微生物限度检验方法验证操作作业规程.doc

微生物限度检测办法验证操作规程1 目确认所采用办法适合于该产品微生物限度检测。2 根据中华人民共和国药典。3 范畴所有需进行微生物限度检测产品。4 责任4.1 验证小组负责检查办法验证/确认方案起草、验证/确认方案实行。4.2 验证委员会负责验证/确认方案审批，验证/确认结论审核。5 程序5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完毕后，填写确认和验证方案审批表，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组别的人员进行培训后，方可按验证方案实验。5.2 实验完毕后及时编制验证报告，并填写验证报告审批表，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实行。6 内容6.1 概述通过验证以确认所采用办法适合于该产品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数测定及控制菌检查。依照样品特性制定检查办法和检查条件，按制定方案进行实验，依照验证成果判断与否符合验证原则。若符合，按验证办法和条件进行产品微生物限度检查；若不符合，重新建立制定检查办法和检查条件，再进行验证，直至验证成果符合设立验证原则。6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数办法验证6.2.1 验证用菌株铜绿假单胞菌CMCC（B）10 104金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003枯草芽孢杆菌CMCC（B）63 501黑曲霉CMCC（F）98 003白色念珠菌CMCC（F）98 0016.2.2 验证用菌液制备6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于3035培养1824小时。取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适当浓度菌悬液，备用。6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于2025培养23天。取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适当浓度菌悬液，备用。6.2.2.3接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于2025培养57天，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨脂800.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适当办法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂800.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适当浓度孢子悬液，备用。6.2.3 供试液制备6.2.3.1 水溶性供试试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合供试品原液作为供试液。6.2.3.2 水不溶性非油脂类供试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至68。必要时，用一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。6.2.3.3 油脂类供试品 取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与至少量并能使供试品乳化无菌聚山梨酯80或其她无抑菌性无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂温度普通不超过40（特殊状况下，最多不超过45），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热稀释液使成1：10供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面活性剂稀释液进一步10倍系列稀释。6.2.3.4 肠溶制剂供试品取供试品10g，加入pH6.8无菌磷酸盐缓冲液，置45水浴中，振摇，使溶解，制成1：10供试液。必要时，用一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。6.2.4 接种和稀释按下列规定进行供试液接种和稀释，制备微生物回收实验用供试液。所加菌液体积应不超过供试液体积1。为确认供试品中微生物能被充分检出，一方面应选取最低稀释级供试液进行计数办法合用性实验。6.2.4.1 实验组 取上述制备好供试液，加入实验菌液，混匀，使每1ml供试液或每张滤膜所滤过供试液中含菌量不不不大于100cfu。 6.2.4.2供试品对照组 取制备好供试液，以稀释液代替菌液同实验组操作。6.2.4.3 菌液对照组 取不含中和剂及灭活剂相应稀释液代替供试液，按实验组操作加入实验菌液并进行微生物回收实验。若因供试品抗菌活性或溶解性较差因素导致无法选取最低稀释级供试液进行办法合用性实验时，应采用适当办法对供试液进行进一步解决。如果供试品对微生物生长抑制作用无法以其她办法消除，供试液可通过中和、稀释或薄膜过滤解决后再加入实验菌悬液进行办法合用性实验。6.2.5 抗菌活性去除或灭活供试液接种后，按下列“微生物回收”规定办法进行微生物计数。若实验组菌落数减去供试品对照组菌落数值不大于菌液对照组菌落数值50，可采用下述办法消除供试品抑菌活性。 6.2.5.1 增长稀释液或培养基体积。6.2.5.2 加入适当中和剂或灭活剂。中和剂或灭活剂（表1）可用于消除干扰物抑菌活性，最佳在稀释液或培养基灭菌前加入。若使用中和剂或灭活剂，实验中应设中和剂或灭活剂对照组，即取相应量稀释液代替供试品同实验组操作，以确认其有效性和对微生物无毒性。中和剂或灭活剂对照组菌落数与菌液对照组菌落数比值应在0.52范畴内。 表1 常用干扰物中和剂或灭活办法干扰物可选用中和剂或灭活办法戊二醛、汞制剂亚硫酸氢钠酚类、乙醇、醛类、吸附物稀释法醛类甘氨酸季铵化合物、对羟基苯甲酸、双胍类化合物卵磷脂季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸聚山梨酯水银巯基醋酸盐水银、汞化物、醛类硫代硫酸盐EDTA、喹喏酮类抗生素镁或钙离子磺胺类对氨基苯甲酸-内酰胺类抗生素-内酰胺酶6.2.5.3 采用薄膜过滤法。6.2.5.4 上述几种办法联合使用。若没有适当消除供试品抑菌活性办法，对特定实验菌回收失败，表白供试品对该实验菌具备较强抗菌活性，同步也表白供试品不易被该类微生物污染。但是，供试品也也许仅对特定实验菌株具备抑制作用，而对其她菌株没有抑制作用。因而，依照供试品须符合微生物限度原则和菌数报告规则，在不影响检查成果判断前提下，应采用能使微生物生长更高稀释级供试液进行计数办法合用性实验。若办法合用性实验符合规定，应以该稀释级供试液作为最低稀释级供试液进行供试品检查。6.2.6 供试品中微生物回收计数办法合用性实验用各实验菌应逐个进行微生物回收实验。微生物回收可采用平皿法、薄膜过滤法或MPN法。6.2.6.1 平皿法 平皿法涉及倾注法和涂布法。每株实验菌每种培养基至少制备2个平皿，从算术平均值作为计数成果。6.2.6.1.1 倾注法 取照上述“供试液制备”“接种和稀释”和“抗菌活性去除或灭活” 制备供试液1ml，置直径90mm无菌平皿可，注入1520ml温度不超过45熔化胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。若使用直径较大平皿，培养基用量应相应培养加。按表1规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各实验组平均菌落数。6.2.6.1.2 涂布法 取1520ml温度不超过45熔化胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注入直径90mm无菌平皿，凝固，制成平板，采用适当办法使培养基表面干燥。若使用直径较大平皿，培养基用量也应相应增长。每一平板表面接种上述照“供试液制备”“接种和稀释”和“抗菌活性去除或灭活” 制备供试液不少于0.1ml。按表1规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各实验组平均菌落数。6.2.6.2 薄膜过滤法 薄膜过滤法所采用滤膜孔径应不不不大于0.45m，直径普通为50mm，若采用其她直径滤膜，冲洗量应进行相应调节。供试品及其溶剂应不影响滤膜材质对微生物截留。滤器及滤膜使用前应采用适当办法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤先后完整性。水溶性供试液过滤前先将少量冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量普通为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以避免薄膜上微生物受损伤。取照上述“供试液制备”“接种和稀释”和“抗菌活性去除或灭活” 制备供试液适量（普通取相称于1g、1ml或10 cm2供试品，若供试品中所含菌数较多时，供试液可酌情减量），加至适量稀释液中，混匀，过滤。用适量冲洗液冲洗滤膜。若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。按表1规定条件培养、计数。每株实验菌每种培养基至少制备一张滤膜。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。6.2.6.3 MPN法 MPN法精密度和精确度不及薄膜过滤法和平皿法，仅在供试品需氧菌总数没有适当计数办法状况下使用，本法不合用霉菌计数。若使用MPN法，按下列环节进行。取照上述 “供试液制备”“接种和稀释”和“抗菌活性去除或灭活” 制备供试液至少3个持续稀级，每一稀释级取3份1ml分别接种至3管装有910ml胰酪大豆胨液体培养基中，同法测定菌液对照组菌数。必要时可在培养基中加入表面活性剂、中和剂或灭活剂。接种管置3035培养3天，逐日观测各管微生物生长状况。如果由于供试品因素使得成果难以判断，可将该管培养物转种至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基，在相似条件下培养12天，观测与否有微生物生长。依照微生物生长管数从表2查被测供试品每1g或1ml中需氧菌总数最也许数。表2 微生物最也许数检索表生长管数需氧菌总数最也许数95置信限每管含样品g或ml数MPN/g或ml下限上限0.10.010.001000309.400130.19.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.320111114351201143512115538130165382009.21.5352011443520220538210154382112053821227994220215402212899422235994230299942313699430023594301389104302641618131043918131175171993121203036031316030380320931836032115030380322210304003232909099033024040990331460901980332110020040003331100注：表内所列检查量如改用1g(或ml)，0.1g (或ml)和0.01g（或ml）时，表内数字应相应减少10倍；如改用0.01g（或ml）、0.001 g(或ml)和0.0001 g（或ml）时，表内数字应相应增长10倍，别的类推。6.2.7 成果判断 计数办法合用性实验中，采用平皿法或薄膜过滤法时，实验组菌落数减去供试品对照组菌落数值与菌液对照组菌落数比值在0.52范畴内；采用MPN法时，实验组菌数应在菌液对照组菌数95置信限内。若各实验菌回收实验均符合规定，照所用供试液制备办法及计数办法进行该供试品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。办法合用性确认时，若采用上述办法还存在一株或多株实验菌回收达不到规定，那么选取回收最接近规定办法和实验条件进行供试品检查。6.3 控制菌检查办法验证6.3.1验证用菌株大肠埃希菌CMCC（B）44 102金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003沙门菌CMCC(B) 50 094铜绿假单胞菌CMCC (B) 10 104白色念珠菌CMCC（F）98 0016.3.2菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，3035培养1824小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，2025培养23天，上述培养物用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液或0.9无菌氯化钠溶液制成适当浓度菌悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在28，可在24小时内使用。6.3.3 供试液制备（同6.2.3）6.3.4 验证办法6.3.4.1实验组6.3.4.1.1实验菌 依照各品种项下微生物限度原则中规定检查控制菌选取相应实验菌株，确认耐胆盐革兰阴性菌检查办法时，采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为实验菌。6.3.4.1.2常规法 取规定量供试液和不不不大于100cfu实验菌接入规定培养基中，按微生物限度检查原则操作规程中控制菌检查法进行检查。6.3.4.1.3培养基稀释法供试品有抑菌作用，放大培养基量，由于容器体积限制，普通不超过1000ml。6.3.4.1.4薄膜过滤法采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，实验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。每张滤膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上微生物受损伤。6.3.4.1.5中和法在供试品溶液中加入相应中和剂，以减除供试品中抑菌成分作用，中和剂应对微生物无毒性，与抑菌成分结合后产物应对微生物亦无毒性，或有毒性但不影响待检菌检出。6.3.4.2阳性对照组 取不不不大于100cfu实验菌接入规定培养基中，按微生物限度检查原则操作规程中控制菌检查法进行检查。6.3.4.3阴性对照组 取相应稀释液代替供试液，按微生物限度检查原则操作规程中控制菌检查法进行检查。6.3.5 成果判断在实验中，阳性对照组应检出实验菌，阴性对照组应无菌生长。若实验组检出实验菌，按此供试液制备办法和控制菌检查办法进行该供试品控制菌检查；若实验组未检出实验菌，应采用自然沉降法、培养基稀释法、薄膜过滤法、中和法等办法或联合使用这些办法消除供试品抑菌活性，并重新进行办法验证。如果通过实验确证供试品对实验菌抗菌作用无法消除，可以为受抑制微生物不易存在于该供试品中，选取抑菌成分消除相对彻底办法进行供试品检查。6.3.6验证结论应用：应按验证结论确认操作规程执行。7 有关文献7.1 微生物限度检查原则操作规程 编码：7.2 验证结论确认操作规程 编码：8 修订履历序号修订日期版本版次修 订 内 容修订者备注