SDS-PAGE分离胶-浓缩胶配方.doc

SDS-PAGE
1、 SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
2、 Acr：丙烯酰胺；配胶时用30%Acr（质量比Acr：Bis=29:1）
3、 Bis：甲叉双丙烯酰胺
4、 DDW：超轻水
5、 SDS：十二烷基硫酸/磺酸钠，阴离子去污剂（配胶时用10%）
6、 APS：过硫酸铵NH4S2O4配胶时用10%
7、 TEMED：四甲基乙二胺，促凝剂
8、 Tris-Hcl：3羟基氨基甲烷盐酸缓冲液，配胶时（分离胶ph=8.8，浓缩胶ph=6.8）
9、 DTT：二硫苏糖醇，DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。
10、 IMA：碘乙酰胺，碘代乙酰胺用于有机合成，在蛋白组学中组氨酸和半胱氨酸的烷基化试剂，用于多肽测序以及酶抑制剂等，蛋白组学级试剂。　CH>2ICONH>2，是和碘乙酸一样，可通过下列反应不可逆地抑制SH酶类的物质。

1) 根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：
SDS-PAGE分离胶浓度
最佳分离范围
6%胶
50-150kD
8%胶
30-90kD
10%胶
20-80kD
12%胶
12-60kD
15%胶
10-40kD

成分
配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）
6%胶
5
10
15
20
30
50
蒸馏水
2.0
4.0
6.0
8.0
12.0
20.0
30%Acr-Bis(29:1)
1.0
2.0
3.0
4.0
6.0
10.0
1M Tris,pH8.8
1.9
3.8
5.7
7.6
11.4
19.0
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
TEMED
0.004
0.008
0.012
0.016
0.024
0.04

成分
配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）
8%胶
5
10
15
20
30
50
蒸馏水
1.7
3.3
5.0
6.7
10.0
16.7
30%Acr-Bis(29:1)
1.3
2.7
4.0
5.3
8.0
13.3
1M Tris,pH8.8
1.9
3.8
5.7
7.6
11.4
19.0
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
TEMED
0.003
0.006
0.009
0.012
0.018
0.03

成分
配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）
10%胶
5
10
15
20
30
50
蒸馏水
1.3
2.7
4.0
5.3
8.0
13.3
30%Acr-Bis(29:1)
1.7
3.3
5.0
6.7
10.0
16.7
1M Tris,pH8.8
1.9
3.8
5.7
7.6
11.4
19.0
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.012
0.02

成分
配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）
12%胶
5
10
15
20
30
50
蒸馏水
1.0
2.0
3.0
4.0
6.0
10.0
30%Acr-Bis(29:1)
2.0
4.0
6.0
8.0
12.0
20.0
1M Tris,pH8.8
1.9
3.8
5.7
7.6
11.4
19.0
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.012
0.02

成分
配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）
15%胶
5
10
15
20
30
50
蒸馏水
0.5
1.0
1.5
2.0
3.0
5.0
30%Acr-Bis(29:1)
2.5
5.0
7.5
10.0
15.0
25.0
1M Tris,pH8.8
1.9
3.8
5.7
7.6
11.4
19.0
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.012
0.02
注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。
1) 按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)：
成分
配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积（毫升）
5%胶
2
3
4
6
8
10
蒸馏水
1.4
2.1
2.7
4.1
5.5
6.8
30%Acr-Bis(29:1)
0.33
0.5
0.67
1.0
1.3
1.7
1M Tris,pH8.8
0.25
0.38
0.5
0.75
1.0
1.25
10%SDS
0.02
0.03
0.04
0.06
0.08
0.1
10%过硫酸铵
0.02
0.03
0.04
0.06
0.08
0.1
TEMED
0.002
0.003
0.004
0.006
0.008
0.01

TBST 缓冲液
每2L体积中含：
1M TrisHCL(pH7.5)
100mL
Nacl
16g
KCL
0.4g
吐温
1ml

1) 抗体去除液
每50mL抗体去除液中含：
0.5M TrisHCL（pH6.8）
6.25mL
10%SDS
10mL
Beta-ME
0.175mL
水
33.75mL

SDS-PAGE电泳的基本原理：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8，选择tris－HCL系统，具体作用后面介绍；
TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；
AP中含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺，能产生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。
十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。