基于转录组测序分析芍药苷诱...腔黏膜上皮细胞差异表达基因_肖丽君.pdf

基金项目 国家自然科学基金(编号:8 1 9 6 0 2 0 2)贵州 省 科 技 计 划 项 目(编 号:黔 科 合 基 础-Z K2 0 2 3 一般5 3 4)作者简介 肖丽君(1 9 9 6),女,山东威海人,医师,硕士在读,研究方向:口腔黏膜疾病的防治。*通信作者 杨建堂,E-m a i l:9 4 5 8 1 0 9 3 4q q.c o m口腔生物学研究基于转录组测序分析芍药苷诱导下口腔黏膜上皮细胞差异表达基因肖丽君1 陈谦明2 吴玉琪1 杨建堂3*1.遵义医科大学口腔医学院 贵州 遵义 5 6 3 0 0 6;2.浙江大学口腔医学院 浙江 杭州 3 1 0 0 0 5;3.遵义医科大学附属口腔医院黏膜科 贵州 遵义 5 6 3 0 0 6 摘要 目的:基于转录组测序分析芍药苷调控人口腔黏膜上皮细胞基因表达的情况,分析关键基因,探讨芍药苷在口腔黏膜上皮细胞中的作用机制以及其药用价值。方法:实验分为3组,空白对照组、低浓度(5 m o l/L)和高浓度(1 0 m o l/L)芍药苷组处理口腔黏膜上皮细胞系L e u k-1,进行转录组测序分析,从而筛选出差异表达基因(D E G s),采用G O和K E G G富集分析对D E G s进行基因功能和途径注释。结果:芍药苷诱导下,L e u k-1细胞中共有1 2 1 2个显著D E G s;G O富集分析显示,D E G s显著富集在免疫反应、体液免疫应答反应、细胞因子介导的通路反应2-5 寡腺苷酸合成酶活性、丝氨酸内酞酶活性、细胞外空间、细胞外组分和内质网等功能中;K E G G通路富集显示,D E G s显著富集在单纯疱疹病毒感染、癌症通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用、人类乳头瘤病毒感染等信号通路中;采用实时荧光定量P C R技术检测了参与芍药苷诱导的L e u k-1细胞差异表达的基因,其趋势域R NA-s e q一致,可以验证R NA-s e q技术的准确性。结论:芍药苷在口腔黏膜上皮细胞中的作用主要体现在抗病毒感染、肿瘤抑制、保护上皮完整性以及免疫调节等方面。关键词 芍药苷;口腔黏膜上皮细胞;转录组测序;差异基因表达;免疫调节 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 17 6 5 1(2 0 2 3)0 60 5 2 70 7d o i 1 0.1 3 7 0 1/j.c n k i.k q y x y j.2 0 2 3.0 6.0 1 2T r a n s c r i p t o m e S e q u e n c i n g S c r e e n e d D i f f e r e n t i a l l y E x p r e s s e d G e n e s i n L e u k-1 C e l l s u n d e r P a e o n i f l o r i n C o n d i t i o n.X I-A O L i j u n1,CHEN Q i a n m i n g2,WU Y u q i1,Y ANG J i a n t a n g3*.1.S c h o o l o f S t o m a t o l o g y,Z u n y i M e d i c a l U n i-v e r s i t y,Z u n y i 5 6 3 0 0 6,C h i n a;2.S c h o o l o f S t o m a t o l o g y,Z h e j i a n g U n i v e r s i t y,H a n g z h o u 3 1 0 0 0 5,C h i n a;3.D e p a r t m e n t o f M u c o s a,H o s p i t a l o f S t o m a t o l o g y,Z u n y i M e d i c a l U n i v e r s i t y,Z u n y i 5 6 3 0 0 6,C h i n a.A b s t r a c t O b j e c t i v e:T o a n a l y z e t h e g e n e e x p r e s s i o n o f L e u k-1 c e l l s r e g u l a t e d b y p a e o n i f l o r i n b a s e d o n t r a n s c r i p-t o m e s e q u e n c i n g,t o e x c a v a t e a n d a n a l y z e k e y g e n e s,t o s t u d y t h e m e c h a n i s m o f p a e o n i f l o r i n o n L e u k-1 c e l l s,a n d t o e x p l o r e i t s m e d i c i n a l v a l u e.M e t h o d s:T r a n s c r i p t o m e a n a l y z e w e r e c a r r i e d o u t o n L e u k-1 c e l l s i n z e r o,l o w(5 m o l/L),a n d h i g h(1 0 m o l/L)c o n c e n t r a t i o n g r o u p s.A s e r i e s o f d i f f e r e n t e x p r e s s i o n g e n e s(D E G s)w e r e s c r e e n e d,a n d t h e g e n e f u n c t i o n a n d p a t h w a y s o f D E G s w e r e a n n o t a t e d b y G e n e O n t o l o g y e n r i c h m e n t a n d K E G G e n-r i c h m e n t a n a l y s i s.R e s u l t s:Am o n g 1 2 1 2 D E G s i d e n t i f i e d i n L e u k-1 c e l l s u n d e r t h e i n f l u e n c e o f p a e o n i f l o r i n,G e n e O n t o l-o g y e n r i c h m e n t a n a l y s i s r e v e a l e d s i g n i f i c a n t e n r i c h m e n t i n i mm u n e r e s p o n s e,h u m o r a l i mm u n e r e s p o n s e,c y t o k i n e-m e d i a t e d s i g n a l i n g p a t h w a y,2-5-o l i g o a d e n y l a t e s y n t h e t a s e a c t i v i t y,s e r i n e-t y p e e n d o p e p t i d a s e a c t i v i t y,e x t r a c e l l u l a r s p a c e,e x t r a-c e l l u l a r r e g i o n,e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m,a n d o t h e r p a t h w a y s.K E G G p a t h w a y s e n r i c h m e n t i n d i c a t e d t h a t D E G s w e r e s i g n i f i-c a n t l y e n r i c h e d i n H e r p e s s i m p l e x v i r u s 1 i n f e c t i o n,p a t h w a y s i n c a n c e r,c y t o k i n e-c y t o k i n e r e c e p t o r i n t e r a c t i o n,h u m a n p a p-i l l o m a v i r u s i n f e c t i o n,a n d o t h e r p a t h w a y s.R T-q P C R e x a m i n a t i o n o f D E G s c o n f i r m e d t h a t a c c u r a c y o f R N A-s e q a n a l y s i s.T h e r o l e o f p a e o n i f l o r i n w a s m a i n l y r e f l e c t e d i n a n t i v i r a l i n f e c t i o n,t u m o r i n h i b i t i o n,p r o t e c t i o n o f e p i t h e l i a l i n t e g r i t y,a n d i mm u n e r e g u l a t i o n.C o n c l u s i o n:T h e r e s u l t s o f t h i s e x p e r i m e n t p r o v i d e d a r e f e r e n c e t o f u r t h e r s t u d y t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m a n d p r o v i d e d c l u e s t o e x p l o r e t h e p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t o f o r a l m u c o s a l d i s e a s e s.K e y w o r d s p a e o n i f l o r i n;L e u k-1;t r a n s c r i p t o m e s e q u e n c i n g;d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s;i mm u n o m o d-u l a t i o n 口腔黏膜病病种繁多,大多病因不明,防治困难。目前研究表明,许多口腔黏膜疾病的发病与免疫725 口腔医学研究2 0 2 3年6月第3 9卷第6期因素有关,因此积极探索调节口腔黏膜上皮免疫功能的方法可能对口腔黏膜病的防治具有重要意义。芍药苷(p a e o n i f l o r i n,P F)是白芍总苷的主要活性成分,主要从白芍的干燥根中提取。芍药苷对黏膜具有保护作用1-4:诱导气管上皮细胞分泌-防御素抵御病原微生物入侵5;增强肠上皮细胞的紧密连接,抑制内皮细胞损伤、改善十二指肠黏膜细胞屏障,抗炎抗菌;调节肠道菌群,减轻结肠炎6-9等。但芍药苷对口腔黏膜免疫功能调节的研究较为少见。R NA-s e q是近年发 展起来的在 高通 量 平 台(I l l u m i n a)上对库进行排序用来检测样本差异基因(D E G s)表达的分子生物学工程。在本研究中,通过R NA-s e q技术比较正常口腔黏膜上皮细胞和芍药苷作用下口腔黏膜上皮细胞的基因表达差异,通过实时定量P C R(R T-q P C R)验证D E G s,根据结果进一步明确芍药苷的药用价值以及治疗口腔黏膜疾病的潜在机制。1 材料与方法1.1 材料和试剂 R PM I 1 6 4 0培养基(上海源培生物科技有限公司);胎牛血清(北京硕华佰奥生物科技有限公司);0.2 5%胰蛋白酶(G i b c o公司,美国);C C K-8(MC E,美国);芍药苷(上海毕得医药科技股份有限公司);R T-q P C R试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)。1.2 细胞培养 L e u k-1细胞系购自上海美轩生物技术 有 限 公 司,细 胞 系 用 含1 0%胎 牛 血 清 的R PM I 1 6 4 0培养基培养于3 7、5%C O2培养箱中,12 d换液,待细胞生长融合至8 0%时,用0.2 5%胰蛋白酶消化细胞,23 m i n后用完全培养基终止消化,以13的比例传代,取对数生长期的38代细胞用于实验。1.3 芍药苷对细胞活性影响 将L e u k-1细胞以31 04个细胞/孔接种于9 6孔板,培养2 4 h后加入不同浓度芍药苷(0、2.5、5、1 0、2 0、4 0、8 0 m o l/L)处理不同时间(2 4、4 8、7 2 h),每组6个复孔(去掉最大值和最小值),C C K-8法检测细胞活性,确定最佳给药 浓 度 与 时 间。细 胞 分 组 处 理 后,每 孔 加 入1 0 L C C K-8溶 液,孵 箱 孵 育2 h,酶 标 仪 波 长4 5 0 n m处检测各孔吸光度(A)值,计算细胞活性。细胞活性=(实验组A值对照组A值)1 0 0%1.4 R NA-s e q结果及数据分析 根据C C K-8检测结果确定低浓度组、高浓度组和空白对照组。为进行R NA测序分析,收集每组样本细胞(3个重复组),液氮速冻23 h后-8 0 保存,干冰送检测序分析。采用分子生物学先进设备检测R NA样品的浓度、纯度合格后,进行文库构建,使用Q-P C R方法对文库的有效浓度(2 n m o l/L)进行精准测量,保证文库质量,库检合格后将下级数据进行合并分析,用高通量平台进行测序。将得到的数据进行过滤,去除含有接头的和低质量的数据后得到高质量数据。经过测序质量控制,最终共得到6 2.2 5 G B可供分析的数据,各样品Q 3 0碱基百分比均不小于9 2.2 1%。随 后 利 用H I S AT 2系 统1 0将 数 据 与H o m o_s a p i e n s.G R C h 3 8_r e l e a s e 9 5.g e n o m e.f a基因组进行序列比对,利用S t r i n g T i e1 1将比对成功的数据进行组装,随后采用F P KM1 2作为定量指标。使用e d g e R1 3进行差异分析,筛选出差异倍数(F o l d C h a n g e)1.0且显著性差异(P0.0 5)的差异基因合集。整个分析在BMK C l o u d(www.b i o-c l o u d.n e t)上进行。1.5 差异基因功能注释和分类 对差异表达基因进行数 据 库 的 功 能 注 释,包 括 基 因 本 体 论(g e n e o n t o l o g y,GO)、真核同源群簇(c l u s t e r s o f e u K a r y-o t i c o r t h o l o g o u s g r o u p s,KOG)、京都基因与基因组百 科 全 书(K y o t o e n c y c l o p e d i a o f g e n e s a n d g e-n o m e s,K E G G)数据库进行序列比对。1.6 R T-q P C R检测数据可靠性 收集不同浓度芍药苷处理后的细胞,利用吸附柱法提取总R NA,测定R NA浓度和纯度,用反转录试剂盒将R NA反转录为c D NA,随后 按照q P C R试剂盒 将目的基因mR NA扩增,反应体系为:2 L c D NA、1 0 m o l/L上下游模板0.4 L、2C h a mQ U n i v e r s a l S Y B R q P C R M a s t e r M i x 1 0 L以及d d H2O 7.2 L;反应条件:预变性9 5 3 0 s,9 5 1 0 s、6 0 3 0 s 4 0个循环,记录循环阈值(C t值)。以GA P DH为内参,每组设置3个复孔,重复独立实验3次,用2-C t法分析基因相对表达量。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司设计合成,引物序列见表1。1.7 统计学分析 每项实验独立重复3次,每组数据均满足正 态分布,具 有方差齐性,数据结果以?xs表示,采用G r a p h P a d P r i s m 9.0.0软件进行方差检验分析,以P0.0 5为差异具有统计学意义。2 结果2.1 C C K-8法确定芍药苷作用浓度 C C K-8结果显 示,与 空 白 对 照 组 相 比,在2 4 h内 低 于1 0 m o l/L的芍药苷具有明显增强细胞活性的作用(P0.0 0 1),在4 8 h、7 2 h时,2 0 m o l/L浓度的825J o u r n a l o f O r a l S c i e n c e R e s e a r c h,J u n.2 0 2 3,V o l.3 9,N o.6 表1 基因引物序列T a b.1 G e n e p r i m e r i n f o r m a t i o n基因名称引物序列(53)长度/b pT X N I PC C C T GAAAA G G T G T A C G GA T CC C T G C A T C C AAA G C1 3 1MX 1G C C A C A G C AA C T C C A T C T C T C CAAA C C T G C G C T C T1 0 9O S A 2T C C A C G T C C T G T C T G T T T C A T CT GA G C C T T T G GA GA G C1 2 3T R I M 2 2T C C G C A T AAA C GA G G T GA T AAT T C T T C C A G G C G G T T1 3 4A R R D C 3C A C AAAA G T T A C A C A C C C A C AT TAA GA G C AA C A G C C C T C A1 2 8S P D E FA C T T C A C C T G G G G C GA T T G T GG G G C T T GA G T A G C A1 3 6K R T 7 7G G GAA G C A G G G T G GAT AAAAG G T G G GA G C A G GAA1 3 5MU C 1C G C C T G C C T GAA T C T G T G G G TT TA G G G G C T G T G G1 2 7MMP 9A C G C A GA C A T C G T C A T C C C C AG G GA C C A C AA C T C G1 5 0芍药苷对L e u k-1细胞有明显的抑制作用,相较于4 8 h、7 2 h,2 4 h时芍药苷对可明显增强L e u k-1细胞活 性。故 选 择5、1 0 m o l/L浓 度 芍 药 苷 作 用2 4 h用于后续实验(表2,图1)。表2 不同浓度芍药苷作用不同时间对L e u k-1活力影响T a b.2 A v a l u e o f P F w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s f o r L e u k-1 a c-t i v i t y d e t e c t i o n i n d i f f e r e n t t i m e p o i n t s.?xs组别2 4 h4 8 h7 2 h0 m o l/L0.5 5 80.0 1 21.4 6 30.0 4 81.1 4 40.9 1 12.5 m o l/L0.7 4 10.0 6 01.5 0 30.0 7 81.2 2 30.0 5 85 m o l/L0.7 7 80.0 3 91.5 8 90.1 0 61.2 5 30.0 6 31 0 m o l/L0.7 1 70.0 2 11.4 8 70.0 7 91.1 6 60.0 9 62 0 m o l/L0.5 6 90.0 3 41.2 3 10.0 5 50.9 4 50.0 5 14 0 m o l/L0.5 9 70.0 3 41.0 9 60.0 6 90.9 1 30.0 9 58 0 m o l/L0.5 0 10.0 2 60.7 8 80.0 6 60.4 2 50.0 8 3*P0.0 5;*P1且P v a l u e 0.0 5,R NA-s e q共检测筛选出D E G s共1 2 1 2个,其中上调基因7 0 9个,下调基因5 0 3个。2.3 对D E G s进行KOG注释分析 对转录组数据进行KOG数据库功能注释和分析,共有7 4 8条D E G s被注释到2 5种KOG分类中,有1 8 5条被注释到一般功能预测(g e n e r a l f u n c t i o n p r e d i c t i o n o n-l y);1 2 0条被注释到信号转导机制(s i g n a l t r a n s d u c-t i o n m e c h a n i s m s);6 3条被注释到翻译后修饰,蛋白质折叠和伴侣蛋白(p o s t t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n,p r o t e i n t u r n o v e r,c h a p e r o n e s)等,如图2所示。图2 芍药苷作用L e u k-1转录组KO G功能分类F i g.2 KO G f u n c t i o n a l c l a s s i f i c a t i o n s o f t h e t r a n s c r i p t o m e o f L e u k-1 i n d u c e d b y p a e o n i f l o r i n.2.4 对D E G s进行GO注释分析 对P F调控口腔黏膜上皮细胞基因表达进行的GO注释分析是一个有向无环图,包括3个分支,即生物学过程(b i o-l o g i c a l p r o c e s s,B P)、分子功能(m o l e c u l a r f u n c t i o n,MF)和细胞组分(c e l l u l a r c o m p o n e n t,C C)。上调基因 的B P主 要 聚 集 在 免 疫 反 应(i mm u n e r e-s p o n s e)、体液免疫应答反应(h u m o r a l i mm u n e r e-s p o n s e)和细胞因子介导的通路反应(c y t o k i n e-m e-d i a t e d s i g n a l i n g p a t h w a y)等;MF主要聚集在2-5寡腺苷 酸 合 成 酶 活 性(2-5-o l i g o a d e n y l a t e s y n-t h e t a s e a c t i v i t y)和丝氨酸内酞酶活性(s e r i n e-t y p e e n d o p e p t i d a s e a c t i v i t y)等;C C主要聚集在细胞外空间(e x t r a c e l l u l a r s p a c e)、细胞外组分(e x t r a c e l l u l a r r e g i o n)和内质网(e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m)等。下调基因的B P聚集在转录调控、D NA模板(r e g u l a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n,D NA-t e m p l a t e d)、骨 重 建(b o n e r e m o d e l i n g)和 组织重建(t i s s u e r e m o d e l i n g);MF主要聚集在核酸结合(n u c l e i c a c i d b i n d i n g)、金属离子结合(m e t a l i o n b i n d i n g)和离子通道抑制剂活性(i o n c h a n n e l i n h i b i t o r a c t i v i t y)等;C C主要聚集在前核糖 体(p r e r i b o s o m e)、U 1 小 核 糖 核 蛋 白(U 1 s n R N P)、核仁(n u c l e o l u s)和剪接体复合体(s p l i c e o-s o m a l c o m p l e x)等。2.5 D E G s的K E G G功能注释 K E G G富集分析结果显示,上调D E G s主要富集于单纯疱疹病毒感染(h e r p e s s i m p l e x v i r u s 1 i n f e c t i o n)、癌症通路925 口腔医学研究2 0 2 3年6月第3 9卷第6期(p a t h w a y s i n c a n c e r)、细胞因子与细胞因子受体相互作用(c y t o k i n e-c y t o k i n e r e c e p t o r i n t e r a c t i o n)、人类乳头 瘤病毒感染(h u m a n p a p i l l o m a v i r u s i n f e c-t i o n)、MA P K信 号 通 路(MA P K s i g n a l i n g p a t h-w a y)和P I 3 K-AK T信号通路(P I 3 K-A k t s i g n a l i n g p a t h w a y)等。下调D E G s主要富集于剪接体复合体(s p l i c e o s o m e)、真核生物中的核糖体生物发生(r i b o s o m e b i o g e n e s i s i n e u k a r y o t e s)、丁酸盐代谢(b u t a n o a t e m e t a b o l i s m)和脂肪酸代谢(l i p o i c a c i d m e t a b o l i s m)等。按照基因富集数量进行排序选取前5个通路,如表3、表4所示。表3 下调差异表达基因显著富集的K E G G途径T a b.3 S i g n i f i c a n t l y e n r i c h e d K E G G p a t h w a y s o f d o w n D E G s编号通路通路I DD E G s数量1单纯疱疹病毒I型感染k o 0 5 1 6 85 92剪接体复合体k o 0 3 0 4 01 43癌症途径k o 0 5 2 0 01 14真核生物核糖体生物发生k o 0 3 0 0 875丁酸盐代谢k o 0 0 6 5 056脂肪酸代谢k o 0 0 7 8 53表4 上调差异表达基因显著富集的K E G G途径T a b.4 S i g n i f i c a n t l y e n r i c h e d K E G G p a t h w a y s o f u p D E G s编号通路通路I DD E G s数量1单纯疱疹病毒感染k o 0 5 1 6 88 82癌症通路k o 0 5 2 0 03 43细胞因子与细胞因子受体相互作用k o 0 4 0 6 03 04人类乳头瘤病毒感染k o 0 5 1 6 52 45MA P K信号通路k o 0 4 0 1 02 32.6 筛选芍药苷调控L e u k-1表达的重要基因2.6.1 本实验对P F作用组和空白对照组的D E G s作功能注释对比,筛选出关键D E G s,包括8个上调基因和1个下调基因,具体信息由表5所示。2.6.2 R T-q P C R检 测P F诱导L e u k-1细胞的 关键基因的表达情况(表6)。由结果可知,筛选基因表达情况与R NA-s e q测序结果一致,即P F浓度5 m o l/L组和1 0 m o l/L组作用L e u k-1细胞较空白对照组显著增加目的基因表达量(P0.0 5)。表5 芍药苷调控L e u k-1细胞的重要基因T a b.5 I m p o r t a n t g e n e s i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f P F i n L e u k-1 c e l l s基因名称基因注释差异倍数表达K E G GT X N I P硫氧还蛋白相互作用蛋白1.6 2 2 9 1 5上调k o 0 4 6 2 1MX 1干扰素诱导的G T P结合蛋白1.1 1 2 1 1 5上调k o 0 5 1 6 0OA S 22-5 寡腺苷酸合成酶21.0 3 3 4 4 2上调k o 0 4 6 2 1T R I M 2 2三方基序2 21.0 6 3 6 3 2上调k o 0 4 1 2 1A R R D C 3抑制素结构域包含蛋白3 1.0 2 6 0 9 7上调k o 0 4 6 2 1S P D E FS AM指向结构域含有E T S转录因子1.2 1 0 4 3 1上调k o 0 4 3 6 1K R T 7 7细胞角蛋白7 71.5 4 5 9 1 5上调k o 0 4 0 1 0MU C 1粘蛋白11.3 1 6 3 3 3上调k o 0 4 6 2 1MMP 9基质金属蛋白酶9-1.3 9 2 9 9下调k o 0 1 5 2 23 讨论 芍药苷是一种单帖糖苷,是芍药的主要活性成分,具有多种药理特性。本实验通过R NA-s e q测序方法,明确芍药苷调节口腔黏膜上皮细胞基因表达,推测芍药苷的免疫调节机制,为芍药苷治疗口腔黏膜疾病提供依据。根据本实验GO富集分析显示,上调基因的B P主要聚集在免疫反应、体液免疫应答反应和细胞因子介导的通路反应等。研究发现,口腔黏膜上皮细胞被外源性病原体感染时,固有表达细胞因子和少量抗 菌 效 应 物 激 活 机 体 免 疫 反 应,发 挥 免 疫 效应1 4,由此推测当外源性病原体入侵黏膜上皮时,芍药苷可增强先天性免疫反应和获得性免疫反应,在抗菌过程中发挥重要作用。下调基因的B P聚集表6 不同浓度P F作用L e u k-1细胞基因表达水平T a b.6 G e n e e x p r e s s i o n l e v e l o f L e u k-1 c e l l s t r e a t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f P F?xsP F浓度T X N I PMX 1OA S 2T R I M 2 2A R R D C 30 m o l/L111115 m o l/L2.9 20.2 5*5.2 20.3 8*3.7 30.1 9*2.5 60.1 4*1.5 80.1 31 0 m o l/L4.7 30.2 4*7.5 70.8 2*5.0 20.3 9*2.8 40.4 8*2.4 10.1 2*续表P F浓度S P D E FK R T 7 7MU C 1MMP 90 m o l/L11115 m o l/L7.0 30.6 5*5.7 50.8 86.1 50.5 7*0.7 10.1 0*1 0 m o l/L8.4 80.7 8*2.4 20.8 5*1 1.5 51.3 1*0.7 40.0 3*注:与0 m o l/L组比较,*P0.0 5,*P0.0 1,*P0.0 0 1035J o u r n a l o f O r a l S c i e n c e R e s e a r c h,J u n.2 0 2 3,V o l.3 9,N o.6 在转录调控、D NA模板、骨重建和组织重建等,由此推测P F可通过与D NA元件相互作用参与转录过程,在转录水平上抑制基因表达,该过程则主要发生在核仁处。在MF中,上调的D E G s主要影响2-5-寡腺苷酸合成酶等抗病毒酶活性,此酶可降解病毒和宿主的R NA来对抗病毒攻击以及转移合成2-5-寡腺苷酸,激活核糖核酸酶,降解病毒R NA、抑制病毒复制。由此推测,芍药苷通过调节生物酶活性,对抗病毒等微生物感染,而此过程主要发生在细胞外空间、细胞外组分和内质网等。下调D E G s的MF则主要聚集于核酸结合、金属离子结合和离子通道抑制剂活性,研究发现肿瘤细胞往往较正常细胞更易去极化,电位调整可以使细胞在功能上正常化,预防或逆转肿瘤发生1 5,1 6,由此推测芍药苷调节金属离子活性、金属离子通道电流进而调节细胞功能,但具体金属离子通道靶点目前尚未清楚,需后续深入研究。由K E G G富集分析结果可知,上调D E G s主要富集于单纯疱疹病毒感染、癌症通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用、人类乳头瘤病毒感染等。由此推测,参与调控的信号通路主要富集于调节免疫反应以及抗病毒感染途径。进一步分析D E G s功能,显示主要集中在抗病毒感染、肿瘤抑制、保护上皮完整性以及免疫调节作用。(1)抗病毒感染:Y u等1 7研究发现P F可明显降低肺组织中甲型流感病毒的滴度,减轻肺部感染。本研究发现,P F可诱导大量抗病毒基因表达,由此推测P F具有抗病毒感染的作用。MX 1基因编码M x A蛋白,抑制负链R NA病毒的增殖1 8-2 0;抗病毒蛋白T R I M 2 2是多病毒限制因子,蛋白的任何结构域几乎都可以执行抗病毒活性,具体效应因病毒靶点而异2 1,2 2;OA S 2是胞浆双链R NA(d s R NA)的重要传感器,通过激活潜伏核糖核酸酶L(R N a s e L)阻止病毒复制,建立抗病毒状 态,限制病毒 感染2 3。综上推测,P F作用于L e u k-1细胞可诱导提高MX 1、T R I M 2 2、OA S 2等基因表达,随后经由不同作用机制激活免疫系统抵抗病毒感染。(2)肿瘤抑制:研究发现P F经由不同的分子机制发挥抗肿瘤作用4,2 4,2 5,本研究在分析D E G s时发现,P F作用L e u k-1细胞可有效提高肿瘤抑制因子的表达,提出芍药苷具有肿瘤抑制作用。T X N I P是一种-抑制素蛋白2 6,2 7,能诱导细胞凋亡2 8,2 9以及调节细胞周期3 0,因此T X N I P大量表达可抑制癌细胞的增殖和迁移3 1。A R R D C 3蛋白与-3肾上腺素能受体结合后充当衔接蛋白、调节细胞增殖,进而影响细胞表面的肾上腺素能受体和其他G蛋白耦联受体表达,因此A R R D C 3蛋白通过影响癌症进展过程中的信号传递,发挥肿瘤抑制作用3 2-3 4。S P D E F的P NT结构域与-c a t e n i n序列相结合,将-c a t e n i n从细胞周期基因的启动子区域移走,诱导肿瘤细胞静止3 5,3 6;其次,S P D E F可直接抑制肿瘤 细胞增殖所 需 的 关 键 转 录 因 子F o x m 1的表达,并减少参与细胞周期进展的多个F o x m 1靶基因的表达3 7。MM P-9是细胞外蛋白酶,可降解细胞表面蛋白和细胞外蛋白,促使上皮-间充质转化增加肿瘤的侵袭性3 8,因此抑制MM P-9活性符合抗癌治疗策略的标准3 9-4 2。在本实验中发现,P F可有效降低MMP-9的基因表达,可开发针对MMP-