黄芪皂苷对不同类型乳腺癌细胞的作用效应及机制研究_徐敏.pdf

基金项目：江苏省中医药局科技项目（）；江苏省中医院“益中”项目（）作者简介：徐敏（.），女，硕士，主管技师，研究方向：临床免疫学与分子生物学，：.通信作者：赵苏瑛（.），女，硕士，主任技师，研究方向：中药抗肿瘤，：.黄芪皂苷对不同类型乳腺癌细胞的作用效应及机制研究徐 敏 程迎迎 李鹏飞 蒙 飞 胡堇叶 吴 倩 赵苏瑛（南京中医药大学附属医院，南京，；南京医科大学公共卫生学院，南京，）摘要 目的：研究中药黄芪皂苷对不同类型乳腺癌细胞的作用效应及对胞内 表达的影响，探讨其发挥效应可能的途径，为阐明中药的抗肿瘤作用机制和其临床应用的推广提供理论依据。方法：选择代表不同类型的乳腺癌细胞系，和，选取对数生长期的细胞随机分为对照组和加药组，在加药组中加入不同浓度的黄芪皂苷溶液（终浓度 、.、），绘制细胞生长曲线并检测细胞克隆形成情况，并用流式细胞仪检测细胞凋亡，使用 测定、的 表达水平。结果：黄芪皂苷在体外能抑制 种乳腺癌细胞系的生长和增殖，并且诱导乳腺癌细胞凋亡，但作用效应不尽相同。对 的作用最强并且呈剂量依赖型，对 和 的作用稍弱并呈时间剂量依赖型。黄芪皂苷能使 和 中的、表达降低，而 中，升高。结论：黄芪皂苷对乳腺癌有抑制增殖、诱导凋亡的作用，并且对不同的细胞类型作用效应不同。在 和 中，黄芪皂苷通过活化 和 信号通路中的分子，来发挥效应，而在 中则不然，其作用的准确途径和机制尚需进一步地深入研究。关键词 黄芪皂苷；中药；乳腺癌；机制；效应；抑制；凋亡；抗肿瘤 ，（，；，）：，：，（，.，），：，：，；中图分类号：；文献标识码：乳腺癌在全球范围内高发，是最常见的女性恶性肿瘤，死亡率居于女性恶性肿瘤的第 位。自 世纪 年代以来，中国女性乳腺癌发病率就以 倍的趋势增加，特别是在一些发达城市，快节奏的生活使乳腺癌上升的速度尤其迅猛。在中国，乳腺癌的发病率占所有女性恶性肿瘤的，病死率占.。我国乳腺癌的治疗以西医为主，中医为辅。西医治疗采取手术结合放化疗，旨在去除病灶和控制转移。中药主要用来提高机体免疫力和减轻放化疗的不良反应。近年来，随着中药学的发展，在传统的中药中发现了一大批具有抗肿瘤作用的药物，研究这些药物的作用效应和作用机制，是中国世界中医药 年 月第 卷第 期传统医药走向国际舞台的必经之路。应用中草药治疗和预防肿瘤成为全世界研究的热点。中国的传统医药以其天然、有效、安全、不良反应小的特点在未来 的 抗 肿 瘤 治 疗 领 域 必 将 拥 有 一 席 之地。黄芪皂苷是从常见中药黄芪中提取出来的一种有效化学成分。我们在前期的实验中发现黄芪皂苷在体外能抑制乳腺癌细胞（）的增殖，并且能够诱导其凋亡，在分子水平能上调 和 的表达，同时使 和 的表达下调。为了进一步明确黄芪皂苷对乳腺癌的作用效应和机制，本实验选用代表多个病理类型的乳腺癌细胞系进行体外效应和机制研究，为黄芪皂苷应用于乳腺癌的治疗提供依据。材料与方法.材料.细胞系 实验细胞系选用、，均购自上海细胞生物研究所，培养条件为 ，。.药物实验用黄芪皂苷购于中国药品生物制品检定所（批号：），纯度；分子量.，用二甲基亚砜溶解黄芪皂苷，配置成 的贮存液，使用时用新鲜配制的 细胞培养基稀释至实验所需浓度。.试剂与仪器 细胞培养选用（公司，美国，货号：）加入 胎牛血清（公司，美国，货号：），孵箱（公司，美国，型号：）培养；试剂（上海七海生物，货号：）；酶标仪（公司，美国，型号：）；细胞凋亡试剂盒（南京凯基生物，货号：）；提取试剂盒（南京天根生物，货号：）；扩增仪（赛默飞公司，美国，型号：）。.方法.实验分组 本实验共设 个浓度梯度，药物组终浓度以黄芪皂苷计分别为.、，同时设置无细胞只含培养基的调零对照，为正常对照组。.检测方法与指标.法测定细胞增殖实验细胞调整到合适的密度接种到 孔板中，使每孔细胞量约 个，然后用含血清培养基稀释黄芪皂苷至所需的实验浓度，每孔中加入 含药培养基，每个浓度设置 个复孔，孔板置于 ，培养箱中分别培养 、后，再分别于这 个时间段每孔加入 试剂后，继续孵育，取出后用酶标仪检测 处的吸光度，每孔重复测量 遍，生长抑制率 （对照 实验）（对照空白）。.细胞克隆形成实验选择生长旺盛的细胞，胰酶消化，显微镜计数，将适宜浓度的细胞接种于 孔细胞培养板中，摇匀后置于细胞培养箱中培养过夜，待细胞贴壁且状态稳定后吸走原有培养基并加入含药培养基，继续培养 后，用 的多聚甲酸固定细胞 ，然后再用 结晶紫染色（细胞染色 ），染色结束后吸走染液，用自来水清洗 遍，除去多余未结合的结晶紫染料，室温晾干 孔板，拍照并统计克隆数。.流式细胞仪检测细胞凋亡实验细胞.胰酶消化后制成约 的单细胞悬液接种于 孔板中，在 、条件下培养，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的含药培养基，继续培养至、，在对应时间点收集实验细胞并按照商品化细胞凋亡试剂盒的使用说明完成流式细胞仪检测。.测定，的表达水平 选择对数生长期的细胞，用含不同浓度黄芪皂苷的培养基分别培养 、后提取细胞总，定量反转录（，）扩 增，和。引物序列见表。荧光素分子标志采用 ，扩增反应在 上重复测定 次，的表达水平用 进行标化。具体体系和条件如下：反应体系为 ，合计 ；反应条件为 ，保存。体系为 ，互补 ，合计，反应条件为 ，共 个。表 扩增所选用的引物序列靶基因引物序列（），.统计学方法采用 .统计软件对研究数据进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析。两两比较采用 检验；两独立样本的比较采用 检验，以 .为检验水准，以 .为差异有统计学意义。结果.黄芪皂苷对乳腺癌细胞增殖的作用效应黄芪皂苷在体外对 种乳腺癌细胞系的增长均有抑制作用，且作用效应与浓度及作用时间有关，但黄芪皂苷对 种细胞系的作用浓度和效应不尽相同。黄芪皂苷对 的抑制效果最好，最适作用浓度约.，且作用 的效果优于 和 ，抑制率与时间成反比；黄芪皂苷对 的抑制效果与浓度和作用时间成正比，浓度越高表示作用时间越长，则抑制效果越好；黄芪皂苷对 的最适作用浓度为 ，抑制效应在低于该浓度时与作用浓度和作用时间成正比，高于此浓度后抑制作用下降。不同浓度药物组与空白对照组比较，差异均有统计学意义（均 .）。见图 。图 各浓度黄芪皂苷对 细胞增殖的影响图 各浓度黄芪皂苷对 细胞增殖的影响图 各浓度黄芪皂苷对 细胞增殖的影响.黄芪皂苷对细胞克隆的作用效应黄芪皂苷对 种乳腺癌细胞克隆的形成均有抑制作用，对 的抑制效果优于其他 株细胞系，抑制的最适浓度约 ，与细胞增殖实验结果一致。见图。图 各浓度黄芪皂苷对 种细胞系克隆计数的影响.黄芪皂苷对细胞凋亡的作用效应从黄芪皂苷能诱导 种乳腺癌细胞的凋亡，总体而言，时间越长表示作用越好，对于 和，作用浓度为 时效果最好，而 的最适浓度约为 。见图。图 不同浓度的黄芪皂苷在不同作用时间下对细胞凋亡的影响.黄芪皂苷对信号通路中基因表达的作用效应世界中医药 年 月第 卷第 期 加入黄芪皂苷后 中 的表达升高，并且与作用浓度和作用时间有关，最佳作用时间约为 ；中 的表达也升高，但是升高幅度小于，并且呈现剂量时间依赖性改变；中 的表达降低，也呈现出一定的剂量时间依赖性改变。在各个细胞系中的表达与 类似，在 和 中升高，而在 中降低。见图 。图 加入黄芪皂苷后 中 和 的表达水平图 加入黄芪皂苷后 中 和 的表达水平图 加入黄芪皂苷后 中 和 的表达水平 讨论黄芪来源于豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，可以用于调节体内血糖，增强肌体免疫力，促进生长，提高机体抗氧化能力。它是多种化学成分的混合物，主要包含三萜皂苷、黄酮类化合物以及黄芪多糖，其中皂苷类是黄芪的主要活性成分。黄芪皂苷主要由黄芪皂苷、和其他一些皂苷组分组成，又称为黄芪总皂苷。有报道称黄芪皂苷能诱导包含、及 在内的细胞因子的表达，促进淋巴细胞的增殖，从而促进抗体的分泌，另外黄芪皂苷能增强体细胞毒性 细胞、自然杀伤细胞的杀伤活性。此外，也有黄芪皂苷能诱导肿瘤细胞凋亡的报道，如人肝癌细胞 和，白血病细胞 等。我们在前期的实验中发现，黄芪皂苷在体外对乳腺癌细胞 有抑制增殖的作用，并且能够诱导其凋亡，在分子水平能上调 和 的表达，同时使 和 的表达下调，并且黄芪皂苷的体外作用呈现出明显的时间依赖性和浓度依赖性，且各个实验浓度与对照组比较差异均有统计学意义。因此我们推断黄芪皂苷除了公认的提高机体免疫力发挥抗肿瘤作用外，对乳腺癌细胞还有直接效应。本研究选用了 种不同类型的乳腺癌细胞系，其中 对应的是雌激素受体阳性的乳腺癌，对应的是三阴性乳腺癌，代表强侵袭性的乳腺癌。黄芪皂苷对、和 均表现出作用效应，但作用效果不尽相同。体外黄芪皂苷可抑制 种乳腺癌细胞系的生长，其中对 的效果最好，作用浓度最低。在 和 中，抑制作用在达到最适浓度前与浓度成正比，达到最适浓度后则迅速下降，而 却是随浓度升高而增加，其原因可能是因为 的最适作用浓度高于我们实验的最高浓度，也有可能是由于 属于剂量时间依赖型。黄芪皂苷对 作用 时效果最佳，而 和 却有时间效应，说明 种细胞对黄芪皂苷的反应不尽相同，可能是剂量依赖型，时间延长后药物水解增加，因此效果反而下降，和 则属于剂量时间依赖型，既需要一定的作用浓度也需要一定的作用时间。细胞克隆计数结果显示，黄芪皂苷对 的抑制效果最好，其次是，最后是，这与我们的增殖实验结果相符。细胞凋亡的测试结果也验证了这一结果，更有力地说明黄芪皂苷对乳腺癌细胞有抑制增殖、诱导凋亡的作用，但是对不同类型的乳腺癌细胞作用效果存在差异，可以进行深入的研究。细胞因子信号传送阻抑物（，）由细胞产生，能够反馈性阻断细胞因子信号转导过程，是 通路中的负性调节因子。家族在 信号通路中扮演重要角色，它的活化与其磷酸化状态直接相关，并受 磷酸化级联通路的调节。有报道称 参与多种细胞的生理过程并可能参与机体的免疫调节，的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关，甚至被称为肿瘤抑制器。本研究中，加入黄芪皂苷后 和 ，的表达在 和 中均升高，说明药物作用后细胞内抑制增殖、促进凋亡的基因活化表达，与表现出的细胞增殖降低而凋亡增加的现象一致；也足以说明这些现象的产生原因是由于对肿瘤细胞发挥负性调控的信号通路活化，而 和 就是作用的靶基因。但是在 中这 个基因的表达是下降的，说明黄芪皂苷对 的抑制作用并不是通过这 个下游基因来实现的，而是存在其他作用途径，这是药物对不同细胞类型作用存在差异的又一有力证据。综上所述，中药黄芪皂苷有确切的抗乳腺癌细胞生长、增殖和转移的效应，这种效应的大小与作用途径在不同的乳腺癌细胞系中表现不同。在雌激素受体阳性和强转移的细胞系中效应的发挥涉及 信号通路和 信号通路的活化，三阴性乳腺癌则不然，具体的效应途径和靶基因位点仍须进一步地研究证实。利益冲突声明：无。参考文献李云祥，梁引库，高飞雄，等 中药治疗乳腺癌疾病研究进展中国实验方剂学杂志，（）：李贺，郑荣寿，张思维 年中国女性乳腺癌发病与死亡分析 中华肿瘤杂志，（）：崔羲和，曾蕊，杨庆，等 乳腺癌多药耐药的研究现状及中医药应对策略 中国实验方剂学杂志，（）：，：，：，：张特，张亮，陆俊霏，等 重楼皂苷 靶向 影响人乳腺癌细胞增殖及凋亡的作用机制 中国中药杂志，（）：赵峰，武宜婷，黄大福，等 楤木皂苷 对乳腺癌 细胞增殖和迁移的影响研究 中国临床药理学杂志，（）：王露，权利娜 人参皂苷 对乳腺癌耐药细胞 凋亡和微小核糖核酸表达的影响 中国临床药理学杂志，（）：杨红，周杰，阳晓晴 胡黄连苷对 乳腺癌细胞自噬的影响及其作用机制研究 中国临床药理学与治疗学，（）：吴朗杰，赵春燕，战丽彬 基于网络药理学和分子对接研究白花蛇舌草和半枝莲药对治疗宫颈癌的作用机制 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