基因诊断和基因治疗(1)ppt课件.ppt

基因基因诊断和基因治断和基因治疗南通大学医学院生化教研室南通大学医学院生化教研室沈沈 勤勤1.概念：概念：基因基因是携是携带生物生物遗传信息的基本功能信息的基本功能单位，是位，是位于染色体上的一段特定位于染色体上的一段特定DNA序列。基因的改序列。基因的改变，会会导致各种表型的改致各种表型的改变，进而引起疾病的而引起疾病的发生。生。将基因或其将基因或其组成部分成部分发生异常的疾病生异常的疾病统称称为基因病基因病。2.基因病分基因病分为三大三大类：一、一、单基因病基因病：由由单个基因突个基因突变引起的一引起的一类疾病。疾病。如：血友病、地中海如：血友病、地中海贫血等。血等。二、二、多基因病多基因病：由多个基因突：由多个基因突变综合作用引起的合作用引起的 疾病。如：疾病。如：恶性性肿瘤、高血瘤、高血压、动脉硬化、脉硬化、糖尿病、先天畸形等、糖尿病、先天畸形等、三、三、获得性基因病得性基因病：指外源基因（：指外源基因（DNA）侵入，）侵入，在机体在机体产生疾病，一旦将其清除便可痊愈。生疾病，一旦将其清除便可痊愈。如：艾滋病及各种微生物感染病。如：艾滋病及各种微生物感染病。3.第一第一节 基因基因诊断断 （DNA diagnosis）一、基因一、基因诊断的概念和基本概况断的概念和基本概况临床床诊断断生化学生化学诊断断免疫学免疫学诊断断临床疾病床疾病诊断四种方式：断四种方式：以疾病表型改以疾病表型改变为依据。依据。（细胞形胞形态结构构变化、代化、代谢产物异常、特定蛋白分子物异常、特定蛋白分子识别差异等）差异等）基因基因诊断断对患者基因直接分析患者基因直接分析4.基因基因诊断定断定义（概念）：（概念）：基因基因诊断断是利用是利用现代分子生物学和分子代分子生物学和分子遗传学的技学的技术方法，直接方法，直接检测患者体内基因患者体内基因结构及构及其表达水平是否正常，从而其表达水平是否正常，从而对疾病作出疾病作出诊断或断或辅助助诊断。断。基因基因诊断是在断是在DNA/RNA水平水平检测分析基因的分析基因的存在、存在、结构构变异和表达状异和表达状态，与，与传统诊断方法断方法比比较有其特点：有其特点：5.基因基因诊断的特点：断的特点：1、病因、病因诊断：断：直接瞄准病理基因，不直接瞄准病理基因，不仅对表型出表型出现的疾病作出的疾病作出诊断，断，还可能可能发现潜在的致病因素，如潜在的致病因素，如:确定有确定有遗传家族史的人携家族史的人携带致病基因。致病基因。2、特异性、特异性强、灵敏度高：、灵敏度高：选用特定基因序列作用特定基因序列作为探探针，单拷拷贝基因采用高度基因采用高度扩增增PCR技技术。3、稳定性高定性高4、诊断范断范围广，适广，适应性性强目的基因是否目的基因是否处于活化状于活化状态均可。均可。样品可品可长期保存。期保存。可可检测正在生正在生长的病原体或潜在病原体。的病原体或潜在病原体。（与以疾病表型改（与以疾病表型改变为依据的依据的 诊断技断技术相比）相比）6.基因基因诊断的基本概况：断的基本概况：伴随分子生物学理伴随分子生物学理论技技术的的发展而建立和展而建立和发展。展。DNA双螺旋双螺旋 遗传密密码破破译 DNA重重组 癌基因与抑癌基因研究癌基因与抑癌基因研究 地中海地中海贫血病基因治血病基因治疗和逆和逆转录病毒病毒载体开体开发 PCR、分子、分子杂交等一系列技交等一系列技术发展展7.二、基因二、基因诊断的断的对象象1、病原生物的侵入、病原生物的侵入病原体：病毒、支原体、病原体：病毒、支原体、细菌、寄生虫菌、寄生虫检查诊断方法：断方法：显微微镜、免疫学方法、基因、免疫学方法、基因诊断等。断等。尤其是当无抗体尤其是当无抗体时，基因，基因诊断成断成为唯一手段。唯一手段。2、先天、先天遗传性疾病性疾病遗传性疾病性疾病:发病的原因病的原因为特定基因的突特定基因的突变。8.肿瘤的瘤的发生：生：发病机理尚不病机理尚不请。初步初步认为是个是个别细胞基因突胞基因突变而引起的而引起的 细胞无限增殖胞无限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）（包括抑癌基因和癌基因）3、后天基因突、后天基因突变引起的疾病引起的疾病二、基因二、基因诊断的断的对象象9.（1）用核心）用核心顺序的串序的串联重复序列重复序列组成探成探针进行行杂交研交研 究，可同究，可同时检出具有高度出具有高度多多态性位点性位点。（2）用）用southern 杂交得到交得到DNA指指纹图谱个体个体识别、亲子子鉴定、法医物定、法医物证4、其他、其他二、基因二、基因诊断的断的对象象遗传稳定，个体特异，因而用于法医和定，个体特异，因而用于法医和亲子子鉴定。定。10.基因基因诊断的基本策略：断的基本策略：1、检测已知的能已知的能产生某种特定功能蛋白的基因生某种特定功能蛋白的基因 这些基因根据其特定功能已被克隆，并被定位些基因根据其特定功能已被克隆，并被定位在染色体上，基因序列亦被在染色体上，基因序列亦被测定，致病定，致病时的基因改的基因改变亦亦较清楚。清楚。如：已被克隆的病毒、如：已被克隆的病毒、细菌、霉菌和寄生虫的基因、菌、霉菌和寄生虫的基因、与致病有关的癌基因、抗癌基因、与致病有关的癌基因、抗癌基因、地中海地中海贫血、苯丙血、苯丙酮尿症等尿症等遗传病基因。病基因。11.2、检测与某种与某种遗传标志志连锁的致病基因的致病基因遗传连锁同一染色体相同一染色体相邻的二个或二个以上的基因的二个或二个以上的基因或限制性或限制性酶切位点，由于位置十分靠近，在切位点，由于位置十分靠近，在遗传时分离分离几率很低，常一起几率很低，常一起遗传-称称连锁。染色体染色体遗传连锁图用限制性内切用限制性内切酶酶切位点作切位点作遗传标志，定位与之相志，定位与之相连锁的正常基因与致病基因，建立相的正常基因与致病基因，建立相应的的遗传连锁图谱。定位性克隆定位性克隆根据根据遗传连锁图进行定位性克隆。比行定位性克隆。比较正常正常和异常基因的差和异常基因的差别，可找出，可找出导致致遗传病的分子缺陷。病的分子缺陷。定位性克隆定位性克隆策略是当前基因策略是当前基因诊断的重要基断的重要基础。12.3、检测表型克隆基因表型克隆基因针对多基因病（如：重度肥胖、哮喘、高血多基因病（如：重度肥胖、哮喘、高血压、癫痫、精神病、多种自身免疫性疾病）。、精神病、多种自身免疫性疾病）。表型克隆技表型克隆技术是将有关表型与基因是将有关表型与基因结构构结合，直接合，直接分离分离该表型的相关基因，并表型的相关基因，并对疾病相关的疾病相关的一一组基因基因进行行克隆，然后用作多种探克隆，然后用作多种探针，来，来诊断多基因断多基因遗传病。病。该策略既不需策略既不需预先知道基因的先知道基因的生化功能或生化功能或图谱定位，也不受定位，也不受基因数目及其相互作用方式的基因数目及其相互作用方式的影响。影响。方法：方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和异常基因分析正常和异常基因组寻找两者之找两者之间的差异序列的差异序列2、基因、基因组错配配筛选技技术：寻找两者的全同序列，分找两者的全同序列，分离、离、鉴定与疾病相关的基因，确定定与疾病相关的基因，确定导致疾病的分子致疾病的分子缺陷缺陷13.基因基因诊断的基本步断的基本步骤：1、获得待得待检样品：提取核酸品：提取核酸（PCR提高灵敏度提高灵敏度)2、制、制备和和标记核酸探核酸探针3、基因、基因检测分析分析 14.三、基因三、基因诊断的常用技断的常用技术l核酸分子核酸分子杂交交l聚合聚合酶链反反应（PCR）l限制性片段限制性片段长度多度多态性（性（RELP）l扩增片段增片段长度多度多态性（性（AFLP）l等位基因特异的寡核苷酸（等位基因特异的寡核苷酸（ASO）l单链构象多构象多态性（性（SSCP）l基因芯片基因芯片15.1、核酸分子、核酸分子杂交交原理：原理：利用核酸的利用核酸的变性、复性及碱基互性、复性及碱基互补的性的性质，用，用已知基因的核酸序列作已知基因的核酸序列作探探针，与，与变性后的性后的单链基因基因组DNA/RNA杂交，交，检测核酸核酸样品中是否品中是否存在与探存在与探针互互补的同源核酸序列，的同源核酸序列，进行行DNA或或RNA定性定量分析。定性定量分析。基因基因检验的两个必要条件：的两个必要条件：1、必需的特异探、必需的特异探针（标记的的）2、必需的基因、必需的基因组DNA16.核酸分子核酸分子杂交核酸印迹交核酸印迹杂交交lDNA印迹印迹杂交（交（Southern blot）lRNA印迹印迹杂交交 （Nouthern blot）l斑点印迹斑点印迹杂交交 （Dot-blot）l原位原位杂交交 (situ hybridization)17.核酸印迹核酸印迹杂交基本交基本过程：程：提取提取DNA或或RNA 酶切切 凝胶凝胶电泳泳 胶胶变 性性处理（理（DNA）转印核酸片段到印核酸片段到NC膜上。膜上。（RNA可直接用可直接用变性胶性胶电泳泳，转膜）膜）1、制、制备样品：品：18.核酸印迹核酸印迹杂交基本交基本过程：程：（2）制）制备探探针：探探针：一段能和待：一段能和待检测核酸分子按碱基互核酸分子按碱基互补配配对 原原则而而结合的核酸分子片段。合的核酸分子片段。探探针需要需要标记可直接可直接检测的元素或分子。的元素或分子。如：同位素、如：同位素、荧光、生物素等光、生物素等19.核酸印迹核酸印迹杂交基本交基本过程：程：核酸印迹核酸印迹杂交可交可检测pg水平的靶分子水平的靶分子（4）检测：方法依方法依标记的探的探针而不同而不同 *放射性同位素放射性同位素 *生物素生物素 *地高辛地高辛 *荧光素光素（3）杂交：交：预杂交封交封闭非特异性非特异性结合位点合位点 杂交探交探针与核酸分子与核酸分子结合合20.核酸印迹核酸印迹杂交基本交基本过程：程：21.2、聚合、聚合酶链反反应（PCR)原理：原理：以待以待扩增增DNA为模板模板，在互，在互补模板两端序列的模板两端序列的寡核寡核苷酸引物苷酸引物介介导下，通下，通过耐高温耐高温DNA聚合聚合酶催化下，催化下，按半保留复制机制延模板按半保留复制机制延模板链延伸，快速、特异地延伸，快速、特异地扩增特定的增特定的DNA。一种体外模一种体外模拟自然自然DNA复制复制过程的核酸程的核酸扩增技增技术。（无（无细胞分子克隆技胞分子克隆技术）。）。22.耐高温耐高温DNA聚合聚合酶Taq酶寡核苷酸引物：寡核苷酸引物：设计引物和确定退火温度是引物和确定退火温度是PCR 成功的关成功的关键。PCR的基本的基本过程：（循程：（循环程序）程序）变性（性（95）退火（退火（555565）延伸（延伸（72）35分分401分分100bp/1分分源自水栖高温菌，最适反源自水栖高温菌，最适反应温度温度为72，且，且经90以上加温后仍可在温度恢复后复性。以上加温后仍可在温度恢复后复性。23.（呈（呈2n 扩增速度）增速度）PCR基本过程和原理特点：特异性特点：特异性强 灵敏度高灵敏度高样品可以是：品可以是：毛毛发、血痕、血痕 单细胞、胞、病原体、病原体、肿瘤残留物、瘤残留物、犯罪犯罪现场遗留物留物24.基因基因诊断中常用的断中常用的PCR技技术：（1）、）、DNA PCR：（2）、）、RT-PCR：以以DNA为模板，模板，扩增特定核苷酸序列。用于增特定核苷酸序列。用于检测特特定基因片段的存在，分析定基因片段的存在，分析鉴定基因突定基因突变。以以总RNA或或mRNA为模板，逆模板，逆转录为cDNA后后扩增。用增。用于于检测特定基因表达水平的主要方法之一。特定基因表达水平的主要方法之一。（3）、）、PCR-SSCP：检测基因未知突基因未知突变的常用技的常用技术。简单、快捷、灵敏。、快捷、灵敏。25.（4）、多重）、多重 PCR：指在一次指在一次PCR反反应中加入多中加入多对引物，同引物，同时扩增增DNA序列上不同序列片段的一种序列上不同序列片段的一种PCR技技术。用于一些。用于一些“超大超大”基因中大片段缺失分析。基因中大片段缺失分析。（5）、原位）、原位 PCR：直接用直接用组织切片和切片和细胞胞进行行PCR或或RT-PCR，在，在组织、细胞原位胞原位检测单拷拷贝或低拷或低拷贝的特点基因序列。的特点基因序列。（6）、）、实时定量定量 PCR：借助特异性借助特异性结合合DNA的的荧光染料，光染料，实时动态检测PCR扩增的增的DNA量的量的变化。化。26.其他重要的其他重要的PCR衍生技衍生技术反向反向PCR（IPCR）标记引物引物PCR（labelled primers PCR）锚定定PCR（anchored PCR）差异展示差异展示PCR（DD-PCR）（见书“分子生物学技分子生物学技术”章章节）27.3、限制性片段、限制性片段长度多度多态性（性（RFLP）检出方法：出方法：Southern 印迹印迹概念：概念：用同一限制性内切用同一限制性内切酶完全切割同一物种的不同个体的基完全切割同一物种的不同个体的基因因组DNA，出，出现分子分子质量不同的同源片段，量不同的同源片段，这种由限种由限制性内切制性内切酶酶切位点切位点变化化导致的致的DNA片段差异，称限片段差异，称限制性片段制性片段长度多度多态性（性（RFLP）。）。人人类基因基因组中由中由中性突中性突变导致个体致个体间核苷酸核苷酸的差异称的差异称DNA多多态性性28.RFLP类型：型：2、由于、由于链内内发生生较大片段的缺失、重复、插大片段的缺失、重复、插入和重入和重 排排导致致DNA顺序的序的变化，因而化，因而酶切片切片段改段改变 序列多序列多态性性。1、单个碱基的突个碱基的突变引起引起酶切位点的切位点的变化化 点多点多态性性致病基因附近或内部一般存在致病基因附近或内部一般存在RFLP,可用于可用于连锁分析的基因分析的基因诊断。断。29.（四）（四）扩增片段增片段长度多度多态性（性（AFLP）应用于基因突用于基因突变性性质不明的不明的连锁分析。分析。AFLP串串联重复的短片段的重复的短片段的长度多度多态性性通通过PCR扩增增,经限制性内切限制性内切酶酶切后切后电泳泳,产生生显示示扩增片段多增片段多态性。性。30.AFLP原理：原理：首先利用可首先利用可产生生粘性末端粘性末端的限制性内切的限制性内切酶酶切研切研究究对象的基因象的基因组序列，序列，产生不同生不同长度的度的酶切片段。然切片段。然后，将后，将这些些酶切片段与含有与其有共同粘性末段的切片段与含有与其有共同粘性末段的人人工接工接头连接接，形成，形成模板模板。为达到达到选择性性扩增的目的，增的目的，再在模板末端添加具有再在模板末端添加具有选择性核苷酸（性核苷酸（13个）的不个）的不同引物同引物，然后，然后PCR扩增，增，结果只有那些两端序列与果只有那些两端序列与选择性核苷酸配性核苷酸配对的的酶切片段被切片段被扩增。最后将被增。最后将被扩增的增的片段在高分辨率的片段在高分辨率的测序凝胶上序凝胶上电泳，泳，这样其多其多态性即性即根据根据扩增片段的增片段的长度与数量的不同而被分开。度与数量的不同而被分开。PCR扩增增产物即等位片段之物即等位片段之间差差别只有几个只有几个bp。31.5、等位基因特异的寡核苷酸、等位基因特异的寡核苷酸（ASO）方方法法：1、合成两种探、合成两种探针：已知突已知突变位点的核苷酸序列（位点的核苷酸序列（M M）正常基因碱基序列（正常基因碱基序列（N N）2、杂交交实验结果：果：M+N-受受检者是突者是突变基因的基因的纯合子合子 M-N+受受检者是不存在突者是不存在突变基因基因M-N-受受检者的缺陷基因可能是一种新的突者的缺陷基因可能是一种新的突变类型型M+N+受受检者是突者是突变基因的基因的杂合子合子原理：原理：已知基因突已知基因突变部位和性部位和性质，合成基因特异的核苷酸探，合成基因特异的核苷酸探针（20bp），），标记后与受后与受检者者DNA杂交交诊断。（可与断。（可与PCR联用：用：PCR-ASO）32.6、单链构象多构象多态性（性（SSCP）日本日本Orita等研究等研究发现，单链DNA片段呈复片段呈复杂的的空空间折叠构象，当有一个碱基折叠构象，当有一个碱基发生改生改变时，会或，会或多或多或 少地影响其空少地影响其空间构象，使构象构象，使构象发生改生改变，空空间构象有差异的构象有差异的单链DNA分子在聚丙分子在聚丙烯酰胺胺凝胶中受排阻大小不同凝胶中受排阻大小不同.因此，通因此，通过非非变性聚丙性聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳(PAGE)，可以非常可以非常 敏敏锐地将构地将构象上有差异的分子分离开象上有差异的分子分离开.PCR-SSCP33.PCR-SSCP基本基本过程程PCR扩增靶增靶DNA将特异的将特异的PCR扩增增产物物变性后快速复性性后快速复性;将将单 链DNA进行非行非变性聚丙性聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳;通通过放射性自放射性自显影、影、银染或溴化乙染或溴化乙锭显 色分色分析析结果果.若若发现单链DNA带迁移率与正常迁移率与正常对照照的相比的相比发生改生改变，就可以判定，就可以判定该链构象构象发生改生改变，进而推断而推断该DNA片段中有碱基突片段中有碱基突变.34.7、基因芯片、基因芯片 将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与然后与标记的的样品品进行行杂交，通交，通过检测根据根据杂交分子和未交分子和未杂交分子信号的交分子信号的强弱弱进而判断而判断样品中靶分子的数量。品中靶分子的数量。基本原理：基本原理：（生物集成模片、（生物集成模片、DNA阵列、或寡核苷酸微芯片）列、或寡核苷酸微芯片）35.基因芯片技基因芯片技术：36.目的：目的：检测外源性基因的侵入外源性基因的侵入目标：1 1、微生物、微生物2 2、病毒、病毒 如：如：HIVHIV（致艾滋病（致艾滋病 AIDSAIDS）3 3、寄生虫、寄生虫、4 4、不易体外培养的病原体（毒性大、不易体外培养的病原体（毒性大肠杆菌、麻杆菌、麻风分枝分枝 杆菌）杆菌）5 5、实验室培养的病原体（克立氏体）室培养的病原体（克立氏体）四、基因四、基因诊断的断的 临床床应用用:1、在感染性疾病、在感染性疾病检测中中应用用37.艾滋病与艾滋病与HIV病毒病毒艾滋病由艾滋病由HIV通通过接触、血液、血制品及母接触、血液、血制品及母婴传播感染所致。播感染所致。HIV特异地侵犯特异地侵犯辅助性助性T细胞胞（CD4），引起人体），引起人体细胞免疫胞免疫严重缺陷，重缺陷，导致致顽固的机会性感染，固的机会性感染，恶性性肿瘤和神瘤和神经系系统损伤。HIV 感染后，感染后，95%感染者感染者5个月可个月可检出抗体（也出抗体（也有有3-4年仍不能年仍不能检出抗体）。有必要出抗体）。有必要进行行PCR技技术检测。38.艾滋病与艾滋病与HIV病毒病毒检测技技术：巢式巢式-PCR、Southern、DNA序列分析序列分析引物的引物的设计：应在保守区（基因：在保守区（基因：pol,env,gag,tat)病毒特点：病毒特点：HIV病毒由两条病毒由两条单链RNA组成，成，9.7k/RNA，主要基因主要基因结构和构和组成形成与其他逆成形成与其他逆转录病毒相同，但病毒相同，但较之复之复杂，故称复，故称复杂反反转录病毒病毒HIV属反属反转录病毒即病毒即单链RNA反反转录成双成双链DNA，进入宿主入宿主细胞染色体。胞染色体。39.非典型性肺炎（非典型性肺炎（SARS）由一种新型冠状病毒（由一种新型冠状病毒（SARS-CoV）引起，多种）引起，多种途径途径传播，播，传染性染性强、高致死率的急性疾病。、高致死率的急性疾病。诊断依靠：断依靠：流行病学、流行病学、临床表床表现、放射、放射诊断、断、血清学（血清学（荧光免疫、光免疫、ELISA）PCR作作为一种灵敏的早期病原学一种灵敏的早期病原学诊断必不可少断必不可少 （关（关键是引物的合成）是引物的合成）40.2、在、在遗传病病检测中的中的应用用 产前前诊断断 检测妊娠妊娠812周的周的绒毛毛DNA或羊水或羊水细胞胞 PCR诊断一系列断一系列遗传疾病疾病 镰刀状刀状细胞胞贫血的血的诊断断 方法：方法：RFLP诊断断 Mst酶切切识别序列：序列：CCTCCTNANAGGGG 切割正常切割正常链序列：序列：CCTCCTGAGAGG GG 不切割突不切割突变序列：序列：CCTCCTG GT TGGGG ASOASO探探针诊断断41.3、在、在肿瘤瘤检测中的中的应用用原癌基因原癌基因 生物正常生物正常细胞基因中胞基因中编码关关键性性调控蛋白的控蛋白的 癌基因癌基因抑癌基因抑癌基因 一一类抑制抑制细胞增殖的基因，其失活可引起胞增殖的基因，其失活可引起细 胞胞转化。化。两两类基因基因协同同调控，使控，使细胞生胞生长处于平衡状于平衡状态。42.癌基因激活癌基因激活变化及化及检测：1、基因、基因扩增：即染色体某区段基因拷增：即染色体某区段基因拷贝数增加，或癌基数增加，或癌基 因的因的扩增。增。检测方法：方法：Southern 杂交交 定量定量PCR2、基因的、基因的过量表达：包括基因量表达：包括基因扩增基增基础上的上的过量表达及非量表达及非 DNA水平的水平的过量表达。量表达。检测方法：方法：Northern 杂交交 RT-PCR3、点突、点突变：检测方法方法为各种基于各种基于PCR的方法。的方法。43.抑癌基因的抑癌基因的检测：Southern PCR大片段的缺失、和点突大片段的缺失、和点突变*两个等位抑癌基因突两个等位抑癌基因突变才能引起才能引起肿瘤，需瘤，需检出两个等位抑癌基因。出两个等位抑癌基因。方法：方法：RFLP结合合PCR，进行缺失行缺失检测 点突点突变主要采用主要采用PCR44.肿瘤瘤标志物：志物：指特征性存在于指特征性存在于恶性性肿瘤或由瘤或由恶性性肿瘤瘤细 胞异常胞异常产生的物生的物质或宿主或宿主对肿瘤反瘤反应而而产 生的物生的物质。（1）酶类肿瘤瘤标志物志物（2）激素）激素类标志物志物（3）胚胎抗原）胚胎抗原（4）特殊蛋白）特殊蛋白标志物志物（5）糖蛋白）糖蛋白类抗原抗原（6）血中癌基因蛋白）血中癌基因蛋白（7）唾液酸和唾液酸）唾液酸和唾液酸酰基基转移移酶（8）多胺）多胺免疫免疫组化化筛选提高提高检出率出率45.法医学法医学鉴定定针对人人类DNA 遗传差异差异进行的个体行的个体识别和和亲子子鉴定。定。常用技常用技术:DNA指指纹分析（分析（VNTR）短串短串联重复序列（重复序列（STR）遗传特征分析特征分析PCR-扩增片段增片段长度多度多态性（性（AmP-FLP)PCR-mtDNA技技术根据根据可可变串串联重复序列重复序列（小（小卫星星DNA）多）多态性性 高度的个体特异性高度的个体特异性46.DNA指指纹（图谱）分析：）分析：、选择核心序列作探核心序列作探针，选在核心序列上无切割在核心序列上无切割 位点的限制性内切位点的限制性内切酶，酶解解样品，品，Southern blot得到得到DNA指指纹图谱。针对可可变串串联重复序列（重复序列（VNTR）（VNTR是判断个体的是判断个体的遗传标志）志）、针对VNTR侧翼保守区翼保守区序列序列设计探探针，用，用PCR 对该区区扩增，增，电泳得到个体之泳得到个体之间长度不同的条度不同的条 带图谱。（。（VNTR片段片段较长PCR不易不易扩增）。增）。47.第二第二节 基因治基因治疗（gene therapuy)概念：概念：将外源正常基因将外源正常基因导入靶入靶细胞，以胞，以纠正或正或补偿因缺陷和异常基因引起的疾病，达到治因缺陷和异常基因引起的疾病，达到治疗目的。目的。导入的基因可以与缺陷基因入的基因可以与缺陷基因对应、在体内表达具有特异功、在体内表达具有特异功能的同源基因、也可以是与缺陷基因无关的治能的同源基因、也可以是与缺陷基因无关的治疗基因。基因。概念的概念的扩展：展：凡是采用分子生物学方法原理，将某种凡是采用分子生物学方法原理，将某种遗传物物质转移移到患者到患者细胞内，使其在体内胞内，使其在体内发挥作用，达到治作用，达到治疗目的目的的方法，都可称的方法，都可称为基因治基因治疗。48.基因治基因治疗策略策略:总原原则：直接直接补替缺陷基因替缺陷基因抑制非正常基因抑制非正常基因产物表达物表达间接接调节机体本身免疫系机体本身免疫系统的抗病能力。的抗病能力。利用外源基因利用外源基因对病病变细胞造成特异性胞造成特异性杀伤49.1、基因、基因矫正将致病基因的碱基正将致病基因的碱基进行行纠正，而正常部分予以保留。正，而正常部分予以保留。2、基因置、基因置换用正常基因通用正常基因通过体内基因同源重体内基因同源重组，原位置，原位置换病病变细 胞内的致病基因，使胞内的致病基因，使细胞内的胞内的DNA完全恢复正常完全恢复正常3、基因增、基因增补将目的基因将目的基因导入病入病变细胞或其它胞或其它细胞，不去除异常胞，不去除异常 基因，而是通基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达目的基因的非定点整合，使其表达 产物物补偿缺陷基因的功能或使原有功能得以加缺陷基因的功能或使原有功能得以加强。4、基因失活利用反、基因失活利用反义技技术特异封特异封闭基因表达，抑制有害基因基因表达，抑制有害基因 的表达。的表达。5、免疫、免疫调节将抗体、抗原或将抗体、抗原或细胞因子的基因胞因子的基因导入病人体内，入病人体内，改改变病人免疫状病人免疫状态，达到，达到预防和治防和治疗的目的。的目的。基因治基因治疗的策略：的策略：50.6、调节性基因治性基因治疗：导入入编码调控蛋白的基因，治控蛋白的基因，治疗 基因表答异常的疾病基因表答异常的疾病7、化、化疗保保护性基因治性基因治疗：导入入单相或多相相或多相细胞毒性胞毒性药 物的抗性基因，使正常物的抗性基因，使正常细胞耐受化胞耐受化疗药物的能力大物的能力大 大提高。大提高。8、特异性、特异性细胞胞杀伤性基因治性基因治疗：利用：利用DNA重重组技技术构建构建 特异性特异性杀伤靶靶细胞胞为目目标的的“奇异奇异弹头”，“弹头”部分是部分是 分子重分子重组的各种生物的各种生物细胞毒素，它胞毒素，它们以以酶催化方式催化方式发挥 抑制蛋白合成作用，造成抑制蛋白合成作用，造成细胞胞杀伤。9、生殖、生殖细胞基因治胞基因治疗：生殖：生殖细胞或胚胎干胞或胚胎干细胞胞补偿性治性治疗51.基因治基因治疗基本程序基本程序;方法：方法：1、体外法、体外法（ex vivo):2、体内法、体内法 (in vivo):将受体将受体细胞在体外培养，胞在体外培养，转入外源基因，入外源基因，经适当适当选择系系统，将重，将重组的受体的受体细 胞回胞回输患者患者体内，以改善症状。（普遍采用）体内，以改善症状。（普遍采用）直接将外源基因直接将外源基因导入体内有关的入体内有关的组织器官器官,使其使其进入相入相应的的细胞并胞并转录、表达而、表达而发挥治治疗作用。作用。基本程序：基本程序：选择目的基因目的基因选择基因基因载体体选择靶靶细胞胞基因基因转移移外源基因表达及外源基因表达及检测回回输体内体内52.治治疗基因的来源：基因的来源：1、野生型基因：、野生型基因：-单基因缺陷基因缺陷遗传病基因病基因 -反反义核酸封核酸封闭活化的原癌基因活化的原癌基因 -转入相关的抑癌基因，抑制入相关的抑癌基因，抑制肿瘤瘤2、重、重组DNA和分子克隆技和分子克隆技术，人工合成特异，人工合成特异 基因。基因。1、选择治治疗的目的基因的目的基因53.用于基因治用于基因治疗的基因的基因应满足以下条件：足以下条件：（1）体内）体内仅少量表达就可少量表达就可显著改善症状。著改善症状。（2）该基因的基因的过量表达不会量表达不会对机体造成危害、机体造成危害、（3）在抗病毒和抗病原体的基因治）在抗病毒和抗病原体的基因治疗中，所中，所选 择的靶基因的靶基因应在病毒和病原体的生活史中在病毒和病原体的生活史中 起重要作用，并且起重要作用，并且该序列是特异的。序列是特异的。54.理想的理想的载体具有以下特征：体具有以下特征：1 1、容易生、容易生产-商商业化生化生产，广泛，广泛应用，易运用，易运输，易保存，易保存2 2、持、持续表达表达-一旦一旦转入体内，入体内，应能在一定能在一定时间内持内持续表达基因表达基因产 物，或能通物，或能通过某种方法精某种方法精细调节其表达。其表达。3 3、弱免疫源、弱免疫源-转入后不入后不应引起免疫反引起免疫反应。4 4、组织靶向性靶向性-定向定向输入某种入某种细胞。胞。5 5、包装容量、包装容量载体体对转染基因的大小染基因的大小应没有限制。没有限制。6 6、复制、分裂和整合能力：特异性定位整合，或以游离基因形式、复制、分裂和整合能力：特异性定位整合，或以游离基因形式 存在于存在于细胞核内。胞核内。7 7、能感染分裂期、能感染分裂期细胞和未分裂期胞和未分裂期细胞胞2、选择基因基因载体：体：55.基因基因载体：体：非病毒非病毒载体体（裸（裸DNA、脂、脂质体）体）病毒病毒载体体 （反（反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒）病毒、腺病毒、腺相关病毒）分分类：优点：点：大量生大量生产，毒性小，低免疫性，毒性小，低免疫性缺点：效率低。缺点：效率低。优点：多数病毒可感染特异点：多数病毒可感染特异细胞，不易降解，胞，不易降解，RNARNA病毒能整合到宿主染色体，表达病毒能整合到宿主染色体，表达 水平高等。水平高等。56.病毒介病毒介导的基因的基因转移移1、逆、逆转录病毒：病毒：正正链RNA病毒病毒57.逆逆转录病毒病毒结构构:基因基因组组成：成：（1）5帽子；帽子；3尾巴；尾巴；（2）每个每个单链RNA含含6个区：个区：5-LTR（长末端重复序列）末端重复序列）+（组装所需的非装所需的非编码序列）序列）gag（编码衣壳衣壳结构蛋白基因）构蛋白基因）pol（编码反反转录酶基因）基因）env（编码外壳蛋白基因）外壳蛋白基因）3-LTR58.逆逆转录病毒生活周期病毒生活周期:1、感染靶、感染靶细胞胞2、利用自身、利用自身编码的逆反的逆反转录酶，以，以RNA为模板合成模板合成DNA。3、将病毒、将病毒DNA转运至宿主运至宿主细胞核胞核4、病毒、病毒DNA整合到宿主染色体整合到宿主染色体5、以病毒、以病毒DNA为模板模板转录RNA6、在、在细胞中翻胞中翻译Gag、Pol和和Env蛋白蛋白7、形成衣壳，、形成衣壳，RNA单链和反和反转录酶一起包装一起包装进衣壳。衣壳。8、形成病毒、形成病毒颗粒并分泌到胞外。粒并分泌到胞外。59.逆逆转录病毒病毒病毒病毒RNARNA宿主宿主细胞胞RTRTRT逆逆转录酶cDNAcDNA双双双双链链插入插入插入插入基因基因基因基因组组DNADNA逆逆转录病毒感染病毒感染过程程病毒病毒病毒病毒RNARNA60.构建逆构建逆转录病毒病毒载体：体：（1）构建）构建重重组野生性病毒：野生性病毒：插入相关外源基因，改插入相关外源基因，改造成造成DNA载体（包括插体（包括插入入选择性性标记），替代），替代病毒的病毒的编码基因。基因。（2）制）制备辅助助细胞（胞（293T细胞），胞），为载体体DNA提提供其供其丧失的功能。失的功能。（3）载体体DNA导入入辅助助细胞，胞，产生病毒生病毒载体。体。（4）用病毒）用病毒载体感染体感染细胞，胞，外源基因在宿主外源基因在宿主细胞中胞中表达。表达。61.逆逆转录病毒病毒载体的缺陷：体的缺陷：1、只能、只能转染染处于增殖状于增殖状态的的细胞胞2、所携、所携带的外源基因不能太大。的外源基因不能太大。3、感染依、感染依赖靶靶细胞表面受体的限制胞表面受体的限制4、理、理论上不上不扩散其它散其它细胞，但某些情况会造成胞，但某些情况会造成 野生型病毒爆野生型病毒爆发。5、有致、有致细胞癌胞癌变的可能。的可能。6、逆、逆转录病毒不能耐受病毒不能耐受纯化和化和浓缩过程。程。62.腺相关病毒腺相关病毒(AVV)一种小的、非致病的、一种小的、非致病的、单链DNA病毒。是从属病毒，需病毒。是从属病毒，需要其他基因才能复制。要其他基因才能复制。结构：构：rep基因基因编码病毒的复制、整合功能所需蛋白病毒的复制、整合功能所需蛋白 cap基因基因编码病毒病毒结构构组分分 ITRs序列反向末端重复，定序列反向末端重复，定义基因的开始和基因的开始和 结束，制束，制约DNA序列大小，包裹入序列大小，包裹入 衣壳。衣壳。细胞胞对AVV病毒的病毒的亲和力高，和力高，AVV载体适用范体适用范围广泛。广泛。63.骨髓骨髓细胞、皮肤成胞、皮肤成纤维细胞、肝胞、肝细胞、血管内皮胞、血管内皮细胞、肌胞、肌细胞胞选择原原则:1、较坚固，耐受固，耐受处理，易于由人体分离，便于理，易于由人体分离，便于输 回体内。回体内。2、具有增殖、具有增殖优势，生命周期，生命周期长，能存活几个月或几年，能存活几个月或几年，至病人的整个生命。至病人的整个生命。3、易于受外源、易于受外源遗传物物质的的转化。化。4、在、在选用病毒用病毒载体体时，目的基因具表达最好具有，目的基因具表达最好具有组织特异特异 性的性的细胞胞3、选择靶靶细胞胞（禁止使用生殖（禁止使用生殖细胞，只能用体胞，只能用体细胞）胞）64.1、骨髓、骨髓细胞：最被重胞：最被重视和常用的靶和常用的靶细胞。胞。常用常用细胞：胞：优点点：易接受各种易接受各种处理、理、已已积累丰富累丰富经验，多数多数遗传疾病疾病 涉及骨髓涉及骨髓细胞、胞、源自骨髓的源自骨髓的细胞遍布全身。胞遍布全身。缺点：缺点：-骨髓干骨髓干细胞含量少（占骨髓胞含量少（占骨髓细胞胞0.1%0.1%）-治治疗基因在核骨髓基因在核骨髓细胞表达胞表达时间短（几个月）。短（几个月）。-只有部分干只有部分干细胞有活性胞有活性 -造血干造血干细胞分化可能胞分化可能导致基因失活。致基因失活。-有些有些遗传疾病与骨髓干疾病与骨髓干细胞无关。胞无关。2、肝、肝细胞：是胞：是许多多遗传代代谢缺陷的靶缺陷的靶细胞。胞。3、皮肤、皮肤细胞：易于繁殖及胞：易于繁殖及转化。化。4、淋巴、淋巴细胞：易采集、分离，大量繁殖，胞：易采集、分离，大量繁殖，连续 多次多次输入入5、癌、癌细胞：胞：肿瘤治瘤治疗常用常用细胞。胞。65.方法：方法：1、物理法：、物理法：显微注射法微注射法电穿孔法穿孔法基因基因枪技技术2、化学法：、化学法：磷酸磷酸钙沉淀法沉淀法DEAE-葡萄糖法葡萄糖法脂脂质体法体法3、融合法、融合法4、病毒感染法、病毒感染法4、基因的、基因的转移移66.转染染细胞后的胞后的筛选：方法：方法：1、标记基因基因筛选法：法：2、基因缺陷型受体、基因缺陷型受体细胞的胞的选择性性3、基因共、基因共转染技染技术4、分子生物学方法、分子生物学方法:原位原位杂交交Southern杂交交斑点斑点杂交交目的基因或目的基因或标记基因作基因作为探探针。67.方法：方法：（目的基因和（目的基因和标记基因的表达）基因的表达）原位原位杂交、交、Nouthern杂交、交、RNA点点杂交交 （检测mRNA的的转录）免疫免疫组化染色（化染色（检测基因翻基因翻译出的蛋白出的蛋白质)5、外源基因表达的、外源基因表达的检测：68.6、回、回输体内体内将治将治疗性基因修性基因修饰的的细胞通胞通过不同方式回不同方式回输入体内，以入体内，以发挥治治疗效果。效果。如：如：-淋巴淋巴细胞胞经静脉回静脉回输入血入血 -造血造血细胞胞经自体骨髓移植自体骨髓移植 -皮肤成皮肤成纤维细胞胞经胶原包裹后埋入皮下胶原包裹后埋入皮下组织 69.1、肝、肝专一性表达：一性表达：磷酸磷酸烯醇式丙醇式丙酮酸酸羧基基酶启启动子子2、肌肉、肌肉专一性表达：肌苷激一性表达：肌苷激酶的的调控片段控片段3、乳腺、乳腺专一性表达：一性表达：酪蛋白，乳清酸蛋白酪蛋白，乳清酸蛋白4、黑色素、黑色素专一性表达一性表达:酪氨酸和酪氨酸相关蛋白（酪氨酸和酪氨酸相关蛋白（TRP)5、胶、胶质瘤瘤专一性表达：鞘磷酸碱性蛋白基因上游片段一性表达：鞘磷酸碱性蛋白基因上游片段6、肺癌、肺癌专一性表达：一性表达：人表面活性蛋白人表面活性蛋白A与目的基因一起重与目的基因一起重组入反入反转录病毒，用于基因靶向病毒，用于基因靶向表达。表达。组织专一性表达的一性表达的调节片段片段:70.基因治基因治疗的的应用及展望用及展望应用治用治疗：遗传病（学友病、囊性病（学友病、囊性纤维病、家族性高血病、家