基于细菌筛选及其特性研究的微生物综合实验教学_林伯坤.pdf

：基于细菌筛选及其特性研究的微生物综合实验教学林伯坤 刘 欣 郭莲仙 李林秋 邵军丽广东医科大学公共卫生学院 广东东莞 摘 要：本文介绍了基于细菌筛选及其特性研究的微生物综合实验教学设计，具体内容包括：设计思路、实验教学内容（细菌培养基配制和灭菌；细菌分离；细菌纯化和保存；革兰氏染色和形态特征；生化试验；药敏试验）、实验论文汇报（实验报告写成论文形式；实验论文点评）。笔者已经按照上述设计实施多年的实验教学（自 年至今），本文所总结的多年教学实践经验，可供开设微生物实验教学课程的高校同行参考。关键词：综合实验；微生物；蛋白酶；细菌筛选；实验论文 综合性实验是实验课程教学中的重要内容，可以训练学生综合运用多方面的知识、实验技能和思维方法去分析和解决问题的能力，利于提高学生的主动性和综合能力，锻炼学生的探索精神。正因为如此重要，普通高等学校本科教学工作水平评估方案里对开展综合实验的课程比例有要求。通常可以有不同的形式开展综合性实验，其中一种方式是通过设计将原本看起来是相互独立的不同实验串联起来，形成一个较为完整、具有连续性的实验体系，使孤立的实验整体化、零散的知识系统化，使理论知识和操作技能形成一个有机的整体。这种综合性实验前后实验联系紧密，要求学生认真思考和操作、步步为营，方能理解整体实验和做出较好的结果，从而可以培养学生的整体思维和全局意识。考虑到大学有不少专业的课程表安排得非常紧凑，很难有集中的空余时间进行实验，另外考虑到实验条件和实验准备工作量，这种实验串联方式不失为一种较易开展的综合实验教学方式。本文正是采用了这种实验串联方式，将原先独立的“细菌培养基配制和灭菌”“细菌接种技术”和“细菌革兰氏染色”等实验重新设计了基于细菌筛选及其特性研究的微生物综合实验体系。一、设计思路原先本微生物课程的实验一、二和三分别是“细菌培养基配制和灭菌”“细菌接种技术”和“细菌革兰氏染色”。这三个实验，除了实验二使用了实验一配制的培养基外，没有紧密的联系，是相互独立的。为了将这几个实验整合为一个相互紧密联系的综合实验体系，需要进行重新规划，最终把它们设计成“某一类细菌筛选及其特性研究”这一主题的综合实验，主要内容不仅涵括了原先的“细菌培养基配制和灭菌”“细菌接种技术”和“细菌革兰氏染色”等三个实验，还增设了“细菌分离纯化和保存”“细菌生化试验”和“细菌药敏试验”等实验。这样就形成了从细菌分离筛选到细菌特性研究的一系列连贯实验，也可以看作是构成了一个微小型的研究课题，也确保具有一定量的实验结果，从而可以将这一系列实验的实验报告改为写成一篇小型学术论文，不仅可以锻炼学生撰写论文的能力，还可以让学生有自主开展科学研究的感受，更能引起学生的学习兴趣和积极性。至于具体选择哪一类细菌开展实验，有条件的学校可以让学生自主决定，或者由教师指定几类容易筛选的细菌供学生选择，比如从环境中筛选产蛋白酶细菌、产淀粉酶细菌或者从食物中分离大肠杆菌或某一类耐药菌等。如果从方便实验准备角度考虑，可以指定做某一类细菌。笔者正是选择了产蛋白酶细菌，因为产蛋白酶细菌在环境中分布广泛，学生可以自主选择环境样品，比如土壤和湖水；筛选方法也简单，容易筛选到，通常都能确保每一组学生都可以分离得到；鉴别产蛋白酶细菌的方法也很简单和直观有趣（在牛奶培养基上形成透明圈菌落），学生学习兴趣也高。因此，本文以产蛋白酶细菌筛选及其特性研究为例阐述相关实验教学设计。二、实验教学安排（一）实验一 培养基配制以及产蛋白酶细菌的分离实验一可以安排 个学时，大约一个上午或一个下午。主要内容包括配制分离纯化产蛋白酶细菌的各种培养基以及灭菌、环境采样及样品处理、固体培养基平板的倾注、平板涂布法分离产蛋白酶细菌。由于培养基灭菌过程需要较长的等待时间，为了充分利用时间，在实验课开 科技风 年 月科教论坛始时先快速讲解培养基配制这部分内容，然后让学生开始配制培养基及灭菌；因为分离细菌环节需要先用固体培养基，也可以让学生先配制固体培养基并开始灭菌，然后再配制其他培养基。另外需要尽量配备多一些电子天平和微波炉等设备，否则消耗在排队等待称量和加热的时间也比较多。在配制完所有培养基，在等待灭菌的过程中，再具体给学生讲解其他实验内容以及观看一些相关实验操作教学视频（如倒平板、平板涂布等），随后安排学生到校园采集土壤样品，还有样品稀释，因此需要将采样器具和样品稀释所需要的材料在课前进行灭菌和烘干，等到稀释好样品后（稀释到），基本上培养基灭菌也即将结束了。从灭菌锅中拿出培养基，先摆斜面和高层培养基，然后开始倾注固体培养基，之后用平板涂布法分离产蛋白酶细菌（每个稀释度涂布一个平板）。第二天，让学生在一个课后时间过来观看细菌分离结果和拍照，以及挑取透明水解圈最大的单菌落到液体培养基中进行培养，以备实验二使用。本次实验主要让学生掌握各类细菌培养基的制备方法、灭菌材料的包扎方法和样品梯度稀释、倒平板、平板涂布等实验技能以及学习从环境样品中分离细菌的方法。分离产蛋白酶细菌用的是普通营养琼脂培养基和营养肉汤培养基，需要配制固体、半固体和液体培养基。其中固体培养基在实验一用于产蛋白酶细菌的分离和纯化，在倾注平板前需要另外加入课前已灭菌的 脱脂奶粉，两者混匀后再立刻倾注平板。脱脂奶粉的灭菌条件为 ，灭菌温度过高、灭菌时间过长都容易造成沉淀。固体培养基还用于制备斜面（用于斜面接种），半固体培养基则用于高层培养基（用于细菌动力试验的穿刺接种）。液体培养基用于单菌落的培养和菌株保存。总结需要课前灭菌的材料有：采样材料（金属药勺、装有 生理盐水的 锥形瓶）；脱脂奶粉（用试管装）；稀释样品用的生理盐水（用试管装，每管，共 管）；移液管或者移液器吸头（和）；玻璃培养皿或者一次性灭菌塑料培养皿。（二）实验二 产蛋白酶细菌的纯化与保存实验二可以安排 个学时。本次实验主要内容是对实验一分离获得的产蛋白酶细菌进行平板划线纯化、斜面和穿刺接种，主要是训练学生学会各种细菌接种方法，每个学生至少练习每一种接种方法两次。接种菌液用的是实验一挑取单菌落到液体培养基长出来的菌液，从而才能保证每个学生都能练习三种接种方法。培养基则是使用实验一配制的各类培养基。培养一天后，让学生拍照接种效果，并把相关培养物放置于冰箱保存。时间安排允许的情况下，可以先进行平板划线纯化，等平板划线培养出来确认是纯的菌株后，再进行斜面和穿刺接种。这样的流程在学术上是严谨的，但耗时过长，不太适合本科教学安排。实际情况下，往往还是选择同时进行三种接种，不需要等划线纯化结果出来再进行其他接种，但需要与学生解释清楚，让学生明白在做科研情况下应该如何做。穿刺接种可以观察细菌的动力，为了让结果更好辨认，可以同时接种已知的有鞭毛和无鞭毛的细菌作为参照菌。同时注意半固体培养基的琼脂含量不能过高，通常是。（三）实验三 产蛋白酶细菌的革兰氏染色和形态观察本次实验可以安排 学时。本次实验主要是训练学生掌握使用普通光学显微镜（尤其是油镜观察）观察细菌形态和革兰氏染色法，使用的是实验二划线分离的单菌落。确保每一个学生都至少做出三个样品，一是各自所筛选的产蛋白酶细菌，二和三分别是用于参照的已知的革兰氏阳性和阴性菌。要求学生拍照最终的染色结果，判断所筛选的产蛋白酶细菌属于阳性菌还是阴性菌，同时观察细菌的形态（杆状还是球状或者其他形状），也可以增加其他染色方法实验，比如鞭毛染色。（四）实验四 产蛋白酶细菌的生化试验和药敏试验实验四可以安排 个学时。本次实验主要是训练学生掌握常见生化试验方法和药敏试验的纸片扩散法，这两方面知识都是细菌学检验的重要内容，菌种是使用之前实验接种到平板和斜面的产蛋白酶细菌的菌落。为了节省时间，生化试验通过购买商品化生化鉴定管来开展，可以多达 余种生化鉴定项目，主要测定项目包括氧化酶、酶、乙酰胺酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、苯丙氨酸脱氨酶、脲酶、硫化氢试验、试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、枸橼酸盐利用试验、多种糖类和醇类发酵试验（包括葡萄糖、麦芽糖、木糖、乳糖、甘露醇、卫矛醇等）。有条件的情况下，可以增设对细菌进行分子生物学鉴定，比如 基因的 扩增和测序。药敏试验的药敏纸片也是可以通过购买获得，可以做至少 种药物，比如庆大霉素、氨苄西林、卡那霉素、链霉素、红霉素、四环素和新霉素等。药敏试验使用的 培养基可以由实验室在课前制备，也可以由学生在实验三提前配制和灭菌，同时需要配备浊度管。第二天观看和记录试验结果，有些生化试验需要在看结果时加入试剂反应才能判定结果，比如硝酸盐还原试验、吲哚试验、苯丙氨酸脱氨酶科教论坛科技风 年 月试验。三、实验结果汇报笔者此前多年指导本科毕业论文发现，许多学生在写毕业论文时还是存在很多问题，包括格式问题，论文指导教师要花大量时间纠正这些问题。究其原因，重要一点在于学生在写毕业论文之前缺乏论文写作训练，对于不少学生来说，毕业论文是第一次写论文。因此迫切需要在毕业论文之前的学习中，增加学生的论文写作训练。把综合实验报告写成论文形式是一种极好的训练方式。以往做法通常是在实验后要求学生写实验报告。而经过笔者重新规划设计，几个原先独立的实验串联成一个有研究主题的综合性实验，实验结果也相对比较多，因此可以要求每个学生把实验结果写成一篇小型论文进行报告，论文题目统一为“产蛋白酶细菌的筛选及其特性研究”，内容包括常规的研究背景、方法、结果、讨论等部分，论文格式可以参照本校的本科毕业论文。强调每个学生都要单独完成这篇实验论文，虽然在开展实验时，受实验条件所限，很难做到每个学生单独完成所有实验。同一实验小组，实验结果可以相同，但是不同人写出来的论文终究是不同的。可以给予学生充足的时间去完成这篇实验论文，比如 个月，教师在布置实验论文任务时可以讲解论文写作注意问题。教师在批改完实验论文后，也应当总结学生在论文中出现的问题，做成，在课上进行集中点评，这样才能真正让学生得到提高，论文点评可以安排 个学时。鉴于实验论文均由每个学生单独撰写，也耗费了较多时间，论文写作也能较好反映学生的能力水平。因此，应适当提高实验论文在课程平时成绩中的占比，具体比例应依据具体情况而定，如除了实验论文，没有其他特别的考核项目，可以将比例提高到课程平时成绩的。这样才能更好地区分学生的能力水平，也可以让学生更有学习积极性。结语基于细菌筛选及其特性研究的微生物综合实验可以安排 学时，具体内容包括：实验一：培养基配制和细菌分离；实验二：细菌纯化和保存；实验三：细菌的革兰氏染色和形态观察；实验四：细菌的生化试验和药敏试验、实验论文点评（实验报告写成论文形式）。通过此综合实验，不仅可以让学生学习培养基配制、细菌接种技术、细菌分离纯化保存、细菌形态观察、革兰氏染色法、各种生化试验和药敏试验等重要的微生物检验基本技术，还可以训练学生撰写论文的能力，让学生有开展课题研究的体验。参考文献：韩国民，沈玲，张明构建微生物学技术综合实验体系 培养大学生科研素养安徽农学通报（下半月刊），（）：全淑芬，陈丽丽，柏琴琴，等卫生检验与检疫专业微生物检验实验教学改革微生物学通报，（）：谷存国综合设计性实验在微生物学检验教学中的实践探索卫生职业教育，（）：李永泉，辛英，李彩丽以创新为导向的医学生物化学与分子生物实验课改革探索高教学刊，（）：魏建宏，罗琳微生物学综合性设计实验教学中存在的问题与探索微生物学通报，（）：王彦凤，王志钢，王潇，等基于综合素质培养的微生物实验教学改革探索实验室科学，（）：陈茏，杨俊，马毛毛，等产蛋白酶菌株的筛选及以菜籽粕为氮源的产酶条件优化食品科学，（）：卢超，陈景鲜，王国霞，等一株高产中性蛋白酶菌株的筛选与诱变中国饲料，（）：冯菲，权淑静，刘丽，等高产蛋白酶菌株的分离、鉴定及酶学性质研究中国酿造，（）：佘小红，杜娟，朱雯莉，等“一流课程”建设背景下材料化学专业课程实验教学改革与探究广州化工，（）：基金项目：广东省本科高校教学质量与教学改革工程建设项目“卫生检验与检疫专业五位一体的新实践技能培养体系的构建”（粤教高涵 号）；广东医科大学高等教育教学研究课题“以提高学生综合能力和增加学习兴趣为导向的专业课程改革”（）；年广东医科大学教学质量与教学改革工程项目“卫生检验与检疫专业五位一体的新实践技能培养体系的构建”（）作者简介：林伯坤（），男，汉族，广东肇庆人，博士，副教授，研究方向：微生物检验。通讯作者：邵军丽（），女，汉族，河南安阳人，博士，副教授，研究方向：卫生检验。科技风 年 月科教论坛