具核梭杆菌CarRS双组分...的表达、纯化及生化活性测定_李竺婷.pdf

李竺婷 等/具核梭杆菌 CarRS 双组分系统组氨酸激酶 CarS 的表达、纯化及生化活性测定 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1596-1608 DOI:10.13345/j.cjb.220779 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目：辽宁省自然科学基金民族创新联合基金(2020-MZLH-07)This work was supported by the Innovation Joint Fund of Natural Science Foundation of Liaoning Province(2020-MZLH-07).*Corresponding authors.E-mail:QUAN Chunshan,;ZHENG Wei, Received:2022-09-28;Accepted:2023-01-07 1596 生物工程学报 具核梭杆菌CarRS双组分系统组氨酸激酶CarS的表达、纯化及生化活性测定 李竺婷1,2，师舷1,2，范若辰3，王路路3，卜婷婷1,2，郑维1,2*，张旭强1,2，权春善1,2*1 大连民族大学 生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁 大连 116600 2 大连民族大学生命科学学院，辽宁 大连 116600 3 大连理工大学生物工程学院，辽宁 大连 116081 李竺婷,师舷,范若辰,王路路,卜婷婷,郑维,张旭强,权春善.具核梭杆菌 CarRS 双组分系统组氨酸激酶 CarS 的表达、纯化及生化活性测定J.生物工程学报,2023,39(4):1596-1608.LI Zhuting,SHI Xian,FAN Ruochen,WANG Lulu,BU Tingting,ZHENG Wei,ZHANG Xuqiang,QUAN Chunshan.Expression,purification,and characterization of the histidine kinase CarS from Fusobacterium nucleatumJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1596-1608.摘 要：具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)是一种条件致病菌，能够在结直肠癌组织中富集，影响结直肠癌发生发展的多个阶段。双组分系统在病原菌耐药性、致病性相关基因的调控和表达中起重要作用。本文以具核梭杆菌 CarRS 双组分系统为研究对象，重点对其组氨酸激酶蛋白CarS 进行重组表达和性质研究。利用在线软件 SMART、CCTOP 和 AlphaFold2 对 CarS 二级结构和三级结构进行预测，其结果表明 CarS 蛋白具有 2 个跨膜螺旋区，包含 9 个 螺旋和 12 个 折叠结构；由两个结构域构成，一是位于 N 末端的跨膜域(氨基酸 1170)，另一个是位于 C 末端的胞内域，胞内域由信号接收域(histidine kinases,adenylyl cyclases,methyl-accepting proteins,prokaryotic signaling proteins,HAMP)、磷酸受体结构域(histidine kinase domain,HisKA)和组氨酸激酶催化结构域(histidine kinase-like ATPase catalytic domain,HATPase_c)组成。由于全长的 CarS 蛋白未能在宿主细胞中表达，因此根据其二级、三级结构特点，构建了 CarS 胞内蛋白的融合表达载体 pET-28a(+)-MBP-TEV-CarScyto，并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 中进行过表达。经亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析，最终获得纯度较高的 CarScyto-MBP蛋白，终浓度达 20 mg/mL。活性实验结果表明，CarScyto-MBP具有蛋白激酶和磷酸转移酶双活性，麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)标签对 CarScyto蛋白的生物活性无影响。上述结果为深入解析 CarRS 双组分系统在具核梭杆菌中的生物学功能提供了一定的理论基础。关键词：具核梭杆菌；CarRS 双组分系统；蛋白激酶活性；磷酸转移酶活性 医药生物技术 李竺婷 等/具核梭杆菌 CarRS 双组分系统组氨酸激酶 CarS 的表达、纯化及生化活性测定 ：010-64807509： 1597 Expression,purification,and characterization of the histidine kinase CarS from Fusobacterium nucleatum LI Zhuting1,2,SHI Xian1,2,FAN Ruochen3,WANG Lulu3,BU Tingting1,2,ZHENG Wei1,2*,ZHANG Xuqiang1,2,QUAN Chunshan1,2*1 Key Laboratory of Biotechnology and Bioresources Utilization,Ministry of Education,Dalian Minzu University,Dalian 116600,Liaoning,China 2 School of Life Sciences,Dalian Minzu University,Dalian 116600,Liaoning,China 3 School of Bioengineering,Dalian University of Technology,Dalian 116081,Liaoning,China Abstract:Fusobacterium nucleatum is an opportunistic pathogenic bacterium that can be enriched in colorectal cancer tissues,affecting multiple stages of colorectal cancer development.The two-component system plays an important role in the regulation and expression of genes related to pathogenic resistance and pathogenicity.In this paper,we focused on the CarRS two-component system of F.nucleatum,and the histidine kinase protein CarS was recombinantly expressed and characterized.Several online software such as SMART,CCTOP and AlphaFold2 were used to predict the secondary and tertiary structure of the CarS protein.The results showed that CarS is a membrane protein with two transmembrane helices and contains 9-helices and 12-folds.CarS protein is composed of two domains,one is the N-terminal transmembrane domain(amino acids 1170),the other is the C-terminal intracellular domain.The latter is composed of a signal receiving domain(histidine kinases,adenylyl cyclases,methyl-accepting proteins,prokaryotic signaling proteins,HAMP),a phosphate receptor domain(histidine kinase domain,HisKA),and a histidine kinase catalytic domain(histidine kinase-like ATPase catalytic domain,HATPase_c).Since the full-length CarS protein could not be expressed in host cells,a fusion expression vector pET-28a(+)-MBP-TEV-CarScyto was constructed based on the characteristics of secondary and tertiary structures,and overexpressed in Escherichia coli BL21-Codonplus(DE3)RIL.CarScyto-MBP protein was purified by affinity chromatography,ion-exchange chromatography,and gel filtration chromatography with a final concentration of 20 mg/ml.CarScyto-MBP protein showed both protein kinase and phosphotransferase activities,and the MBP tag had no effect on the function of CarScyto protein.The above results provide a basis for in-depth analysis of the biological function of the CarRS two-component system in F.nucleatum.Keywords:Fusobacterium nucleatum;CarRS two-component system;kinase activity;phosphotransferase activity 致病菌在进化过程中，逐渐形成了一系列信号感应和调节网络，可以快速识别人体生态环境的变化，调控病原菌的入侵和定殖策略，突破人体的多重免疫屏障。因此，对致病菌信号通路的研究显得尤为重要。随着基因组学、蛋白质组学等多种组学技术的快速发展和对基因组序列的深入挖掘，近年在结直肠癌组织中发现了一种“肿 瘤 细 菌”具 核 梭 杆 菌(Fusobacterium nucleatum)1。具核梭杆菌最早发现于口腔中，但最近的大量研究表明具核梭杆菌是结直肠癌 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1598 发生和发展的驱动因素或致病因子。具核梭杆菌外膜上的黏附素能够促进肿瘤细胞的增殖与转移，协助肿瘤细胞抵抗抗生素，保护具核梭杆菌及附近的肿瘤细胞不被免疫细胞杀死2-3。具核梭杆菌可在结直肠癌组织中大量富集，直接影响结直肠癌进展的多个阶段。双组分系统(two-component system,TCS)存在于大多数病原细菌中，是细菌细胞非常重要的感应外界环境刺激的调控机制，被喻为细菌的“神经系统”。TCS 由组氨酸激酶(histidine kinase,HK)和相对应的应答调节蛋白(response regulator,RR)组成。当感受到胞外信号时，组氨酸激酶 C端的组氨酸残基(His)发生自磷酸化反应，并将磷酸基团转移到应答调节蛋白位于 N 端的天冬氨酸残基(Asp)上，磷酸化的 RR 可与靶基因结合并调控其转录表达。已测序的绝大多数病原细菌基因组中均可找到双组分系统。一种细菌可拥有多个不同类型的双组分系统，其组成与结构随感受的刺激信号和作用的目标基因不同而有所变化。不同细菌所持有的双组分系统数量也有所不同，其数量与基因组大小和所处生态位的多样性有 关。比 如，铜 绿 假 单 胞 菌(Pseudomonas aeruginosa)编码 60 对双组分系统；沙门氏菌编码29 对双组分系统；金黄色葡萄球菌编码 17 对双组分系统；肺炎球菌编码 13 对双组分系统4-5。尽管具核梭杆菌与结直肠癌等多种疾病有关，但对该菌双组分系统的分类及生物功能方面的研究较少。Scheible 等6研究报道 ModRS 双组分系统调控具核梭杆菌氧化应激防御途径中关键酶甲硫氨酸亚砜还原酶(methionine sulfoxide reductase,MsrAB)的表达，从而保护该菌在免疫细胞中免受氧化损伤，并通过附着和侵袭多个靶组织获得毒力。Wu 等7研究报道具核梭杆菌CarRS(car,coaggregation regulator;R,the response regulator;S,the histidine sensor kinase)双组分系统协同环境中的赖氨酸调节关键共聚集因子 RadD 的表达，从而促进种间相互作用、毒力和营养获取，帮助具核梭杆菌在口腔生物膜和口腔外部位的不利环境中生存。CarRS 双组分系统与条件致病菌铜绿假单胞菌中的 CzcRS 双组分系统同源性较高，由应答调节因子 CarR 和组氨酸激酶蛋白 CarS 两部分组成，其中 CarS 是具有双功能活性的组氨酸激酶蛋白，是 CarRS 双组分系统中的“传感器”，能够感知特定的环境刺激，自身磷酸化同时激活应答调节蛋白 CarR，进而调控靶基因的表达，产生细胞对信号的响应。本研究以 F.nucleatum ATCC 25586 为模式菌，构建表达载体 pET-28a(+)-CarS，由于 CarS蛋白在工程菌中难以表达，因此本文利用SMART、CCTOP、AlphaFold2 等软件预测 CarS二级结构域和三级结构，针对 CarS 蛋白的胞内域片段(以下简写为 CarScyto)构建携带麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)标签的表达载体 pET-28a(+)-MBP-TEV-CarScyto，经过优化标签、宿主细胞、诱导剂浓度等条件，在 E.coli BL21-CodonPlus(DE3)RIL 中过表达获得大量CarScyto-MBP蛋白。纯化得到的 CarScyto-MBP同时具有激酶活性和磷酸转移酶活性，能够发生自身磷酸化，并将磷酸基团传递到应答调节蛋白 CarR上。本文通过对组氨酸激酶蛋白 CarS 的结构及其激酶性质的研究，为深入解析其在 CarRS 双组分系统中与应答调节因子 CarR 的相互作用机制，以及 CarRS 双组分系统在具核梭杆菌中的生物学功能提供了一定的理论基础，有望发现和解决具核梭杆菌对于结直肠癌致病性的关键靶点。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂和仪器 试剂：酵母粉、蛋白胨、琼脂粉、咪唑、乙 李竺婷 等/具核梭杆菌 CarRS 双组分系统组氨酸激酶 CarS 的表达、纯化及生化活性测定 ：010-64807509： 1599 二 胺 四 乙 酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、SOC、麦芽糖、甘油、甘氨酸、考马斯亮蓝 G-250、冰醋酸、无水乙醇等均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。氯化钠购自天津科密欧化学试剂有限公司。Ni-NTA 购自GE 公 司。卡 纳 霉 素(kanamycin)、氯 霉 素(chloramphenicol)购自北京索莱宝科技有限公司。高保真预混 HS 酶、FastDigest Dpn I 购自TaKaRa 公司。仪器：紫外分光光度计岛津(上海)实验器材有限公司，UV-2700；PCR 仪美谷生物科技(浙江)有限公司；电转仪(BTX 公司，AS8)；层析分析系统(GE 公司，AKTA prime plus)。1.1.2 菌株和质粒载体 具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)菌株ATCC 25586 购 自 美 国 模 式 培 养 物 集 存 库(ATCC)；大肠杆菌(Escherichia coli)DH5、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21-CodonPlus(DE3)RIL、E.coli BL21(DE3)pLysS、E.coli C43(DE3)和质粒 pET-28a(+)均为本实验室保存。1.1.3 引物设计 本研究中 PCR扩增所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列见表 1。1.2 方法 1.2.1 组氨酸激酶蛋白CarS的二级、三级结构的预测及分析 将获得的 CarS 的氨基酸序列用 SMART、CCTOP8、HMMTOP、Octopus9、Philius10、Phobius11、Pro12、Prodiv12、ScampiMsa13、TMHMM 等软件进行分析，将胞外域、跨膜域以及胞内域的预测结果综合整理分析，再利用Protter14在线软件分析 CarS 蛋白的拓扑结构。为了能够从分子水平上更加了解蛋白质的作用机制，本文使用 AlphaFold215软件利用从头计算的方法，在原子精度内获得蛋白质的三维结构以及生物信息。1.2.2 重 组 表 达 载 体 pET-28a(+)-CarS 及pET-28a(+)-MBP-TEV-CarScyto的构建 根据 F.nucleatum ATCC 25586(AE009951.2)的 carS 基因序列信息，设计上下游引物，采用RF-cloning 法16构建重组表达载体，最终将目的基因与载体 pET-28a(+)相连，电转化转入 E.coli DH5 感受态细胞中，并涂布于含有卡纳霉素 (50 g/mL)的 LB 固体培养基上，37 培养 16 h，从固体培养基上挑取单菌落至含有卡纳霉素(50 g/mL)的 LB 液体培养基中，37、180 r/min培养 16 h。用质粒抽提试剂盒提取质粒，委托生工生物工程(上海)股份有限公司对重组质粒进行测序。1.2.3 CarS、CarScyto-MBP蛋白的诱导表达与纯化 测序确认目标基因序列后，利用化学法将重组质粒分别转入 E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL、E.coli BL21(DE3)pLysS、E.coli BL21(DE3)、E.coli C43(DE3)感受态细胞中，并涂布于含卡纳霉素(50 g/mL)和氯霉素(37 g/mL)的 LB 固体培养基上，37 培养 12 h，挑取单菌落在含双抗的 LB 液体培养基内，在 37 恒温摇床中以180 r/min 的转速培养过夜。将培养过夜的种子液按照 1%比例接种于含卡纳霉素(50 g/mL)和氯霉素(37 g/mL)的 LB液体培养基中，在 37 的条件下培养至 OD600 0.7 时，加入终浓度为 0.5 mmol/L 的异丙基-D-硫 代 半 乳 糖 苷(isopropyl-D-thiogalactoside,IPTG)诱导蛋白表达，并将培养条件调整为30，培养 8 h 后收集菌体，用重悬缓冲液 (20 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl)重悬菌体，使用超声破碎仪以 35%的功率破碎菌液，待菌液变得澄清透明后，在 4、12 000 r/min 条件下离心 30 min。ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1600 表 1 构建表达载体所用引物 Table 1 Oligonucleotides used for the construction of expression vectors Primers Sequences(53)CarS-F CAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCATGTTCTTAAAGAAGATGAATAGAC CarS-R GGAGCTCGAATTCGGATCCGCGTTATATTGGAAATCTTACAATAAAG CarScyto-F CGAGGAAAACCTGTACTTCCAATCCAATATTAAAAATGCTTTTAAACCAGTTAAAAA CarScyto-R GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCATTATATTGGAAATCTTACAATAAAGCA The underlined sequences represent homogeneous arms of target genes.、进一步对破碎后的菌液进行亲和层析纯化，取离心后的上清液转移到镍柱中，冰浴振荡孵育30 min，用 58 倍柱体积的洗涤缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT)洗涤柱子，加入 30 mL 的蛋白洗脱缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、10 mmol/L麦芽糖)，收集目的蛋白。在蛋白洗脱缓冲液中加入 70 mL离子交换层析缓冲液 QA(20 mmol/L Tris-HCl)，转移至阴离子交换层析柱，利用AKTA prime plus 蛋白层析系统对获得的蛋白进行梯度洗脱，收集出峰位置对应接收管，用超滤浓缩管对收集到的蛋白进行超滤浓缩，浓缩至 2 mL 后将蛋白加入到凝胶过滤层析柱，收集目的蛋白的组分，用超滤浓缩管对目的蛋白再次超滤浓缩，待浓缩至 500 L 左右置于80 冰箱冻存。1.2.4 CarScyto-MBP蛋白磷酸激酶活性的检测 使用 Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay Kit 试剂盒检测纯化后蛋白的激酶活性。首先配制pH 8.0的磷酸激酶缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl,5 mmol/L MgCl2)，设置无CarScyto-MBP蛋白的体系作为阴性对照，用磷酸激酶缓冲液将 CarScyto-MBP蛋白稀释至不同浓度(2,4,6,8,10 mol/L)，加入等体积的含 20 mol/L ATP 的磷酸激酶缓冲液，制备总反应体系为 50 L的磷酸激酶反应液，于 37 条件下反应 30 min，在磷酸激酶反应液中加入 50 L 发光试剂，配 制成总体积为 100 L 的反应液，于 37 孵育10 min，移至 96 孔板中，用多功能酶标仪检测反应液的发光强度。底物在蛋白激酶的作用下与 ATP 反应，磷酸化消耗 ATP，此时在体系中加入甲壳荧光素，体系中剩余的 ATP 在甲壳萤光素酶的作用下与甲壳荧光素反应生成氧化荧光素，发出荧光。通过检测体系的荧光强度来判断 ATP 的消耗量，可得知 CarScyto-MBP蛋白的激酶活性大小。1.2.5 CarScyto-MBP蛋白磷酸转移酶活性的检测 首 先 配 制 pH 8.0 的 磷 酸 激 酶 缓 冲 液 (20 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl,5 mmol/L MgCl2)，在 10 mol/L CarScyto-MBP蛋白中加入等体积的含 20 mol/L ATP 的磷酸激酶缓冲液，配制成总体积为 400 L 的磷酸激酶反应液，于37 条件下反应 30 min。用磷酸激酶缓冲液将CarR 蛋白稀释至不同浓度(5、10、15、20、25 mol/L)，加入等体积的磷酸激酶反应液，配制成总反应体积为 50 L 的反应液，于 37 条件下反应 10 min。随后加入 50 L 发光试剂，配制成总体积为 100 L 的反应液，37 孵育 10 min，将反应液移至 96 孔板中，用多功能酶标仪检测反应液的发光强度。当反应体系中存在 CarR 蛋白，CarScyto-MBP蛋白的组氨酸残基发生磷酸化消耗 ATP，随后CarScyto-MBP蛋白将磷酸基团转移到 CarR 蛋白的 李竺婷 等/具核梭杆菌 CarRS 双组分系统组氨酸激酶 CarS 的表达、纯化及生化活性测定 ：010-64807509： 1601 天冬氨酸残基使其发生磷酸化，该过程会增大ATP 的消耗量。当反应体系中 CarScyto-MBP蛋白浓度恒定，改变 CarR 蛋白浓度，通过检测反应体系中剩余 ATP 的含量来判断是否发生磷酸基团的转移，以此检测 CarScyto-MBP蛋白的磷酸转移酶活性。2 结果与分析 2.1 双组分系统的生物信息学分析 利用生物信息学方法，从 F.nucleatum ATCC 25586 全蛋白氨基酸序列中分别筛选出含HATPase_c 与 Response_reg 结构域的蛋白，经分析，得到 4 组 TCS(CarRS,ArlSR,LytSR,ModSR)。结合 NCBI 的序列比对结果，参考京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库，初步预测 F.nucleatum ATCC 25586 菌株中 4 对 TCS 的生物学功能，如表 2 所示。其中，CarRS 双组分系统与铜绿假单胞菌中的 CzcRS 双组分系统同源性较高，而铜绿假单胞菌通过 CzcRS 双组分系统调控毒力因子、生物膜的形成以及对微量金属和碳青霉烯类抗生素的耐药性，初步预测 CarRS 双组分系统在具核梭杆菌中可能具有同样重要的调控作用。2.2 CarS 蛋白二级结构预测及分析 双组分系统的组氨酸激酶一般由 N 端跨膜结构域和 C 端的胞内域构成，胞内域部分还有二聚化结构域和 ATP 结合结构域。利用 9 种在线软件(CCTOP、HMMTOP、Octopus、Philius、Phobius、Pro、Prodiv、ScampiMsa、TMHMM)预测组氨酸蛋白激酶 CarS 的二级结构，结果表明 CarS 蛋白是一个典型的膜蛋白，具有两个跨膜结构域(图 1A)。由 Protter 软件预测得到 CarS蛋白的拓扑结构(图 1B)与上述 9 个软件预测得到的结果相一致。CarS 蛋白的 N 末端和 C 末端均位于胞内，N 末端的跨膜结构域(氨基酸1170)中含有 2 个跨膜螺旋，位于 2 个跨膜螺旋之间有 1 个分子量较大的胞外环(氨基酸42148)；C 末端含有一个较大的胞内域(氨基酸171445)，胞内域中含有信号接收域 HAMP、磷酸受体结构域 HisKA 和组氨酸激酶催化结构域 HATPase_c(图 1C)。2.3 CarS 蛋白三级结构预测及分析 利用 AlphaFold2 对组氨酸激酶蛋白 CarS 进行了三级结构的预测，结果如图 2A 所示。CarS蛋白中包括 9 个 螺旋和 12 个 折叠结构，整体由 2 个结构域构成，一是位于 N 末端的跨膜域(氨基酸 1170)，另一个是位于 C 末端的胞内域(氨基酸 171445)，分别命名为 N-端区域(N-terminal region)和C-端 区 域(C-terminal region)，三级结构预测结果显示 N-端区域中含有 2 个跨膜螺旋片段(2 和 3)，与二级结构预测结果一致。表 2 Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 菌株 TCS 的功能预测 Table 2 Prediction of the functions of TCS in Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 TCS Amino acids HK/RR Identities/Similarity HK(%)/RR(%)Homologous strains Deduced function CarS-CarR 445/224 26,47 Pseudomonas aeruginosa PAO-1 Metal ion transport,biofilm formation ArlS-ArlR 427/233 36,48 Staphylococcus aureus ATCC BAA-39 Autolysis of the bacteria LytS-LytR 541/240 31,36 Staphylococcus aureus subsp.aureus CO-98 Autolysis of bacteria,biofilm activity ModS-ModR 552/260 34,33 Lactobacillus plantarum LPL-1 Against oxidative damage,virulence ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1602 图 1 组氨酸激酶蛋白 CarS 的二级结构示意图 Figure 1 The schematic of the secondary structure of the histidine kinase protein CarS.A:The transmembrane structure of CarS predicted by different online software.B:The topology of CarS predicted by the Protter program.C:The predicted secondary domain of histidine kinase protein CarS.李竺婷 等/具核梭杆菌 CarRS 双组分系统组氨酸激酶 CarS 的表达、纯化及生化活性测定 ：010-64807509： 1603 结合组氨酸激酶蛋白 CarS 及其同源蛋白的序列和结构的特点分析，N-端区域中，第 1 个和第 2 个跨膜螺旋之间有 1 个较大的胞外域结构(氨基酸 41149)，命名为胞外传感器结构域(extracellular sensor domain)，该结构域由 5 个-折叠(15)构成(图 2B)。胞内域包括 3 个区域，信号接收域 HAMP(氨基酸 171225)，磷酸受体结构域 HisKA(氨基酸 226292)，组氨酸激酶催化结构域 HATPase_c(氨基酸 336445)。其中HAMP 由 2 个-螺旋(34)组成，具有调节同型二聚体受体的磷酸化或甲基化的作用。磷酸受体结构域 HisKA 同样含有 2 个-螺旋(45)，能够接收磷酸基团。组氨酸激酶催化结构域HATPase_c 含有 4 个-螺旋(69)和 7 个-折叠(612)，该结构域能够与 ATP 结合，传递磷酸基团(图 2C)。2.4 CarScyto蛋白的表达与纯化 2.4.1 表达载体 pET-28a(+)-CarS 的构建及表达 采用 RF-cloning 法构建了 pET-28a(+)-CarS 载体，结果如图 3A 所示。将 pET-28a(+)-CarS 载体测 序验证后转化至大肠杆菌，进行蛋白表达。如图3B 所示，考察了 E.coli C43(DE3)、E.coli BL21-CodonPlus(DE3)RIL、E.coli BL21(DE3)pLysS 三种宿主细胞，但均未在目标蛋白分子量相当处得到蛋白条带。同时，也对 IPTG 浓度、表达温度、表达温度等因素进行了优化，但均未得到理想结果。图 2 CarS 蛋白三级结构预测图 Figure 2 The predicted tertiary structure of CarS.A:The overall folding of the CarS molecule is viewed along with the cartoon.The tertiary structure of CarS was predicted by AlphaFold2 protocol,the-helices and the-strands are numbered,and the terminals are labeled.The overall folding of the N-terminal domain(B)and C-terminal domain(C)in CarS.ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1604 图 3 表达载体 pET-28a(+)-CarS 的构建及 CarS 蛋白表达 Figure 3 Construction and expression of plasmid pET-28a(+)-CarS.A:Construction of plasmid pET-28a(+)-CarS.M:DL2000 marker(bp);14:Verification results of double digestion of recombinant plasmids.B:Expression of the CarS protein in different host cells.M:M5 HiClear prestained protein ladder;14:E.coli C43(DE3);58:E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL;912:E.coli BL21(DE3)pLysS.2.4.2 表达载体 pET-28a(+)-MBP-TEV-CarScyto的构建 MBP 标签可以增加目标蛋白的溶解性从而提高融合蛋白表达量，并可用 1020 mmol/L 麦芽糖在温和的条件下洗脱，得到高纯度、高浓度的目标蛋白。但由于 MBP 标签较大，可能对蛋白生物活性产生影响，因此我们将 MBP 标签融合在目标蛋白的 N 端，构建如图 4A 所示的含有TEV 酶切位点的 pET-28a(+)-MBP-TEV-CarScyto载体。采用 RF-cloning 法构建重组质粒 pET-28a(+)-MBP-TEV-CarScyto，通过 PCR 扩增进一步验证，如图 4B 泳道 2 所示，目的条带大小符合要求。重组质粒经测序和序列比对分析，证明pET-28a(+)-MBP-TEV-CarScyto载体构建成功。2.4.3 CarScyto-MBP蛋白的表达与纯化 将构建成功的 pET-28a(+)-MBP-TEV-CarScyto重组质粒通过化学转化法转至 E.coli BL21-CodonPlus(DE3)RIL 感受态细胞中，IPTG 诱导表达，破碎菌体，上清液利用 MBP 填料进行亲和层析，利用 SDS-PAGE 进行检测，结果如图4C 所示。在分子量为 75 kDa 处得到一条比较清晰的蛋白条带，大小与理论值相符。采用阴离子交换层析法对亲和层析后的 CarScyto-MBP蛋白样品进行进一步纯化，结果如图 4D 所示。峰相对应蛋白样品的 SDS-PAGE 检测结果表明，样品蛋白分子量与 CarScyto-MBP蛋白相符。收集出峰位置相对应的蛋白，浓缩，上样至凝胶过滤层析柱，结果如图 4E。在洗脱时间为 44 min 处得到一个洗脱峰，经 SDS-PAGE 检测蛋白分子量与CarScyto-MBP蛋白相符，收集该峰位置对应的蛋白，最终得到的蛋白浓度约 20 mg/mL。2.5 CarScyto-MBP蛋白磷酸激酶活性的检测 利用 Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay Kit 试剂盒