by heterologous mannitol and formate dehydrogenase gene expression in Bacillus megateriumJ.Biotechnology journal，2007，2（11）：1408-1416.11Meinhardt，F，Stahl U，Ebeling W.Highly efficient expression of homologous and heterologous genes in Bacillus megateriumJ.Appl Microbiol Biotechnol，1989（30）：343350.12Dols M，Simeon MR，Willemot RM，et al.Structural characterization of the maltose acceptor-products synthesized by Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299 dextransucraseJ.Carbohydr Res，1997，305（3-4）：549-559.三、展望巨大芽孢杆菌具有适合表达蛋白的很多优点，已得到系统开发，用于生产重组蛋白和其他化合物，包括多羟基丁酸酯、丙酮酸、维生素 B12、杀菌毒素、聚羟基丁酸酯、青霉素酰化酶、淀粉酶、葡萄糖脱氢酶、角蛋白酶、木聚糖酶等。目前，应用巨大芽孢杆菌生产重组蛋白可达到 g/L 的水平，将来要结合生信和各组学手段，从整体上优化巨大芽孢杆菌的新陈代谢途径，获取更有利于异源蛋白表达的巨大芽孢杆菌，进一步从各种途径中筛选适用于巨大芽孢杆菌的强力启动子和信号肽，从而获得蛋白产量更高、表达更稳定、性质更优的表达系统，由此推动巨大芽孢杆菌在生物医药和其他工业中得到更广泛的应用。23年04期.indd 5123年04期.indd 512023/5/4 15:52:202023/5/4 15:52:20