CD三四细胞分离及其体外扩增-医学课件.ppt

CD34+细胞细胞lCD34+细胞是造血干细胞的表面标志分细胞是造血干细胞的表面标志分子。子。l细胞表面细胞表面CD34+抗原是一种相对分子质抗原是一种相对分子质量为量为110-120kD的高度糖基化的的高度糖基化的型膜型膜蛋白。它主要存在于幼稚的造血干细胞蛋白。它主要存在于幼稚的造血干细胞和造血祖细胞质膜上，部分骨髓基质细和造血祖细胞质膜上，部分骨髓基质细胞以及少量内皮细胞表面。胞以及少量内皮细胞表面。lCD34+细胞在骨髓，脐带血以及外周血中细胞在骨髓，脐带血以及外周血中都有存在。用常规方法一般难以有效分离。都有存在。用常规方法一般难以有效分离。原因主要在于原因主要在于CD34+抗原表达的拷贝较低，抗原表达的拷贝较低，抗抗CD34+的亲和力低，表达的亲和力低，表达CD34+抗原的抗原的细胞存在于一个不均一的本底细胞群中，细胞存在于一个不均一的本底细胞群中，且数量极少。且数量极少。分离分离CD34+细胞的方法细胞的方法l荧光激活细胞分选荧光激活细胞分选l免疫吸附系统免疫吸附系统 （淘选法；免疫吸附柱层析（淘选法；免疫吸附柱层析法；免疫磁珠法）法；免疫磁珠法）l细胞物理参数系统（密度梯度离心法；离心计细胞物理参数系统（密度梯度离心法；离心计数流式法）数流式法）l流式细胞分选流式细胞分选(fluorescence activated cell sorting,FACS)可获可获得高纯度的得高纯度的CD34+细胞，但是由于细胞，但是由于得量较少，受无菌实验条件等方面得量较少，受无菌实验条件等方面的限制，所以应用较少。的限制，所以应用较少。l细胞物理参数系统分离细胞物理参数系统分离CD34+细胞细胞得率较低，而且需要提供足够的细得率较低，而且需要提供足够的细胞量。胞量。l目前常用于分离目前常用于分离CD34+细胞的方法主要细胞的方法主要是免疫吸附法（是免疫吸附法（systems based on immunoadsorption)。l尤其是用免疫磁珠吸附分离（尤其是用免疫磁珠吸附分离（immune adsorption on ferromagnetic beads)的方法应用更为广泛。的方法应用更为广泛。CD34+细胞分离方法比较细胞分离方法比较分离方法分离方法 细胞得率细胞得率 难易程度难易程度 细胞纯度细胞纯度 分离速度分离速度 条件条件荧光激活细荧光激活细胞计数胞计数 少少难难高高慢慢高高免疫磁珠吸免疫磁珠吸附分离附分离 大大易易高高快快经济经济细胞物理特细胞物理特性分离性分离低低易易低低快快经济经济免疫磁珠吸附分离免疫磁珠吸附分离CD34+细胞细胞l利用抗利用抗CD34单克隆抗体与抗原特异结合单克隆抗体与抗原特异结合的特性，通过二抗介导的免疫磁珠结合，的特性，通过二抗介导的免疫磁珠结合，使用使用Miltenyi的磁性细胞分离仪，有效的的磁性细胞分离仪，有效的分离纯化分离纯化CD34+细胞，进一步用于造血细胞，进一步用于造血细胞培养，扩增，基因转染，建立造血细胞培养，扩增，基因转染，建立造血干细胞库等实验。干细胞库等实验。l实验材料：实验材料：l1.脐带血，外周血及骨髓标本；脐带血，外周血及骨髓标本；l2.PBS缓冲溶液；缓冲溶液；l3.10%BSA；l4.10mmol/LEDTA；l5.淋巴细胞分离液；淋巴细胞分离液；l6.MACS磁性分离仪；磁性分离仪；l7.MACS分离试剂盒；分离试剂盒；操作步骤操作步骤l1.配制含配制含1%BSA和和5mmol/L EDTA的的PBS缓冲溶缓冲溶液。液。l2.利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞；利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞；l3.将将1*108个单个核细胞悬浮于个单个核细胞悬浮于300ul缓冲液中，缓冲液中，利用利用MACS磁性分离试剂盒制备细胞悬液磁性分离试剂盒制备细胞悬液500ul；l4.将分离柱固定于将分离柱固定于MACS磁场内，将标记细胞缓磁场内，将标记细胞缓慢通过分离柱。洗脱组分为慢通过分离柱。洗脱组分为CD34-细胞；细胞；l5.将分离柱移出磁场，加将分离柱移出磁场，加1ml 缓冲液加压洗脱，缓冲液加压洗脱，收集收集CD34+细胞。细胞。l6.用免疫细胞化学和用免疫细胞化学和FACS分析分析CD34+细胞纯度细胞纯度分离结果分离结果l分离前，脐带血和骨髓的分离前，脐带血和骨髓的CD34+细胞占单个核细细胞占单个核细胞的胞的1-4%，外周血仅为，外周血仅为0.2%。l分离后，分离后，CD34+细胞可达细胞可达95-99%。CD34+抗原抗原组则组则99.6%的细胞为的细胞为CD34-细胞。细胞。l回收率达回收率达70-75%，免疫磁珠分离方法得到的，免疫磁珠分离方法得到的CD34+细胞纯度和回收率均较高。细胞纯度和回收率均较高。体外培养脐血单个核细胞与体外培养脐血单个核细胞与CD34+富集细胞的比较富集细胞的比较l目的：在相同的条件下体外培养脐血单个核细目的：在相同的条件下体外培养脐血单个核细胞（胞（MNC）和）和CD34+富集细胞，对比考察这富集细胞，对比考察这两种细胞扩增，集落形成和两种细胞扩增，集落形成和CD34+细胞扩增等细胞扩增等特性。特性。l王斌，康自珍，迟占有等。体外培养脐血单个核细胞与CD34+富集细胞。l生物工程学报，2002,5(18),343-347.l方法方法l1.Ficoll 密度梯度离心收集单个核细胞密度梯度离心收集单个核细胞;l2.免疫磁珠分离纯化免疫磁珠分离纯化CD34+细胞细胞.l3.MNC接种密度为接种密度为5*105 cells/ml.CD34+细细胞为胞为2*104 cells/ml于于24孔板，每周取样计数，孔板，每周取样计数，集落检测和流式细胞分析集落检测和流式细胞分析.结果结果脐血脐血CD34+细胞的分离结果细胞的分离结果 MNC扩增到第扩增到第28天，细胞总数开始天，细胞总数开始呈下降趋势，而另一组则持续扩增呈下降趋势，而另一组则持续扩增8周。周。在前在前4周中，周中，MNC的扩增倍数远低于的扩增倍数远低于CD34+富集细胞富集细胞造血干造血干/祖细胞集落密度分析祖细胞集落密度分析 细胞于半固体培养体系中进行集落分析，细胞于半固体培养体系中进行集落分析，MNC的的CFU-GM和和BFU-E集落密度都有上升，下降的过程，而集落密度都有上升，下降的过程，而CD34+富集细胞集落密度始终呈下降趋势，相似的是两者富集细胞集落密度始终呈下降趋势，相似的是两者BFU-E到第到第3周就很难检测到了。周就很难检测到了。集落密度集落密度=集落集落/细胞数细胞数造血干造血干/祖细胞总集落扩增分析祖细胞总集落扩增分析总集落数总集落数=集落密度集落密度*细胞总数细胞总数 MNC的的CFU-GM和和BFU-E的扩增倍数在的扩增倍数在14天达到最大天达到最大值，然后开始下降。值，然后开始下降。CD34+富集细胞的富集细胞的CFU-GM第第35天天达到最大值，达到最大值，CFU-E在第在第14天达到最大值。后者的天达到最大值。后者的CFU-GM最大扩增倍数远大于前者。最大扩增倍数远大于前者。l 分析可以看出，分析可以看出，MNC的集落在培养的集落在培养过程中其集落密度和集落数量都曾实过程中其集落密度和集落数量都曾实现了增高。现了增高。l 而而CD34+富集细胞的集落只实现了富集细胞的集落只实现了数量上的扩增，单个细胞所形成的集数量上的扩增，单个细胞所形成的集落数并没有明显的增高过程。落数并没有明显的增高过程。显示，显示，MNC的的CD34+细胞的扩增倍数在第细胞的扩增倍数在第14天达天达到了最大值，随后开始下降，到了最大值，随后开始下降，CD34+富集细胞则如终富集细胞则如终呈上升趋势，在第呈上升趋势，在第35天达到了最大值。天达到了最大值。经过体外长期培养，由经过体外长期培养，由CD34+富集细胞培养所得富集细胞培养所得的的CD34+细胞总数和细胞总数和CFU-GM（粒细胞（粒细胞-单核细胞集单核细胞集落生成单位）总数均高于落生成单位）总数均高于MNC。小结小结l经过体外培养，培养前期经过体外培养，培养前期MNC的的CD34-可可能对能对CD34+细胞及集落形成细胞的扩增有细胞及集落形成细胞的扩增有促进作用；促进作用；l而而CD34+富集细胞在培养过程中分化趋势富集细胞在培养过程中分化趋势始终大于扩增，其总细胞的大量扩增则说始终大于扩增，其总细胞的大量扩增则说明在培养中存在大量分化。明在培养中存在大量分化。讨论与总结讨论与总结lMACS技术在实验室处理低细胞量情况下，是技术在实验室处理低细胞量情况下，是目前纯化目前纯化CD34+细胞较好的方法。细胞较好的方法。lCD34+细胞具有良好的扩增潜力，通过体外培细胞具有良好的扩增潜力，通过体外培养，养，5周内即可以得到更多的周内即可以得到更多的CFU-GM形成细形成细胞和胞和CD34+细胞。细胞。lCD34+细胞的大量扩增为造血干细胞的大量扩增为造血干/祖细胞的定祖细胞的定向诱导分化提供了有利条件。向诱导分化提供了有利条件。