医学检验标记免疫对临床的新贡献.ppt

标记免疫对临床的新贡献上海二医大瑞金医院卢湾分院南洋放免中心 许叔祥1.待测物质浓度与检测手段 临床化学分析床化学分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLm mg/mLmg/mLg/L免疫分析免疫分析Therapeutic DrugsThyroid HormoneFertility HormoneAllergyCancer MarkersInfectious DiseaseVitaminsSerum Proteins常量微量超微量2.HAPATITISCANCERFERTILITYPROTEINSTDMs/DRUGSTYROID,ANEMIAHBVHCVM1071010-1510-4 g/L AFP FERCEA CA199 PRLHCG LH FSHGH MyoglobinRHF IgGC3 ASO CERTRF AAGQUI GEN AMI PHYFT3 FT4 Dig T3 T4TSH ProgImmunoassay Analyte Map3.放射免疫的创立l l1959 1959 美国美国Yalow&BersonYalow&Bersonl l1960 1960 英国英国 EkimsEkimsl l1977 1977 获诺贝尔获诺贝尔医学生物学医学生物学奖奖医学生物学超微量分析的里程碑4.放射免疫面临的挑战l l半衰期短，限制了半衰期短，限制了药药盒使用寿命盒使用寿命l l由于由于标记标记物的不断物的不断变变化，化，带带来来药药盒批盒批间间、批内、批内较较大的大的差异，差异，标标准曲准曲线线无法保存无法保存备备用用l l反反应时间过长应时间过长(数小数小时时至至过过夜夜)l l结结果果测测量依靠量依靠时间时间累累计计，至少每一，至少每一样样品一分品一分钟钟其主要的缺陷是：l l理理论论和和实实践践证证明其分析的限度是明其分析的限度是1010-7-7分子分子/mLmL或或1010-12-12 g/mLg/mL，要再提高有困要再提高有困难难以上原因都造成放射免疫无法进行自动化分析5.新技术的挑战RIA面临新技术的挑战。但取代它的决不是微孔板的发色酶标，因其技术指标尚不及放免。从90年代开始一些大型的实验室，标本量大的项目都已逐步应用各种非放免标记的自动化设备来取代放免分析，这是技术发展的必然规律。我们必须清醒地分析趋势，迎接新技术的挑战和带来新的曙光。6.标记免疫方法7.化学发光免疫分析仪8.不同系统的理论灵敏度l l比色法：10-10 molel lRIA：10-11 to 10-12 molel l荧光法：10-12 molel l发光法：10-15 molel lDELFIA：10-18 moleBIOTROL DIAGNOSTIC9.自动标记免疫分析的优点l l消除手工操作的消除手工操作的误误差差l l灵敏度高，灵敏度高，稳稳定性好定性好l l速度快、当天速度快、当天报报告告l l特殊特殊项项目的目的测测定定 3 3rd-TSHrd-TSH、intact-HCGintact-HCG、F-PSAF-PSAl l实现实现短短时间时间反反馈馈(Short Turn-around Time)Short Turn-around Time)l l提高提高临临床床诊诊断效率和断效率和质质量，有效降低量，有效降低总总医医疗费疗费用用10.甲状腺功能测定战略l l6060年代年代 基基础础代代谢谢(BMR)BMR)蛋白蛋白结结合碘合碘(PBI)PBI)l l7070年代年代 T T3 3，T T4 4 TSH TSH 吸吸131131I I试验试验l l8080年代年代 超敏超敏TSH FTTSH FT3 3，FTFT4 4 两次战略转移11.第三代超敏TSH12.TSH正常值(IU/mL)FT3，FT4正常值(pmol/L)13.14.甲状腺功能诊断新战略(Caldwell 1985)甲状腺功能检查TSH(U-S)降低升高正常降低降低正常升高正常FT4FT4FT3正常升高甲亢甲亢亚临床甲亢床甲亢继发甲减甲减正常正常亚临床甲减床甲减原原发甲减甲减15.整分子HCG16.HCG分子结构HCG系糖蛋白 M=39,000 由237个氨基酸组成 链 23,000 145 链 16,000 92链与垂体激素LH、FSH、TSH相同链有91个氨基酸与LH的亚基相同，但羧基端最后的2830个氨基酸唯其独有。有生物活性的只是无裂口整分子的HCG17.18.裂口HCG和片段的代谢 裂口HCG(Nicked HCG)是由滋养层中巨噬细胞分泌的酶，裂解HCG而成；在非常妊娠时酶活性异常升高，使裂口HCG及各片段浓度增高。裂口HCG很不稳定，很快分解成游离和游离。血游离增高：滋养层细胞癌、唐氏综合征、睾丸癌 尿核心增高：唐氏综合征、先兆紫痫、卵巢癌、膀胱癌、宫颈癌、睾丸癌等19.HCG测定原理ACS 180 Dimension-HM*Anti-Anti-ACCESS DPC*Anti-2Anti-1RIA Anti-Anti-Anti-*20.需要一种新的标记系统来帮助识别HCG测定的分子类型。目前，分析分析标记仅限于限于“完整完整HCG”，“总HCG”或者或者“HCG”，这是不够的，容易引起误解。缺口HCG算不算“完整HCG”呢？少了亚单位C端片段的HCG又算不算呢？非缺口HCG和游离真的就是“总HCG”吗？必必须标明我明我们真正要真正要测定的是没有缺口的整分子定的是没有缺口的整分子HCG，这是唯一具有生物活性的分子是唯一具有生物活性的分子。21.唐氏综合征的三联筛查Prenatal Screening for Downs SyndromePrenatal Screening for Downs Syndrome22.23.24.为什么要筛查唐氏征1:38001:580001:100001:70025.唐氏征患儿不仅体貌异常、智力低下，而且疾病繁多、寿命短暂。除患者自身痛苦外，给家庭和社会带来极大的精神和经济负担。目前还无法预防，更无法治疗，唯一有效的方法是进行产前筛查，明确诊断后，终止妊娠，防止唐氏儿的出生。唐氏征的唐氏征的产前前筛查不不仅是一个医学是一个医学问题，也是一个社会，也是一个社会问题；不；不仅有助于有助于家庭，也有助于国家。家庭，也有助于国家。26.AFP、HCG、uE3三联筛查的结果运算27.初始初始风险度度(年年龄特异性危特异性危险度度)LR(AFP)LR(HCG)LR(uE3)=总风险度度总风险度度(合并危合并危险度度)计算算28.妊娠15-20周时抽血5mL测定AFP，HCG，uE3将孕妇的基本资料填写在申请单上OSB危险度1:1152电脑算出唐氏征的合并危险度怀疑NTD做胎儿超声波检查唐氏征儿筛查流程图待续29.唐氏征危险度1/270唐氏征危险度1/270以超声波确认孕周发阴性报告并追踪妊娠结果及由新生儿科医师来确认婴儿是否正常不符合符合发阳性报告并建议孕妇羊水穿刺，细胞染色体检查修订周数重新计算，若周数不足15周则待15周时再行检测母血重新计算正常异常追踪妊娠结果由新生儿科医师来确认婴儿是否正常遗传咨询及进一步处理30.恶性肿瘤的实验室诊断31.临床：病史、体征物理检查：X光、CT、磁共振、B超、红外、核医学术前：穿刺、刮片、拉网术后：组织切片免疫：肿瘤抗原和代谢物测定分子生物：核酸分析肿瘤诊断辅助病理32.已建立的肿瘤标记物33.不同不同不同不同脏脏器器器器肿肿瘤瘤瘤瘤标标志物志物志物志物34.总PSA和游离PSA35.36.PSA的两种主要形式游离PSA结合PSA(PSA-ACT)-1-antichymotrypsin抗原结合部位PSAPSAACT37.35%30%25%20%15%10%5%0%良性疾病的良性疾病的可能性增加可能性增加前列腺癌的前列腺癌的可能性增加可能性增加FREE PSA%结果解释P-Ca10%34%70%38.肿瘤瘤标记物物应用方法用方法1.有关标志物联合检测-提高灵敏度2.阳性标志物动态观察-提高准确性 不应以单项、单次检测下诊断39.肿瘤瘤标记物物应用用战略略诊断断(免疫档案免疫档案)预后后疗效效观察、复察、复发转移移监测(随随访)随随访治治疗40.肿瘤瘤标记物物临床床应用用1.预后：病员分群 (-)非保护人群 (+)保护人群-预后好、坏2.疗效观察：外科：手术切除/残留/姑息 保守：药效、放疗效果3.随访：术后6周 三年 五年 七年 4.良/恶鉴别：辅助指标标志物志物三月一次三月一次半年一次半年一次一年一次一年一次41.正常 间变 恶性 可见前期 不可见前期物质分析影像诊断42.我们必须强调，随着科学的进步，肿瘤的诊断应从形态推进到物质，坚信物质先于形态。43.肿瘤的治瘤的治疗物质的消失重于形态的消失肿瘤必须终身随访44.心肌标志物45.二二.急性冠脉急性冠脉综合征（合征（ACS）的的诊断断 急性冠脉急性冠脉综合征的定合征的定义 急性冠脉综合征是在动脉粥样硬化斑块破裂的基础上，继发出血、血栓形成的结果。包括不稳定性心绞痛（UAP）、非Q波心肌梗死（NQMI）、Q波心肌梗死（QMI），以及心脏缺血性猝死。46.急性冠状急性冠状动脉脉综合征的合征的临床分型床分型急性冠状动脉综合征ST段抬高ST段不抬高QMICK-MB正常上限的2倍CK-MB正常上限的2倍NQMIUAPQ MI：Q波心肌梗死波心肌梗死NQMI：非非Q波心肌梗死波心肌梗死UAP：不不稳定心定心绞痛痛47.约25%的AMI病人早期没有典型的临床征状，约50%的AMI病人缺乏ECG的特殊改变 一般来说，AMI病人在征状出现2-3小时即可有心脏急性缺血损伤（Acute Ischemic Damage，AID）的生化标志物出现。AMI的ECG变化是动态的。最早是对称性高尖T波，随之为ST段手背样抬高，其后出现病理性Q波和T波倒置。48.急性心肌梗死的急性心肌梗死的诊断断标志志（Acute Myocardial Infarction，AMI）一.早期标志物二.征状出现后6小时内血中升高的物质，出现在病理过程的早期（心肌坏死之前）三.*肌红蛋白（myoglobin，Mb）四.*肌酸磷酸激酶同功酶五.（creatine phosphokinase MB，CK-MB）六.目前临床公认的早期指标仅Mb和CK-MB49.二.确定标志物 发病后6-9小时血中出现增高并持续数天，对心肌损伤的敏感性和特异性均较高 *心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）*心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）50.AMI-WHO CriterialAcute myocardial infarction(AMI):WHO定义-存在下述三个指标中的两个:ECG 改变典型胸痛心肌酶谱升高 WHO Tech Support Ser.1959;168:3-2851.AMI:New Criteria（美国临床生化科学院NACB）l原有 MI 定义:WHO(2 out of 3 criteria)l但是:目前临床实践流行病学研究以及临床试验新的手段:n血清生化血清生化标志物的敏感度和特异性志物的敏感度和特异性 andn精确的成像技术MI的新定的新定义JACC 2000;36:959-967 and Eur.Heart J 2000;21:1502-151352.l“MI 的诊断：临床局部缺血状态敏感和特异的生化标志物如心肌心肌钙蛋白蛋白以及CKMB的血液水平升高l“ECG 变化如ST段升高、降低，T波倒置，可以反映心肌缺血，但并不足以定义MI。最最终的的诊断取决于心肌断取决于心肌生化生化标志物的水平升高志物的水平升高。JACC 2000;36:959-967 and Eur.Heart J 2000;21:1502-1513一致通过:“MI 重新定义”53.蛋白标志物的动力学曲线54.参考参考值：cTnI 0.04 ng/mLAMI Cutoff Value：0.50ng/mL(Beckman-Coulter；Access)cTnT 0.04 ng/mLAMI Cutoff Value：0.10ng/mL(Roche)55.微小心肌损伤（MMD）的诊断 cTnI较cTnT分子小，对心肌细胞损伤的检测更加灵敏。特别对心肌炎、甲状腺功能减退者心肌损伤的诊断有价值。cTnT：0.04ng/mL，0.04ng/mL，0.5ng/mL56.ACCESS测定的Accu Tni FDA唯一批准（2003年）用于心血管危险性分层的肌钙蛋白测定。欧洲血管协会（ESC）和美国心血管学院（ACC）推荐的新的肌钙蛋白标准，心肌梗塞的首选标志物。57.建建议议的的ACSACS诊诊断程序和危断程序和危险险度分度分层层缺血性不适缺血性不适No ST ST MbMbCTnCTn低低风险高高风险AMI不可逆心肌不可逆心肌损伤UAPNSTEMISTEMI（或其他）ACS排除ACS+_+4hr_6hr58.Outcome studies Follow patients after Initial Outcome studies Follow patients after Initial presentation With chest painpresentation With chest painDeath or MI(%)N=1763Am J cazdiol2002;89:1035-1041190.319623617559.乙肝蛋白标志检测60.新波公司生产的时间分辨荧光分析系统61.时间分辨分辨荧光免疫光免疫原理原理图（Time-resolved Fluorescence ImmunoassayTime-resolved Fluorescence Immunoassay）62.波长分辨：1.激发光波谱宽、荧光发射波谱窄，有利于增强荧光的强度；2.激发光和发射光之间存在较大的STOKES位移，有利于排除非特异性荧光的干扰、提高光谱的分辨率。63.时间分辨:通通过时间过时间延延迟迟，待非特异性，待非特异性荧荧光完全光完全衰减后再在固定衰减后再在固定时间时间段段检测检测特异性特异性荧荧光，就消除了自然光，就消除了自然本底的影响，零本底本底的影响，零本底测测量，提高了量，提高了检测检测的灵敏度。的灵敏度。64.表面抗原65.表面抗体66.e抗原67.e抗体68.核心抗体69.时间分辨技分辨技术为临床床检测带来的先来的先进性性技技术特点特点检验先先进性性时间分辨分辨光光谱分辨分辨特异性荧光与非特异性荧光分离发射荧光与激发荧光分离本底、高特异性解离解离-增增强稳定的荧光螯合物荧光强度大大提高线性范围更宽重复性更好原子原子标记 标记位点多，可达20个 对标记物结构及活性影响小 无衰变 受环境影响小高稳定性，高精确度试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长同一批次只需两点定标多多标记单，双，三，四标记同一体系可同时测多个项目70.谢 谢71.