动物性食品中磺胺类药物残留ELISA方法检测的建立-本科毕业论文.doc

本科毕业论文

动物性食品中磺胺类药物残留ELISA方法检测的建立
Establishment of ELISA Methods and Kits for Rapid detection of Sulfonamides in the food of animals

学 院：兽医学院
专 业：动植物检疫
姓 名：朱晓彤
学 号：121716570
指导教师：郝永清
职 称：教 授

完成日期：二Ο一六年五月
摘 要

磺胺类药物是一类广谱抗菌药，广泛用于预防、治疗细菌性疾病，还常作为饲料添加剂长期在动物饲养过程中使用。大量实验证明长期使用磺胺类药物不仅使人和动物产生耐药性，还会引起人过敏性反应，有致癌、致畸、致突变的作用。磺胺类药物的不合理使用已经严重危害人类健康。因此，研究出一种操作简便、快速、灵敏的磺胺类药物残留检测方法，对于畜产品的安全具有实际意义。酶联免疫吸附法(ELISA)作为一种免疫学检测技术不仅具有上述优点，而且准确性好、特异性强、检测成本低，还可用于大批量样品的检测。本文是对北京维德维康生物技术有限公司兽药残留ELISA检测方法建立及其效果进行评价和讨论。

关键词: 动物性食品 磺胺类药物 残留 检测

Abstract

Sulfonamides are antibiotics which have wide antimicrobial spectrum. They are used to prevent and cure bacterial infections.SAS are usually added into forage to feed animals. But sulfonamides can cause anaphylactic reaction and carcinogenic mutagenic teratogenic. people. sulfonamide residues for its irrational use can affect people health .Therefore, it is significant to study a method of sulfonamides detection in animal product security. Enzyme linked Immunosorbent assay(ELISA) is a convenient, fast, sensitive method,which has accurate and strong specificity . The method costs lowly and can detect a large number of samples. This article is based upon establishment and effect analysis and discussion of the ELISA for detection of veterinary drug residues by Beijing WDWK Biotechnology Co., Ltd.

Key words: Animal food; Sulfonamides; Residue; Detection

目 录

1.引言 1
1.1 磺胺类药物的结构与理化性质 1
1.2 磺胺类药物的毒性 1
1.3 磺胺类药物检测方法 2
1.3.1免疫测定方法 2
1.3.2色谱定量技术 4
1.4本文研究的目的及意义 4
2 材料与方法 5
2.1 实验材料 5
2.1.1药品 5
2.1.2试剂 5
2.1.3 仪器设备 5
2.2磺胺类药物ELISA方法的建立 6
2.2.1竞争性间接一步ELISA方法的选择 6
2.2.2单克隆抗体 6
2.2.3包被抗原稀释度、酶标记物稀释度以及抗体稀释度的确定 6
2.2.4酶标板包被条件的确定 7
2.2.6封闭时间的确定 7
2.2.7酶标记抗体反应时间的确定 7
2.2.8标准曲线的确定 7
2.2.9交叉反应率确定 7
2.2.10最低检测限的确定 8
2.2.11回收率的确定 8
3结果与分析 8
3.1实验结果 8
3.1.1包被抗原稀释度、酶标记物稀释度以及抗体稀释度的确定 8
3.1.2酶标板包被条件的确定 9
3.1.3封闭液及稀释倍数的确定 9
3.1.4封闭时间的确定 10
3.1.5酶标记抗体反应条件的确定 10
3.1.6标准曲线的确定 10
3.1.7交叉反应率的确定 11
3.1.8最低检测限的确定 12
3.1.9回收率的确定 12
4讨论 12
5.结论 12
致 谢 13
参 考 文 献 14

内蒙古农业大学学士学位论文 13

1引言
磺胺类药物（sulfonamides，SAS）是一类人工合成的广谱抗菌药品，能影响细胞核蛋白质的合成，抑制细菌的繁殖。因性质稳定、价格低廉、使用方便，被广泛用于预防和治疗细菌性疾病。SAS常配合抗菌增效剂作为饲料添加剂预防疾病的发生和促进动物生长。SAS进入动物体内后，可转移至肉、蛋、奶等动物源性食品中，过量的药物残留会对人类健康造成过敏、致癌、致畸、致突变、耐药菌株增加等危害。因此，多个国家制订了SAS限量标准，我国规定动物源性食品中SAS的最高残留限量为100μg/ml。目前，我国检测磺胺类药物残留检测的方法很多，主要包括色谱法、免疫法两大类，酶联免疫法具有特异性强，灵敏度高，成本低，操作简单、便于推广。

1.1 磺胺类药物的结构与理化性质
磺胺类药物(SAS)是一类以对氨基苯磺酰胺作为基本结构的人工合成抗菌药，磺胺类药物的骨架结构(图1)。其中，对位的两个游离氨基是抗菌活性所必需的基团。对位两个R基被别的基团取代即可得到其他磺胺类药物。当对位H离子被杂环取代，即可得到一些常用重要的磺胺类药物，例如磺胺嘧啶(SD)、磺胺对甲氧嘧啶（SMD）等。

图1 磺胺类药物基本结构

1.2 磺胺类药物的毒性
1.2.1引起毒性反应
大剂量磺胺类药物摄入会出现神经症状即急性中毒，如共济失调,麻痹，呕吐，昏迷等。长期超剂量使用磺胺类药物会出现慢性中毒，其代谢物损伤泌尿系统，出现结晶尿，蛋白尿等，抑制胃肠道菌群，引起菌群失调。

1.2.2耐药性
细菌对磺胺类药物产生耐药性与细菌产生大量磺胺类药物拮抗物对氨基苯甲酸有关。一旦产生耐药性，即使剂量增加也很难奏效，病原菌对某一种磺胺类药物产生耐药性的同时对其他磺胺类药物也易产生交叉耐药性。

1.2.3三致作用
最近很多研究表明磺胺类药物具有致畸、致癌、致突变作用，如果人们长期食用含有磺胺类药物的动物源性食品，对人类健康将造成无法估计的危害。

1.2.4过敏反应
许多研究表明，长时间食用含磺胺类药物的动物源性食品可能会引起过敏反应，引起皮肤过敏、搔痒和荨麻疹，严重的甚至引起休克和死亡。

1.2.5环境污染
磺胺类药物随着动物后排出的原药或代谢产物由于仍然具有生物效应，对周围环境构成潜在威胁。

1.3 磺胺类药物检测方法
随着科学技术的提高，检测方法越来越多，现在用的较多的是免疫筛选和色谱定量技术。

1.3.1免疫测定方法
主要有酶联免疫测定法（以酶进行标记通过与底物的显色反应来检测），放射免疫测定法（用放射性进行标记来检测），荧光免疫测定法（使用荧光或浅荧光物质作为标记物来检测）免疫亲和色谱法（以免疫结合反应原理为基础的色谱技术进行检测）广泛地应用于各种药物残留的初筛和检测。

1.3.1.1ELISA方法的原理
将可溶性的具有结合性的物质（抗原，抗体）吸附在聚苯乙烯等固相载体上，其仍然具有生物活性。进行检测时，样品中的受检物质（抗原或抗体）与固相载体上的抗体或抗原结合。通过洗板除去非结合物，再加入酶标记的抗原或抗体，此时，能固定下来的酶量与样品中被检物质的量相关。通过加入与酶反应的底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量，进行定性或定量的分析。

1.3.1.2常见竞争ELISA方法
①直接一步法：
用抗体包被酶标板，反应时样本与酶标记物（抗原和抗体特异性结合物），标准品/样本和酶标记物竞争固相抗体，洗涤除去过量酶标记物，加底物A、B液，酶催化底物显色见图2，底物降解量=待测抗原量。这种方法样本含待检药物少，和固相抗体结合的酶标抗原量多，酶催化底物显色深；样本含待检药物多，和固相抗体结合的酶标抗原量少，酶催化底物显色浅。

图2 直接一步法
②间接一步法：
用抗原包被酶标板，反应时标准品/样本与酶标记物（酶标II抗与抗体特异性结合物）和抗体反应，标准品/样本与固相抗原竞争抗体，酶标记物与抗体结合，洗涤除去过量酶标记物、标准品/样本抗原-抗体-酶复合物，加底物A、B液，酶催化底物显色（见图3），底物降解量=待测抗原量。这种检测方法样本含待检药物少，和固相抗原结合的抗体量多，酶标记物与抗体结合，酶催化底物显色深；样本含待检药物多，和固相抗原结合的抗体量少，酶标记物与抗体结合，酶催化底物显色浅。

图3 间接一步法
③间接两步法
用抗原包被酶标板，反应时加标准品/样本 + 抗体，标准品/样本、固相抗原竞争抗体，温浴30min后洗板，游离的标准品/样本-抗体复合物被洗去，加酶标记物（酶标II抗和抗体特异性结合物），酶标记物与抗体结合，洗涤除去过量酶标记物，加底物A、B液，酶催化底物显色（见图4），底物降解量=待测抗原量。样本含待检药物少，和固相抗原结合的抗体量多，酶标记物与抗体结合，酶催化底物显色深；样本含待检药物多，和固相抗原结合的抗体量少，酶标记物与抗体结合，酶催化底物显色浅。

图4 间接两步法

1.3.2色谱定量技术
主要有薄层色谱法（用溶剂混合物作为流动相在硅胶板上分离再用荧光胺喷洒采用分光光度法测定但其灵敏度低只用作筛选），气相色谱法（气相色谱法是一种经典的分析方法。）。液相色谱（高效液相色谱法是一种高效、快速的分析分离技术）。

1.4本文研究的目的及意义
在药物残留检测方面仪器分析法灵敏度高，结果可靠，但需要进行复杂的样品前处理，一次只能检测少量样品，先进的仪器设备价格都比较昂贵，而且仪器的使用必须配备专业人员或进行严格的培训，因此很难推广。而基于抗原与抗体特异性反应的免疫分析技术具有灵敏度高、快速、方便简捷的特点，尤其适宜现场筛选和大量样品快速分析。因此建立一种ELISA检测方法对磺胺类药多残留的检测有着很重要的作用。

2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1药品
磺胺类药物半抗原 购自美国sigma公司
磺胺类药物人工抗原 由北京维德维康公司原材料部提供
羊抗鼠酶标二抗 由北京维德维康公司原材料部提供
辣根过氧化物酶 购自美国sigma公司
乙腈 北京化工厂
正己烷 北京化工厂

2.1.2试剂
包被液：磷酸盐缓冲液PBS
封闭液：主要成分有脱脂奶粉，酪蛋白，Tween-20，蔗糖，牛血清
抗原稀释液：维德维康2#稀释液
抗体稀释液：维德维康3#稀释液
酶稀释液：维德维康6#稀释液
洗涤液：0.05% Tween-20的PBS磷酸盐缓冲液
底物A液：0.01 M pH 7.4 PBS磷酸盐缓冲液
底物B液：0.1 M pH 7.0 Tris-HCl溶液
终止液：2 M H2S04（22.2 ml浓硫酸缓慢加入177.8 ml蒸馏水中）

2.1.3仪器设备
96孔酶标板 德国GERENER
电子天平 METTER AE260型
酶标仪 美国Thermo
旋涡混合器 北方同正HQ-60-II
移液器 芬兰Finnpipette, 德国Eppendorf ,
德国Brand（300μL 八道移液器）
恒温培养箱 上海福玛实验设备有限公司
氮吹仪
低俗台式离心机 上海安亭科学仪器厂
SH微孔甩板脱水仪 北京富众科技有限公司
自动洗板机 北京拓普分析仪器有限公司
自动包被机 北京拓普分析仪器有限公司
枪头 美国AXYGEN
一次性医用乳胶手套 AMMEX
医用口罩 新乡市康民卫材开发有限公司

2.2磺胺类药物ELISA方法的建立
2.2.1竞争性间接一步ELISA方法的选择
由于直接法（标记抗原，与检测样品中的抗原竞争抗体）灵敏度不高，比较适合用于一种药物残留ELISA检测，对于磺胺类药物，一般选择灵敏度较高的间接法（标记抗体，固相抗原与液相抗原（样品）竞争标记抗体）。间接两步法实验过程较为繁琐，本实验采用间接一步法作为检测方法。

2.2.2单克隆抗体制备
单克隆抗体购自美国sigma公司，纯化和稀释由维德维康原材料部完成。得到最后编号为SAS160307的成品。

2.2.3包被抗原稀释度、酶标记物稀释度以及抗体稀释度的确定
维德维康公司采用的是棋盘法，具体操作如下：
（1） 抗原的包被：将稀释倍数为1:5000,1:10000,1:20000,1:40000的抗原（用2#样稀稀释）每三列一个浓度，每孔100 μl加入96孔酶标板中。置4 ℃恒温箱16 h（包被条件的优化选择见2.2.4）。
（2） 洗涤：用移液器每孔200 μl加入洗涤液，洗四次每次洗涤液浸泡10-15s，最后用甩板机甩干。
（3） 封闭：用脱脂奶粉+BSA+酪蛋白+蔗糖（4#）（选择封闭液过程见2.2.5）恒温37 ℃封闭1 h（封闭条件选择见2.2.6）。
（4） 加酶：将酶稀释为1:500,1:1000,1:2000（用6#样稀稀释），按顺序每个浓度添加一列，每孔50 μl。
（5） 加抗体：将稀释倍数为1:5000,1:10000,1:2000,1:40000的抗体（3#样稀稀释）每个浓度添加两行，每孔80 μl：放入25 ℃培养箱30 min。（酶标记抗体反应条件的确定见2.2.7）
（6） 洗涤：用移液器每孔200 μl加入洗涤液，洗四次每次洗涤液浸泡10-15 s，最后用甩板机甩干。
（7） 显色：将底物A液，底物B液按1:1混合（现用现配），每孔添加100μL，反应15-20 min。
（8）终止：每孔加入50μL的终止液，反应10 s。
（9）测OD值：在五分钟内测其OD值。

2.2.4酶标板包被条件的确定
用确定下来的抗原浓度包板，包被条件最常见的为37 ℃ 2 h和4 ℃ 16 h两种。一般认为16h条件下包被的抗原更加稳定，但这种方法耗时稍长，所以根据不同项目应进行条件的比较，根据所得OD值选择最佳包被条件。

2.2.5封闭液及稀释倍数的确定
维德维康封闭液分为5%脱脂奶粉(1#)，脱脂奶粉+BSA+酪蛋白(2#），脱脂奶粉+BSA+ Tween-20（3#）,脱脂奶粉+BSA+酪蛋白+蔗糖（4#），脱脂奶粉+BSA+酪蛋白+蔗糖+ Tween-20（5#）这五种。因为抗原不同，每种兽药残留检测试剂盒所用封闭液也不同。为了选择最合适的封闭液，要做封闭液种类及稀释度选择试验。根据OD值选择最佳封闭液种类及稀释倍数。

2.2.6封闭时间的确定
封闭液封闭时间一般分为37℃ 1 h和25℃ 2 h, 为了确定这两种封闭条件哪种更适合磺胺类药物，需要进行试验，根据测定的OD值进行选择。

2.2.7酶标记抗体反应条件的确定
在25℃ 30 min，25℃ 1 h，37℃ 30 min ，37℃ 1 h四个反应条件中根据其OD值选择最佳反应时间。

2.2.8标准曲线的确定
维德维康公司标准曲线的确定采用六点法，即稀释六个梯度的抗体测其OD值。根据公司要求零标OD值控制在1.6-2.0，第一抑制率在60%-90%，曲线相关系数控制在0.99以上，拐点数为2即为合格。

2.2.9交叉反应率确定
磺胺类药物是一类含有对氨基苯磺酰胺作为基本结构的药物，许多药物之间结构和特性相似，因此需要测其交叉反应率。交叉反应率是指已建立的标准曲线的IC50（抑制率为50%时所对应的药物浓度）与待测物的结构类似物、代谢物IC50的比值×100%。

2.2.10最低检测限的确定
根据标准曲线得到的IC50（抑制率为50%时所对应的药物浓度）来确定最低检测限。IC50附近，曲线梯度变化明显在这个梯度内OD值是稳定的检测最准确。
2.2.11回收率的确定
回收率是指所能检测出的添加药物的量与实际添加量的比值乘以100%。回收率可以很好的反映试剂盒的特异性和灵敏度，回收率偏高说明特异性不强，回收率偏低说明灵敏度太低。公司要求试剂盒回收率必须在60%-120%。检测回收率一般通过对空白阴性样本，添加一倍最低检测限的高浓度标准品的阴性样本，添加两倍最低检测限的高浓度标准品的阴性样本做ELISA实验测其OD值计算浓度，进而确定回收率。

3结果与分析
3.1实验结果
3.1.1包被抗原稀释度、酶标记物稀释度以及抗体稀释度的确定
将抗原（维德维康公司提供）按1:5000,1:10000,1:20000,1:40000的比例稀释，将编号为SAS160307的抗体按1:5000,1:10000,1:2000,1:40000的比例稀释。将酶（维德维康公司提供）按1:500,1:1000,1:2000的浓度稀释。（其中抗原稀释液为2#稀释液，抗体稀释液为3#稀释液，酶稀释液为6#稀释液）。按照抗原200μL酶50μL，抗体80μL的体系在96孔酶标板进行ELISA实验测OD值，检测结果见表1。

表1 不同抗原浓度，酶浓度，抗体浓度的OD值
抗原稀释度

抗体稀释度
1:5000

1:10000

1:20000

1:40000

1:5000
2.608
2.164
1.727
1.951
1.832
1.716
1.181
1.150
1.849
1.265
0.704
0.477
2.482
2.039
1.809
1.667
1.768
1.625
1.207
1.163
1.755
1.056
0.634
0.534

1:10000
2.041
1.679
1.385
1.405
1.893
1.310
1.957
1.689
1.018
0.710
0.453
0.766
2.099
1.845
1.519
1.902
1.675
1.349
1.897
1.705
1.021
0.632
0.470
0.897

1:20000

1.298
1.108
1.923
1.816
1.362
0.977
1.755
1.291
0.631
0.637
1.191
0.314
1.518
0.460
1.972
1.692
1.429
1.008
1.736
1.241
0.695
0.884
0.543
0.475

1:40000

0.920
0.700
0.096
1.420
1.172
1.760
1.346
1.048
1.734
0.073
0.744
0.045
1.284
0.673
0.050
1.402
1.193
1.724
1.325
1.009
1.838
0.083
0.743
0.064

按照公司规定，OD值要控制在1.6-2.0之间，在满足OD值之后，从节省原材料的角度考虑选择稀释倍数较大的。因此抗原稀释倍数为1:2000，抗体稀释倍数为1:10000，酶标二抗稀释倍数为1:10000最为合适。
3.1.2酶标板包被条件的确定
包板条件确定为4℃ 16h。从实验结果（表2）可以看出37℃包被2 h和4℃包被16 h测得的OD值都符合公司要求（1.6-2.0）。一般认为16h包被更加稳定，因此选择4℃ 16 h。

表2 不同包被条件下测定的OD450
封闭时间
封闭温度（℃）
OD值
2h
37
1.67
16h
4
1.83

3.1.3封闭液及稀释倍数的确定
封闭液确定为4#封闭液封闭液浓度为0.25%。结果见表3，从表中显示的数据可以得知从成本和封闭效果两方面考虑脱脂奶粉+BSA+酪蛋白+蔗糖（4#）在封闭液浓度为0.25%时封闭效果较好。因此磺胺类药物检测试剂盒所用封闭液即为4#封闭液，浓度为0.25%。

表3 封闭液选择结果
封闭液稀释度 （%）

封闭液种类

0.1

0.25

0.5

1

1#
0.912
0.974
1.346
1.424
2#
0.854
0.836
1.604
2.531
3#
1.354
1.947
2.525
2.842
4#
1.084
1.785
2.326
2.674
5#
1.456
1.980
2.648
2.852

3.1.4封闭时间的确定
封闭时间为37℃ 1 h 。通过表4可以看出两种封闭条件下测得OD值均符合公司要求（1.6-2.0）从效率上考虑，最终选择37℃ 1 h。

表4 抗原封闭条件的确定
孵育温度（℃）
封闭时间（h）
OD值
25
2
1.746
37
1
1.853

3.1.5酶标记抗体反应条件的确定
酶标记抗体反应条件最终确定为25℃ 30 min。通过表4可以看出25℃反应30 min与37℃反应30 min均符合公司要求（OD值在1.6-2.0之间）。为了考虑检测方法的推广，降低成本便于实际操作，选择25℃反应30 min（25℃基本与室温相当可以不使用恒温培养箱）。

表5 酶标记抗体反应条件的确定
反应温度（℃）
反应时间（min）
OD值
25
30
1.734
25
60
2.078
37
30
1.963
37
60
2.251

3.1.6标准曲线的确定
此部分由维德维康试剂盒研发部完成，最后确定六个标准品工作液的浓度分别为浓度为0 ppb、2 ppb、6 ppb、18 ppb、54 ppb、162 ppb（ppb=ng/ml或ng/g）标准曲线参考图见图5，标准曲线OD值见表5。满足公司要求：零标OD值为2.060（虽然没有严格控制在1.6-2.0，但在允许范围内），第一抑制率77.1%在60%-90%内，曲线相关系数99.22%控制在0.99以上，拐点数为2。

图5 标准曲线参考图

表5 标准曲线OD值
标准浓度ppb
OD值
B/BO%
计算浓度ppb
拟合误差%
0.000
2.060
100
0.000
2.9
0.300
2.031
77.1
0.300
4.1
0.900
1.321
50.2
0.900
2.9
2.700
0.548
20.8
2.700
7.1
8.100
0.241
9.2
8.100
3.8
24.300
0.107
4.1
24.300
1.3

3.1.7交叉反应率的确定
交叉反应率是已建立的标准曲线的IC50（抑制率为50%时所对应的药物浓度）与待测物的结构类似物、代谢物IC50的比值×100%。交叉反应率的测定由维德维康试剂盒研发部完成，其测定结果如下
SMZ（磺胺甲噁唑）…………………………100%
SD（磺胺嘧啶）……………………………22%
SM2（磺胺二甲基嘧啶）……………………40%
SM1（磺胺甲基嘧啶）………………………49%
SQX（磺胺喹噁啉）…………………………63%
SMM（磺胺间甲氧嘧啶）……………………63%
SDM（磺胺二甲氧嘧啶）……………………92%
SMD（磺胺对甲氧嘧啶）……………………89%
SCP（磺胺氯哒嗪）…………………………38%
SIM（磺胺索嘧啶）…………………………90%
SMT（磺胺甲噻二唑）………………………40%

3.1.8最低检测限的确定
经维德维康公司试剂盒研发部反复试验，测得的最低检测限为10ppb。

3.1.9回收率的确定
通过大量的试验检测全国多个地区的鸡肉，鸡肝，鸭肉，牛肉，羊肉，猪肉，猪尿，牛尿，羊尿，原奶，计算回收率在89%-110%，符合公司60%-120%的要求。（此部分由试剂盒研发部和试剂盒品管部共同完成）。

4.讨论
该检测方法的建立的基础是市面上已经研究出磺胺母核结构的半抗原，以及对应的抗体。通过固相载体与抗原结合，固相抗原与抗体，酶反应最后通过显色来实现整个ELISA的检测方法。通过对ELISA检测方法的各种要求，例如最佳的反应体系，最低检测限，零标OD值，抑制率，标准曲线，来把检测结果控制在一个准确，有效的范围内。通过与国外研制的磺胺类兽药ELIAS检测试剂盒对比，各项指标均在行业默认范围内。

5.结论
动物性食品中磺胺类药物检测使用间接ELISA方法是可行的，ELISA方法的成功建立为兽药残留检测提供了方便，而且它设备要求低，操作简单利与推广。但是此方法的结果会因为操作者的操作手法，样本前处理是否充分而受到影响。因此，ELISA检测是一种普筛方法，虽然他可以定性也可以定量，但是对于需要准确测其含量的样本，应使用相关仪器做进一步准确测定。

致 谢

本论文是在郝永清老师的悉心指导下完成的，郝老师给予了我很多的支持和帮助，而且郝老师严谨的治学作风和无私的育人品格使我受益匪浅，在此对郝老师的谆谆教诲、大力支持和帮助，表示最诚挚的谢意！
在维德维康生物技术有限公司两个月的实习中得到了领导以及同事的帮助和支持，向他们学到了很多知识，在此表示由衷的谢意！
最后向所有理解、关心和帮助过我的老师和同学表示衷心的感谢！

参 考 文 献

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4 鲁晓翠，侯玉泽,关瑞广.磺胺类药物在动物性食品中的残留与检测 [J]. 动物医学进展，2007，28（2）：49-51
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