间充质干细胞外泌体联合AL...轻APAP引起的肝细胞凋亡_马石楠.pdf

doi:1013819/jissn2096708X202302005引用本文格式:马石楠，郭海珍，刘婷，等间充质干细胞外泌体联合 AL15 mNA 减轻 APAP 引起的肝细胞凋亡J湖北医药学院学报，2023，42(2):137142间充质干细胞外泌体联合 AL15 mNA减轻 APAP 引起的肝细胞凋亡马石楠，郭海珍，刘婷，朱景鸣，蒋宏宽，王小莉(湖北医药学院附属太和医院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室，湖北 十堰442000)摘要 目的:探讨间充质干细胞外泌体(MSCExos)联合肝再生增强因子(AL15)mNA 对对乙酰氨基酚(APAP)诱导的肝细胞凋亡的影响。方法:通过 NAT 粒径检测、TEM 电镜检测以及 Western Blot 鉴定提取的 MSCExos。通过免疫荧光和 Western Blot 鉴定体外合成 AL15 mNA。通过荧光染色、流式细胞术和 Western Blot 检测外泌体联合 AL15 mNA 对 APAP 引起的肝细胞凋亡的影响。结果:成功分离获得了 MSCExos，并体外成功合成了 AL15 mNA。外泌体联合 AL15 mNA 可进入肝细胞，通过抑制 OS 的生成使 APAP 诱导的肝细胞凋亡减轻，且外泌体联合 AL15 mNA 比仅添加外泌体的抗凋亡效果更好。结论:MSCExos 联合 AL mNA 可通过抑制 OS 产生减轻 APAP 诱导的肝细胞凋亡，为干细胞外泌体联合 AL15 mNA 治疗 APAP 引起的肝细胞凋亡提供一个新的治疗思路。关键词 间充质干细胞外泌体;AL15;凋亡;肝细胞 基金项目 湖北省科技厅面上项目(2022CFB446);湖北省教育厅重点项目(D20222108);大学生创新创业训练项目(S202110929025)作者简介 马石楠(1983)，女，河南濮阳人，高级实验师，研究方向:干细胞与疾病治疗。通信作者 王小莉(1983)，女，湖北十堰人，博士，副教授，研究方向:干细胞治疗肝脏相关疾病。Email:Mesenchymal Stem Cell Exosomes Combined with AL15 mNA Attenuates APAPinduced Hepatocyte ApoptosisMA Shinan，GUO Haizhen，LIU Ting，ZHU Jingming，JIANG Hongkuan，WANG Xiaoli(Key Laboratory ofEmbryonic Stem Cell esearch of Hubei Province，Taihe Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan，Hubei 442000，China)Abstract:Objective To investigate the effect of mesenchymal stem cell exosomes(MSCExos)combined with Augmenterof liver regeneration(AL15)mNA on Acetaminophen(APAP)induced hepatocyte apoptosis Methods MSCExoswere characterized by NAT particle size detection，transmission electron microscopy(TEM)and Western Blot The in vitrosynthesized AL15 mNA was identified by immunofluorescence and Western Blot The effects of MSCExos combinedwith AL15 mNA on APAPinduced hepatocytes apoptosis were detected by fluorescence staining，flow cytometry andWestern Blot esult MSCExos were successfully isolated and AL15 mNA was successfully synthesized in vitro MSCExos combined with AL15 mNA could entere the APAP treated hepatocytes and significantly reduced the cell apoptosisthrough inhibiting the OS production The antiapoptosis effect of exosomes combined with AL15 mNA was better thanthat of only exosomes Conclusion The MSCExos combined with AL mNA can alleviate APAPinduced hepatocyte ap-optosis by inhibiting OS production，which provides a new therapeutic idea for the treatment of APAPinduced hepatocyteapoptosis with stem cell exosomes combined with AL15 mNAKey words:Mesenchymal stem cell exosomes;Augmenter of liver regeneration;Apoptosis;Hepatocyte对乙酰氨基酚(APAP)是一种全球常用的退热镇痛药物，在规定剂量范围内服用是比较安全的，当过量服用后，通常会引起肝细胞的凋亡坏死导致急性肝损伤，甚至急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)1。急性肝衰竭的治疗方法非常有限，肝脏移植是唯一有效的治疗方法，但由于肝脏供应不足、术731马石楠，等间充质干细胞外泌体联合 AL15 mNA 减轻 APAP 引起的肝细胞凋亡后并发症发生率高以及费用高昂而受到限制2。因此，寻找其他非手术治疗策略以提高肝损伤的治疗效果和自愈率是非常重要的。随着再生医学和干细胞技术的发展，以干细胞为基础的治疗策略将会为肝损伤引起的急性肝衰竭患者的治疗提供新的治疗手段。外泌体是由细胞分泌进入细胞外液的单层膜囊泡，它们具有类脂双分子层，膜结构直径约为 30 200 nm，含有多种生物活性物质，如转录因子、mi-NA、lncNA 和 mNA 等，外膜保护这些分子在到达受体细胞之前不被分解3。外泌体是细胞间通讯的重要手段，它们在正常或病理条件下从不同类型的细胞中释放，通过携带遗传信号影响受体细胞的生物学特性，在免疫反应、免疫调节、炎性反应和干细胞表型转化中发挥重要作用4。干细胞来源的外泌体已被证实在多种疾病的治疗中发挥重要作用，如减轻冠状动脉疾病症状、促进皮肤愈合、促进受损肝脏、肾脏和神经的修复等57。肝再生增强因子(augmenterofliverregeneration，AL)是一种调节增强因子，能促进肝脏中肝细胞的再生和 损 伤 修 复8。几 乎 所 有 器 官 中 都 含 有AL15 mNA，但其表达的蛋白质只存在于肝细胞中。这种蛋白质有两种存在形式，分子量大小分别为 22 kDa 和 15 kDa。其中小分子量形式的 AL15可以促进胞外生长因子的分泌，以保护肝细胞以及促进肝细胞的增殖与再生。当肝细胞受损时，AL在肝细胞中的表达下调，使肝脏的增殖再生能力减弱9。本研究将提取脐带间充质干细胞的外泌体，并体外合成 AL15 mNA，研究外泌体联合 AL15mNA 对 APAP 引起的肝细胞凋亡的影响，为干细胞外泌体联合 AL15 基因治疗 APAP 引起的肝细胞损伤导致的急性肝衰竭提供一个新的治疗思路。1材料和方法11主要试剂人正常肝细胞 LO2、人脐带来源间充质干细胞(hUCMSC)由胚胎干细胞研究湖北省重点实验室保存;MEM、DMEM、胎牛血清(FBS)购自 Gibco公司;对乙酰氨基酚(APAP)购自 MCE 公司;链霉素青霉素、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔或山羊抗小鼠 IgG(H+L)、胰酶、IPA 裂解液、Annexin VFITC/PI 试剂盒购自碧云天生物技术公司;VEX Ex-osome Isolation eagent、100 bp DNA ladder 购 自Vazyme 公司;MEGAscript T7 试剂盒、mNA 纯化试剂盒购自 Invitrogen 公司;TransITmNA 试剂盒购自 Mirus 公司;30Mem7G(5)ppp(5)G ACAcap analog 购自 NEB 公司;5甲基胞苷、假尿苷购自TriLink 公司;T4 DNA Ligase、质粒小提试剂盒、PC产物纯化试剂盒购自天根生化技术有限公司;AL、CD9、CD63、CD81、TSG101、Bcl2、Bax、Cleaved caspase3 抗体购自 Proteintech 公司。12实验方法121外泌体的提取hUCMSCs 添加 MEM+10%FBS+链霉素青霉素培养基，37、5%CO2培养箱培养至密度为 80%左右时，PBS 洗 3 遍，更换成用去除外泌体的 FBS 配制的培养基继续培养 24 h，48 h 收集上清。上清用 022 m 的滤膜过滤除去细胞碎片后，4、3000 r/min 离心 20 min 取上清，加入 1/3 体积的 VEX Exosome Isolation eagent 试剂颠倒混匀 4 过夜后，4、10 000 r/min 离心 30min，弃去上清。沉淀即为外泌体，加入 PBS 重悬沉淀 BCA 法测定其浓度，放入80 冰箱中保存备用。122AL15 mNA 载体的构建及体外合成 mNA的纯化LO2细胞提取 NA 反转录成 cDNA，以cDNA 为模板扩增带酶切位点的 AL15 的全长序列，AL15 的全长序列和 pcDNA34 质粒酶切后胶回收目的片段，T4 连接酶连接，转入 DH5 感受态细胞，挑单菌落通过 PC、酶切、测序鉴定。以鉴定正确 AL15 mNA 质粒为模板，Tail PC 扩增得到含有多聚 A 尾的 AL15 DNA 片段，按 MEGAscriptT7 试剂盒的说明书和前期发表文献的方法体外合成 mNA10，并利用 mNA 纯化试剂盒纯化，测定浓度后80 保存。123体外合成 AL15 mNA 的转染LO2细胞培养至70%80%汇合时，按 TransITmNA 试剂说明书步骤转染体外合成的 AL15 mNA。100 LOptiMEM 优化培养基中加入 1 g AL15 mNA，再依次加入 1 L TransITmNA 和1 L BOOST re-agent，轻轻混匀，室温放置 25 min。将混合物加入细胞培养液中，轻轻摇匀，37、5%CO2培养箱中培养。24 h 后收集细胞 Western Blot 检测 AL 的表达。124APAP 对肝细胞活力的影响将处于对数生长期 的 LO2细胞接种于 96 孔板中，每孔接种的细胞数量为 1104个，然 后 用 不 同 浓 度(0、4、8、12、16 mmol/L)的 APAP 处量 LO2细胞 24 h，加入831湖北医药学院学报(JHBUM)网址:http:/yyyxcbptcnkinet2023 年 4 月，42(2)CCK8 工作液 10 L，37 继续 孵 育 2 h，使用酶标仪于波长 450 nm 处检测各孔吸光度，实验重复 3次。125MSCExos 联合 AL15 mNA 对 APAP 引起的肝细胞凋亡的影响LO2细胞培养至密度为 70%左右时，向培养基中加入 8 mmol/L APAP 溶液处理4 h 后，分别加入 100 g/mL MSCExos 或加入 MSCExos 的同时按 TransITmNA 试剂盒说明书的步骤转染 25 mg/L AL15 mNA 后继续培养 24 h，按Annexin VFITC/PI 试剂盒说明书处理细胞，荧光显微镜拍照或流式细胞仪检测细胞凋亡。126Western BlotMSCExos 加入蛋白裂解液裂解 30 min，4、12 000 r/m 离心 10 min 收集上清。加入 SDS Loading Buffer 混匀 98 煮沸 10min，冷却后 SDSPAGE 凝胶电泳转膜，5%脱脂牛奶封闭 1 h 后分别加入按 1 1000 稀释的 CD9、CD63、CD81、TSG101，4 孵育过夜，PBS 洗 3 遍，加入辣根过氧化物酶(HP)耦联的二抗 37 孵育 1h，PBS 洗 3 遍，加入 HP 超敏化学发光试剂显色拍照。按“124”中细胞分组处理的方式处理细胞后按上述方法检测凋亡相关蛋白 Bcl2、Bax、Cleavedcaspase3 的表达。2结果21MSCExos 的提取及鉴定采用 Western Blot 检测提取的 MSCExos 中外泌体特异性标记物的表达情况，结果显示提取的MSCExos 可表达 CD9、CD63、CD81、TSG101 这些外泌体特有的分子标记物(图 1A)。利用纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)检测提取的 MSCExos 粒径大小，结果显示这些纳米颗粒的直径主要分布在 100200 nm 之间，与外泌体粒径大小相符(图 1B)。并进一步采用透射电子显微镜观察提取的 MSCExos的形态，结果如图 1C 所示，颗粒具有典型的囊膜结构。以上结果表明，已成功提取获得外泌体。注:A:Western blot 检测 MSCExos 中外泌体特异性 marker 的表达;B:透射电子显微镜检测提取的 MSCExos 的粒径;C:透射电子显微镜观察 MSCExos 的形态图 1MSCExos 的鉴定22AL15 mNA 的合成及鉴定按图 2A 所示构建体外合成 AL mNA 的质粒，测序结果如图 2B 所示，通过序列比对，结果表明已成功构建体外合成 AL mNA 的质粒。以测序正确的质粒载体为模板通过 Tail PC 添加 polyA尾，PC 产物大小与理论大小相符(图 2C)。将体外合成的 AL mNA 转染 LO2细胞，通过免疫荧光和 Western Blot 检测 AL mNA 在细胞中表达成蛋白的情况。结果显示，转染 AL mNA 的细胞荧光强度明显强于未转染的细胞(图 2D)。并且 WesternBlot 结果也表明，转染 AL mNA 的细胞 AL 蛋白的表达水平显著升高(图2E)。以上结果表明，本研究已成功通过体外合成技术制备了 AL mNA，并且其可在细胞中表达成蛋白。23外泌体联合体外合成 mNA 可转入细胞为了检测外泌体联合体外合成 mNA 能否进入细胞，将提取的 MSCExos 用 PKH67 标记，同时制备 AL mNA。将标记的 hUCMSCExos 和脂质体转染试剂包被的 AL mNA 同时加入细胞，24 h后通过免疫荧光检测其进入细胞的情况(图 3)。结果表明，MSCExos 联合体外合成 mNA 可同时进入细胞。931马石楠，等间充质干细胞外泌体联合 AL15 mNA 减轻 APAP 引起的肝细胞凋亡注:A:AL15 mNA 质粒载体的构建及体外合成的流程示意图;B:构建的 AL15 mNA 质粒测序结果;C:AL15 mNA质粒载体为模板 Tail PC 扩增产物;E:体外合成 AL15 mNA 转染肝细胞 Western blot 检测 AL15 蛋白的表达(*P0.05，P001)图 2体外合成 AL15 mNA 的合成及鉴定24外泌体联合体外合成 AL mNA 可抑制APAP 诱导的肝细胞凋亡由于过量的 APAP 处理能够诱导肝细胞损伤，首先用 CCK8 细胞增殖与活性检测试剂盒检测不同浓度的 APAP 对肝细胞活力的影响作用。本实验结果表明，APAP 能够浓度依赖性地降低肝细胞的活力(图 4A)。APAP 处理 24 h 细胞活力降为 50%的浓度为 8 mmol/L，采用此浓度用于后续实验研究。APAP 处理 LO2细胞 4 h 后，分别加入 MSCExos 或 MSCExos 联合 AL mNA 处理 24 h，通过流式和荧光显微镜检测对细胞凋亡的影响。流式检测和荧光显微镜观察结果表明，单独添加 AL m-NA 或 MSCExos 均可抑制 APAP 引起的肝细胞凋亡，但 MSCExos 联合 AL mNA 对肝细胞凋亡的抑制作用更显著(图 4B D)。Western Blot 检测凋亡相关蛋白的表达，结果表明单独添加 AL mNA或 MSCExos 均可抑制凋亡相关蛋白的表达，二者联合运用效果更显著(图 4E F)。以上结果表明，MSCExos 联合 AL mNA 对 APAP 诱导的肝细胞凋亡的抑制作用优于单独添加 AL mNA 或 MSCExos。041湖北医药学院学报(JHBUM)网址:http:/yyyxcbptcnkinet2023 年 4 月，42(2)注:A:不同浓度 APAP 对肝细胞活力的影响;B:流式检测细胞凋亡;C:统计分析细胞凋亡比例;E:Western blot 检测凋亡相关蛋白的表达;F:统计学分析凋亡相关蛋白的表达(*P005，P001)图 4外泌体联合 AL mNA 对 APAP 诱导的肝细胞凋亡的影响25外泌体联合体外合成 AL mNA 可抑制APAP 诱导的 OS 累积由于 APAP 过量可使肝细胞中产生大量的活性氧(OS)，OS 的累积会引起细胞凋亡。本研究用OS 检测试剂盒，通过流式细胞仪检测了 MSCEx-os、AL mNA 和二者联合应用对 APAP 过量引起的 OS 累计的影响。结果表明，MSCExos 和 ALmNA 均可在一定程度上减少由 APAP 过量引起的OS 的累积，且二者联合应用效果更好(图 5)。注:*P005，P001图 5外泌体联合 AL mNA 对 APAP诱导的肝细胞中 OS 累积的影响3讨论意外或服用过量的对乙酰氨基酚可引起肝细胞的凋亡、坏死，进而导致急性肝损伤，甚至急性肝衰竭11。急性肝损伤的治疗不论在国内还是国外，都是临床上极具挑战性的一个难题，不仅治疗手段欠缺，而且其病情发展迅速。如果处理不妥当，将会导致更严重的后果，比如肝衰竭和肝外器官衰竭或是转向慢性肝炎和肝硬化等12。随着现代医学的发展，通过基因治疗或细胞治疗抑制肝细胞凋亡，提高肝损伤的治疗效果正成为热点13。目前，有研究报道表明采用脐带间充质干细胞移植可有效改善肝损伤患者的肝功能，减轻其临床症状，但 MSCs 移植后的植入率很低，只有少数细胞能在指定器官定植，对疾病的干预治疗效果非常有限14。移植的干细胞主要通过旁分泌机制发挥治疗作用，外泌体在这一过程中发挥着重要作用15。使用间充质干细胞分泌的外泌体用于疾病的治疗比直接使用干细胞更具优势。纳米级外泌体比间充质干细胞小，输注后可有效地迁移到靶器官而不会停留阻滞在肺微血管中，并且使用外泌体更加安全，可避免细胞排斥的风险，且无成瘤风险16。本研究从MSCs 培养液中提取获得了外泌体，并通过粒径检测、表面 marker 的表达检测及电镜观察对其进行了鉴定。并且发现在 APAP 处理的肝细胞培养基中加入外泌体可抑制凋亡相关蛋白的表达从而减轻肝细胞的凋亡。APAP 过量引起肝损伤的过程中会产生大量的 OS，OS 的累积会引起细胞凋亡17。干细胞来源的外泌体可通过抑制 OS，减少氧化应激引起的细胞损伤凋亡18。本研究通过流式细胞仪检测 OS，发现 MSCExos 可抑制 APAP 诱导的 OS的产生。因此，MSCExos 可通过抑制 OS 的产生在 APAP 诱导的肝细胞凋亡中发挥作用。肝细胞再生增强因子也可通过清除 OS 的累积在肝细胞再生和损伤修复中发挥作用19。过量的 APAP 会引起肝细胞中 AL 表达的下调引起肝细胞凋亡，使肝脏的修复显著延迟。本研究通过体外合成 mNA 技术成功制备得到了 AL mNA，且可高效进入细胞翻译成蛋白。AL mNA 进入细胞可抑制 APAP 诱导的肝细胞凋亡相关蛋白的表达，减少细胞凋亡的数量，且可抑制 OS 累积。MSCExos 联合 AL mNA 可显著抑制 APAP 引起的肝细胞凋亡和 OS 的累积，并且效果优于单独使用 MSCExos 或 AL mNA。本研究成功提取鉴定获得了 MSCExos，采用141马石楠，等间充质干细胞外泌体联合 AL15 mNA 减轻 APAP 引起的肝细胞凋亡体外合成 mNA 技术制备并鉴定得到了 AL15mNA。MSCExos 和 MSCExos 联合 AL15 m-NA 均可通过抑制 OS 的产生减轻 APAP 诱导的肝细胞凋亡，且联合运用的效果优于单独运用。本研究将为进一步研究其体内治疗由 APAP 引起的肝损伤进而引发的肝衰竭奠定基础，也为干细胞外泌体联合基因治疗肝损伤提供一个新的治疗思路。(文中图 2D，3，4D 见封三)参考文献 1amachandran A，Jaeschke H Acetaminophen hepato-toxicity J Semin Liver Dis，2019，39(2):221234 2Olivo Liver transplantation for acute liver failure J Clin Liver Dis，2018，22(2):409417 3Zhang Y，Bi JY，Huang JY，et alExosome:A review ofits classification，isolation techniques，storage，diagnos-tic and targeted therapy applicationsJ Int J Nano-medicine，2020，15:69176934 4Whitford W，Guterstam PExosome manufacturing status J Future Med Chem，2019，11(10):12251236 5Zhang HT，Wang L，Li CY，et alExosomeinduced reg-ulation in inflammatory bowel disease J Front Immu-nol，2019，10:1464 6Shao JT，Zaro J，Shen YXAdvances in exosomebaseddrug delivery and tumor targeting:From tissue distribu-tion to intracellular fate J Int J Nanomedicine，2020，15:93559371 7Ludwig 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收稿日期20220511(本文编辑:朱佩筠)241湖北医药学院学报(JHBUM)网址:http:/yyyxcbptcnkinet2023 年 4 月，42(2)