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DNADNA基本技术基本技术2第一节第一节 核酸印迹技术与分子杂交核酸印迹技术与分子杂交Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization什么是核酸分子杂交什么是核酸分子杂交 核酸分子杂交（核酸分子杂交（nucleotide molecular hybridization）以以DNA的变性、复性为理论基础的变性、复性为理论基础指指具有一定同源序列具有一定同源序列具有一定同源序列具有一定同源序列的两条核酸单链（的两条核酸单链（DNA或或RNA），在一定条件下按），在一定条件下按碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则经经过复性处理后，形成过复性处理后，形成异源双链异源双链异源双链异源双链的过程的过程 一、一、Southern 印迹可用于分析基因印迹可用于分析基因拷贝数的变化拷贝数的变化由由E.M.Southern在在1975年提出年提出可用于分析基因拷贝数的变化可用于分析基因拷贝数的变化基本操作过程包括基本操作过程包括待测待测DNA样品的制备和基因探针的标记；样品的制备和基因探针的标记；待测待测DNA样品的电泳分离；样品的电泳分离；电泳分离的电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的经变性、转移、固定到合适的固相支持物；固相支持物；特异性核酸探针与膜上特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自片段杂交，放射自显影或显色检测目的显影或显色检测目的DNA的存在。的存在。Southern印迹分析基本流程印迹分析基本流程滤纸NC膜凝胶滤纸电泳电泳 转移转移 杂交，显影杂交，显影酶切酶切DNADNA样品上样样品上样 DNADNA印迹印迹重物缓冲液二、二、Northern 印迹和印迹和RT-PCR可用于可用于分析基因转录水平的变化分析基因转录水平的变化Northern blot是是将将RNA从从凝凝胶胶中中转转印印到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，定定性性分分析析mRNA的的常常用用方方法；法；RT-PCR是是 以以 mRNA为为 模模 板板 反反 转转 录录 合合 成成cDNA、再再以以cDNA为为模模板板进进行行特特异异性性扩扩增增，进行进行RNA定性或定量分析的一种方法；定性或定量分析的一种方法；二者均可用于分析基因转录水平的变化二者均可用于分析基因转录水平的变化。三、原位分子杂交技术可用于基因及其三、原位分子杂交技术可用于基因及其表达产物的定位分析表达产物的定位分析原位杂交（原位杂交（in situ hybridization，ISH）即）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术；物定位分析的一种技术；可用于基因及其表达产物的定位分析。可用于基因及其表达产物的定位分析。8FISH箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置第二节第二节 聚合酶链式反应聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction什么是聚合酶链式反应什么是聚合酶链式反应聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；由由K.Mullis于于1983年建立年建立；可用于分析基因及其产物的水平变化；可用于分析基因及其产物的水平变化；可进行实时、定量分析可进行实时、定量分析；可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列序列的相互作用。的相互作用。PCR技术的工作原理技术的工作原理53355335+55变性、退火变性、退火引物引物5335+55dNTPsTaq DNA聚合酶聚合酶不同长度新链不同长度新链DNA循环循环1+引物引物变性、退火变性、退火2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA得到扩增得到扩增5335+5335+5335+5335+dNTP Taq DNA 聚合酶聚合酶均一长度新链均一长度新链DNADNA循环循环2一、一、PCR技术分析基因及其产物技术分析基因及其产物反反转转录录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是是将将RNA的的反反转转录录反反应应和和PCR反反应联合应用的一种技术。应联合应用的一种技术。RT-PCR是是目目前前从从组组织织或或细细胞胞中中获获得得目目的的基基因因以以及及对对已已知知序序列列的的RNA进进行行定定性性及及半半定定量分析的最有效方法。量分析的最有效方法。mRNA 5 AAAAAA(n)3 mRNA 5 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 mRNA 5 cDNA 3 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 oligo(dT)12-18反转录酶反转录酶RNase HDNA 聚合酶聚合酶S1 核酸酶核酸酶3 cDNATTTTTT(n)5 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 反转录合成反转录合成cDNA二、二、PCR技术可以进行实时、技术可以进行实时、定量分析定量分析QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 3355三、三、PCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合的结合的DNA序列序列第三节第三节 DNA序列测定序列测定DNA Sequencing*DNA序列分析方法的演变和发展序列分析方法的演变和发展20世纪世纪70年代年代双脱氧链终止法：双脱氧链终止法：F.Sanger化学裂解法：化学裂解法：A.Maxam和和W.Gilbert20世纪世纪80年代年代PCR及自动测序技术及自动测序技术一、一、DNADNA序列分析有双脱氧链终止法和序列分析有双脱氧链终止法和化学裂解法化学裂解法（一）（一）Sanger双脱氧链终止法利用双脱氧链终止法利用2，3 -双脱氧核苷酸掺入中双脱氧核苷酸掺入中（二）（二）Maxam-Gilbert化学裂解法利用化学化学裂解法利用化学试剂裂解修饰碱基试剂裂解修饰碱基止聚合反应止聚合反应 双脱氧链终止法双脱氧链终止法GATC 测序反应测序反应 电泳电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5 3 正极正极负极负极ddGddAddTddCDNA序列自动分析序列自动分析ddG红红ddTddA绿绿ddC蓝蓝橙橙毛细管电泳毛细管电泳荧光标记荧光标记DNA合成合成测序结果展示测序结果展示二、二、DNA序列分析可以揭示基因和序列分析可以揭示基因和基因组一级结构变化基因组一级结构变化通过通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组序列分析可以鉴定基因和基因组的变异的变异通过通过DNA序列测定分析人工重组的基因序列测定分析人工重组的基因通过通过DNA序列测定对定点突变进行确认序列测定对定点突变进行确认第四节第四节 DNA芯片技术芯片技术DNA Chip Technologies什么是什么是DNA芯片技术芯片技术DNA芯片（芯片（DNA chip）在固相支持物上有序固化寡核苷酸或在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针，探针，与待测荧光标记样品进行杂交；与待测荧光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息品的遗传信息(基因序列及表达基因序列及表达)；亦被称作亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。基因芯片工作流程基因芯片工作流程一、利用一、利用DNA芯片技术可同时进行高通量芯片技术可同时进行高通量基因转录活性的分析基因转录活性的分析cDNA芯芯片片每每个个探探针针是是cDNA片片段段或或基基因因的的一一段段PCR产产物物，可可以以同同任任何何具具有有同同源源序序列列的的样样品品形形成成杂杂交交体体，同同时时定定量量监监测测大大量量基基因的表达。因的表达。寡寡核核苷苷酸酸芯芯片片利利用用基基因因特特异异的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段为为探探针针，每每个个基基因因有有1020个个相相对对应应的的探探针针，对对低低丰丰度度基基因因表表达达水水平平变变化化的的检检测测具具有高度灵敏性。有高度灵敏性。二、染色质免疫共沉淀与芯片技术结合二、染色质免疫共沉淀与芯片技术结合检测蛋白质检测蛋白质-DNA相互作用相互作用染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀-芯片（芯片（chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip）特特异异性性地地富富集集目目的的蛋蛋白白结结合合的的DNA片片段段，解解交交联联后后对对目目的的片片段段进进行行纯纯化化、扩扩增增和和荧荧光光标标记记，再用于芯片分析；再用于芯片分析；寻寻找找特特异异性性蛋蛋白白在在基基因因组组中中的的结结合合位位点点，获获得得蛋白质与蛋白质与DNA相互作用的信息。相互作用的信息。ChIP-on-chip工作原理工作原理第五节第五节 酵母及哺乳动物细胞杂交系统酵母及哺乳动物细胞杂交系统Yeast and Mammalian Hybrid Systems一、酵母双杂交探测蛋白一、酵母双杂交探测蛋白-蛋白的相互作用蛋白的相互作用酵母双杂交系统（酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）由）由S.Fields 和和O.Song 于于1989年提年提出并初步建立出并初步建立酵母双杂交技术的基本原理酵母双杂交技术的基本原理二、酵母单杂交系统需要构建二、酵母单杂交系统需要构建“报告报告”细胞细胞酵酵母母单单杂杂交交技技术术（yeast one-hybrid）由由J.Li于于1993年从酵母双杂交技术发展而来年从酵母双杂交技术发展而来是是体体外外分分析析DNA与与细细胞胞内内蛋蛋白白质质相相互互作作用用的的一一种方法；种方法；通通过过对对酵酵母母细细胞胞内内报报告告基基因因表表达达状状况况的的分分析析，鉴别鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因。结合位点并发现潜在的结合蛋白基因。酵母单杂交技术的基本原理酵母单杂交技术的基本原理三、蛋白质三、蛋白质-RNA相互作用也可采用酵母相互作用也可采用酵母三杂交系统进行分析三杂交系统进行分析酵酵 母母 三三 杂杂 交交 系系 统统（yeast three-hybrid system）于于1996年年由由D.J.SenGupta等等首首先先报报道道（一一）用用于于蛋蛋白白质质-RNA相相互互作作用用分分析析的的酵酵母母三杂交系统需要杂合三杂交系统需要杂合RNA 酵母三杂交基本原理酵母三杂交基本原理（二）酵母三杂交系统应用范围广泛（二）酵母三杂交系统应用范围广泛可进行与特定蛋白结合的未知可进行与特定蛋白结合的未知RNA的筛选；的筛选；确定确定RNA-蛋白质相互作用的结构域；蛋白质相互作用的结构域；鉴鉴定定、分分离离能能够够识识别别具具有有重重要要生生理理功功能能RNA的的RNA结合蛋白。结合蛋白。