肥胖母鼠对雄性子代生殖力的影响及其机制研究_尹睿.pdf

1 0 9CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS论著癌变畸变突变2023 年 3 月第 35 卷第 2 期收稿日期：2022-08-09；修订日期：2023-02-16基金项目：重庆市自然科学基金重点项目(cstc20220jcyj-zdxmX0011)；重庆市科研机构绩效激励引导专项项目(cstc2021jxjl130017)；重庆市自然科学基金博士后基金(cstc2020jcyj-bsh0238)作者信息：尹睿，E-mail：。*通信作者，李练兵，E-mail：；卢大儒，E-mail：肥胖母鼠对雄性子代生殖力的影响及其机制研究尹睿1，2，岳小枫2，4，谭小音2，李练兵2，*，卢大儒2，3，*(1西南大学医学研究院生殖医学研究中心，重庆400715；2重庆市人口和计划生育科学技术研究院/国家卫生健康委出生缺陷与生殖健康重点实验室，重庆400020；3复旦大学生命科学学院，上海200438；4重庆医科大学附属第三医院泌尿外科，重庆401120)Effects of obese female miceon fertility of male offspringand its mechanismYIN Rui1,2,YUE Xiaofeng2,4,TAN Xiaoyin2,LI Lianbing2,*,LU Daru2,3,*(1.Reproductive Medicine Research Center,Medical Research Institute,Southwest University,Chongqing 400715;2.Key Laboratory of BirthDefects and Reproductive Health of National Health Commission,ChongqingPopulation and Family Planning Science and Technology Research Institute,Chongqing 400020;3.School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai200438;4.Department of Urology,The Third Affiliated Hospital ofChongqing Medical University,Chongqing 401120,China)【摘要】目的：探讨母体肥胖小鼠对雄性子代生殖能力的影响及其可能机制。方法：以高脂饮食诱导8周建立雌性小鼠肥胖模型，分别与正常饮食雄性小鼠合笼，子鼠出生后分为母体肥胖组和正常对照组，断奶后正常饮食喂至8周，每组随机选取8只雄性子鼠麻醉后处死，分离睾丸和附睾组织，检测精子质量，ELISA法检测睾丸性激素水平，免疫荧光法检测睾丸活性氧(ROS)水平，qPCR和Western blot法分别检测FOXO1、Nrf2基因的mRNA和蛋白表达水平。结果：与对照组相比，母体肥胖组小鼠精子浓度、精子活力和前向运动精子比率均显著降低(P0.01)，精子畸形率显著升高(P0.01)。其他检测结果显示，母体肥胖能引起子代睾丸组织损伤，睾丸内性激素分泌紊乱，睾丸组织ROS水平升高，精原细胞标志物FOXO1表达水平显著上升，氧化应激水平和Nrf2蛋白表达水平均升高(均为P0.01)。结论：在母体肥胖的情况下，子代雄性小鼠睾丸组织存在氧化应激，可能导致精原细胞分化障碍，引起子代生殖损伤。【关键词】母体肥胖；雄性子代；精原细胞；精子发生；叉头转录家族O1中图分类号：R589.2文献标志码：A文章编号：1004-616X(2023)02-0109-07doi：10.3969/j.issn.1004-616x.2023.02.005【ABSTRACT】OBJECTIVE：To investigate effects of obese female mice on reproductive ability of maleoffspring and their possible mechanisms.METHODS：A female mouse obesity model was established byhigh-fat diet induction for 8 weeks，and caged with normal diet male mice.After birth，the offspring weredivided into maternal obesity group and normal control group and fed with normal diet until 8 weeks afterweaning.From each group of mice，8 male offspring were randomly selected and executed after anesthesia.From them，testes and epididymis tissues were isolated，sperm quality was evaluated，testicular sex hormonelevels were detected by ELISA，testes were analyzed using by immunofluorescence Expression levels of mRNAand protein for FOXO1 and Nrf2 genes were detected by qPCR and Western blot，respectively.RESULTS：Compared with the control group，sperm concentrations，sperm motilities and forward motion sperm ratios weresignificantly lower(P0.01)and the sperm malformation rates were significantly higher(P0.01)in the maternalobese mice.Other test results showed that maternal obesity could cause testicular tissue damage in theoffspring，disturbanceintesticularendocrinehormonesecretion，elevatedtesticulartissueROSlevels，significantly increased expression levels of the spermatogonial marker FOXO1，and elevated oxidative stresslevels and Nrf2 protein expressions(all P0.01).CONCLUSION：Due to maternal obesity，oxidative stresslevels were elevated in testicular tissues of offspring male mice which might have caused impaired theirspermatogonial differentiation and reproductive capacity.【KEY WORDS】maternal obesity；male offspring；spermatogonia；spermatogenesis；FOXO1论著癌变畸变突变1 1 0CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.2Mar.2023肥胖症是一种由遗传、环境和生活方式共同引起的代谢性疾病，中国人的肥胖率自 2004 年的 3.1%上升至 2018 年的 8.1%1，育龄妇女肥胖率也急剧上升2-3，肥胖已经成为一项严重的公共健康问题。大量文献研究表明，妊娠期肥胖可改变母体代谢，进而影响母体和胎儿的营养传输，诱发子代罹患神经发育障碍、心血管疾病和II型糖尿病等疾病4-6。但目前关于母体肥胖是否影响雄性子代生殖力的研究较少，因此亟待证明母体肥胖对雄性子代生殖力的影响，并阐释其相关机制，从而进行有效的母婴早期干预，以预防出生缺陷，促进母婴健康。精子的数量和质量是衡量男性生育力的主要标准。精子发生是一个精密复杂的过程，在胚胎早期便出现原始生殖细胞，随后发育成为性原细胞后增殖分化成为A型精原细胞，精原细胞的形成是生精过程的起始，在这个过程中极易受到外界因素的影响，而肥胖可打破精子发生过程中的能量平衡，导致精子发生障碍7。既往研究表明，母体肥胖可影响子代性腺发育，打破睾丸内氧化还原平衡，最终导致睾丸内精原细胞线粒体损伤及细胞凋亡8-10。母体肥胖还可导致子代精子中Peg3基因的启动子DNA 甲基化显著升高，更为严重的是母体肥胖能通过精子tRNA将肥胖表型传递给子代11-12。这些研究表明，母体肥胖可能会影响子代生殖系统，而母体肥胖对子代生精过程的影响尚不清楚。因此，本研究通过建立高脂饮食诱导母体肥胖小鼠模型，观察分析母体肥胖对雄性子代睾丸功能的影响和可能机制，为母体肥胖造成子代生殖力下降提供新的线索。1材料与方法1.1实验动物清洁级6周龄C57BL/6J雌性小鼠30只，购于北京思贝福生物技术有限公司(生产许可证号110324220102752384)。在国家卫生健康委出生缺陷与生殖健康重点实验室 SPF 级小鼠饲养室喂养，12 h/12 h 光/暗循环，室温22，湿度30%40%。1.2主要仪器和试剂RNA提取试剂盒，购于南京诺唯赞生物科技公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒、GAPDH购于上海碧云天生物技术有限公司；BSA购于美国Sigma 公司；叉头转录家族O1(forkhead box O1，FOXO1)抗体购于武汉Abclonal生物科技公司、Nrf2抗体购于沈阳万类生物技术公司。A48141 VeritiPro PCR 仪购于美国Thermo Fisher公司；Western SDS-Page电泳仪购于美国Bio-rad公司；低温组织匀浆机购于武汉赛维尔生物科技有限公司；藏夹正置显微镜购于日本奥林巴斯公司。1.3饲料成分小鼠饲料购于北京蕙比特科技有限公司（见表1）。高脂饲料作为诱导肥胖母鼠组饮食，低脂饲料作为低脂母鼠组饮食，实验使用的饲料能够保证实验动物的正常生长发育。1.4方法1.4.1肥胖小鼠模型的建立清洁级C57BL/6J雌性6周龄小鼠30只，适应性喂养1周后，分为低脂饮食组与高脂饮食组。低脂饲料喂食的8只小鼠为基础对照组(n=8)，高脂饮食诱导8周后，将体质量超过基础对照组25%的小鼠归为肥胖组(n=10)。两组雌鼠喂养8周后分别将其与正常雄鼠交配。母体肥胖的子代定义为母体肥胖组，选取不同母体子鼠共8只(n=8)；低脂母体定义为对照组，选取不同母体子鼠共8只(n=8)。保持小鼠自由饮食与饮水，每日定时换水换食，记录每周每只鼠的进食量，定期称量小鼠。1.4.2肥胖雌鼠血糖检测在高脂诱导至第8周时将小鼠禁食12 h后，取尾末梢血进行糖耐量检测。使用强生血糖检测仪记录空腹时血糖，再按照1.5 mg/g腹腔注射20%葡萄糖溶液，于注射后15、30、60和120min时分别记录血糖值。1.4.3精子质量检测子鼠出生8周后，随机挑选8只雄性小鼠，按照1 mL/kg剂量对子鼠腹腔注射5%戊巴比妥，麻醉后眼球取血后快速断颈处死，取出睾丸放入液氮速冻与4%多聚甲醛保存，取出附睾将其放入37 预热好的PBS中充分剪碎，在37 金属浴中恒温孵育30 min，充分游离精子，过滤，留取滤液，表1小鼠饲料组成成分/(g/kg)成分酪蛋白玉米淀粉麦芽糖糊精蔗糖纤维素大豆油猪油矿物油矿物质磷酸氢钙碳酸钙柠檬酸钾维生素混合物酒石酸氢胆碱FD&C蓝色色素#5FD&C蓝色色素#5低脂饲料(10%脂肪)2003506.212568.850252010135.516.51020.010.04高脂饲料(60%脂肪)2003012568.8502524510135.516.51020.050论著癌变畸变突变1 1 1CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 3 月第 35 卷第 2 期取10 L样本制片，在显微镜下分别观察记录样片中的精子数量、前向运动和原地运动及不动精子数量，完成初步统计。取10 L精液样本涂片后无水乙醇固定，进行下一步精子形态HE染色后对畸形精子计数。1.4.4免疫组化染色将睾丸组织石蜡切片烘烤2 h后，二甲苯脱蜡20 min，乙醇梯度脱蜡(乙醇浓度依次为100%、100%、95%、90%、80%、70%)，柠檬酸钠抗原修复液95 修复15 min后自然冷却，使用3%甲醇-H2O2去除内源性过氧化物酶，然后用山羊血清封闭30 min，滴加兔来源的FOXO1一抗(1100稀释)在湿盒中4 孵育过夜。PBS清洗后滴加二抗。DBA显色剂显色后快速苏木素染色，梯度乙醇脱水(乙醇浓度依次为70%、80%、90%、95%、100%、100%)，二甲苯透明，烘干，中性树胶封片后显微镜下观察、拍照。用ImageJ软件分析染色单位面积百分比。1.4.5睾丸组织活性氧检测取出睾丸组织后立即放入液氮中保存，随后将睾丸组织进行冰冻切片，室温下复温，控干水分，用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，在圈内加入自发荧光淬灭剂5 min，流水冲洗 10min。在 圈 内 滴 加 活 性 氧(reactiveoxygenspecies，ROS)染液，避光恒温箱 37 孵育 30 min。随后把玻片置于PBS(pH=7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min。再把玻片置于PBS(pH=7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。切片于荧光显微镜下观察并采集图像(DAPI紫外激发波长330380 nm，发射波长 420 nm，发蓝光；FITC 激发波长 465495nm，发射波长515555 nm，发绿光；CY3激发波长510560 nm，发射波长590 nm，发红光)。DAPI染色的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为红光。1.4.6实时荧光定量PCR检测睾丸组织中FOXO1mRNA表达水平使用mRNA提取试剂盒将冰冻睾丸组织在-10 中匀浆，12 000 g离心取上清液后根据mRNA快速提取试剂盒说明书提取组织mRNA。使用紫外分光光度计检测各组RNA浓度，根据反转录试剂盒将总RNA反转录合成cDNA。95 预变性30 s后开始 PCR 循环：95 预变性 5 s，95、1 min，60、30 s，共循环 40 次；熔解曲线：72 延伸10 min。以 GAPDH 为 内 参，采 用2-CT法 计 算FOXO1 mRNA表达水平。引物均为上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列：GAPDH，正向5-GCGAGATCCCGCTAACATCA-3，反向 5-CTCGTGGTTCACACCCATCA-3；FOXO1，正向 5-CCAGCTGAAACCACAGAGAA-3，反向 5-ACAGTTCCCCAAAGGTGTTC-3。1.4.7Western blot 检测FOXO1、Nrf2蛋白的表达将睾丸组织放置在400 L含有5%蛋白酶抑制剂的RIPA组织裂解液中，在赛维尔组织研磨机中-10 匀浆，在 4 低温离心机 12 000 g 离心 5 min 后取上清，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后，配置成体系。蛋白质通过SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜后用快速封闭液封闭 15 min，分别加入抗 FOXO1、Nrf2、GAPDH 抗体(均按 11 000 稀释)4 孵育过夜，TBST清洗后用HRP标记的二抗孵育2 h，化学发光后用ImageJ软件统计分析每组蛋白的相对表达水平。1.5数据统计采用GraPhPad Prism 8统计软件对母体肥胖组和对照组各指标间的差异采用单因素方差分析，实验数据均以平均值标准差表示，P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1成功构建小鼠肥胖模型自第2周开始高脂饮食组与低脂饮食组体质量出现明显差异(P0.05)；第8周时，高脂饮食组小鼠的平均体质量显著超过低脂饮食组体质量25%，共有10只模型小鼠达到肥胖定义标准(图1A)。对肥胖母鼠进行尾部静脉血糖检测，在空腹时高脂饮食组与低脂饮食组无显著差异；注射20%葡萄糖15和30 min后，高脂饮食组血糖值显著高于低脂饮食组(P0.01)，到注射后 60 和 120 min 时两组间血糖值无显著差异(图1B)。以上结果表明雌性肥胖小鼠建模成功，并且肥胖可导致模型鼠糖代谢紊乱。2.2母体肥胖引起雄性子鼠体质量变化在雄性子代哺乳期前两周，母体肥胖组小鼠的体质量相较于对照显著升高；第3周时两组的体质量差异无统计学意义；哺乳期后，给予两组子代鼠基础饲料喂养至8周，在第6周母体肥胖组体质量相对于对照组明显增加，在第8周时两组子鼠体质量差异无统计学意义(见表2)。与对照组比较，*P0.05，*P0.01.周龄12368对照组/g3.390.265.340.419.690.4019.630.7722.680.72母体肥胖组/g4.120.24*6.070.36*10.270.5320.230.77*23.121.53表2两组子代雄鼠体质量变化比较论著癌变畸变突变1 1 2CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.2Mar.20232.3母体肥胖引起子代雄性小鼠精液质量下降小鼠精液质量检测结果见图2，在8周龄时，处死子代小鼠后记录睾丸质量，母体肥胖与对照组子代睾丸系数差异无统计学意义。将精液浓度、精子活力、精子前向活动率、精子畸形率作为小鼠精液质量指标，在光镜下小鼠精子计数显示，母体肥胖组精子浓度、精子前向运动和精子活力相对于对照显著下降(P0.01)。精子形态学染色显示，母体肥胖组相对于对照组精子畸形率显著上升，主要表现为顶体、精子中段和尾部异常(P0.01)，尾部异常母体肥胖组相对于对照组显著上升(P0.01)。2.4母体肥胖引起子代睾丸功能受损对睾丸组织匀浆使用ELISA法检测睾酮、雌二醇和黄体生成素水平，发现睾酮和雌二醇显著下降(P0.05)，雌二醇水平显著上升(P0.01)(图3AC)。对子鼠睾丸组织进行HE染色发现，母体肥胖组相对对照组生精小管排列混乱，管壁变薄，小管间距变大，睾丸间质细胞减少，且在生精小管内部生精细胞出现空泡化，圆形及成熟精子数量减少，透射电镜观察发现精原细胞线粒体出现空泡化(图3DE)。2.5母体肥胖引起子代雄鼠精原干细胞分化功能受损免疫组化检测两组FOXO1蛋白表达水平，母体肥胖组相对于对照组显著上升，母体肥胖组可见FOXO1阳性细胞堆积，对照组则均匀分布在生精小管边缘(图4A)。检测蛋白表达水平我们用Western blot检测两组FOXO1 蛋白相对表达水平分别为 0.430.19 和 1.330.09，母体肥胖组较对照组显著上升(P0.01，图4BA：对照组与母体肥胖组脏器指数；B：小鼠精液精子浓度统计；C：小鼠精液精子活力、前向运动率、形态畸形率、精子尾部畸形率比例统计；D：畸形精子与正常精子形态学比较.与对照组比较，*P0.05，*P0.01.图2小鼠精液质量检测结果(n=8)A：高脂饮食组与低脂饮食组模型鼠体质量变化情况；B：高脂饮食组与低脂饮食组模型鼠血糖变化情况.与低脂饮食组比较，*P0.05，*P0.01.图1高脂饮食诱导小鼠肥胖(n=8)论著癌变畸变突变1 1 3CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 3 月第 35 卷第 2 期和C)。2.6母体肥胖引起子代睾丸组织氧化应激有研究表明，肥胖引起的氧化应激是引起生殖力下降的重要原因之一，为此我们检测了睾丸切片ROS免疫荧光，相对荧光强度分别为47.981.25和50.191.65，母体肥胖组显著高于对照组(P0.01)，尤其是精原细胞表明母体肥胖能够引起子代ROS上升，造成氧化应激(图4D和E)。再通过Western blot检测两组抗氧化因子 Nrf2 蛋白表达水平分别为 0.810.09 和 1.210.24，母体肥胖组较对照组显著上升(图4F和G，P0.01)。3讨论随着社会发展，人们的生活习惯和饮食结构发生了显著的变化，肥胖率也随之急剧升高。国内外学者对高脂饮食与肥胖所引起的雄性生殖健康危害研究逐渐深入13，但是对亲代肥胖所造成的严重后果研究较少。现有的研究表明母体肥胖会增加雄性后代的体质量，会导致肥胖及代谢紊乱14，我们的研究再次印证了之前的报道，在出生后哺乳期及成年前母体肥胖组体质量均显著高于对照组，显示出肥胖易感性。分别对两组小鼠睾丸组织称量发现，睾丸质量无显著差异，脏器指数的减少主要原因为母体肥胖组体质量的增加，在Santos等15的研究中也证实了这一现象。精子数量减少是生殖力下降的主要标志16，精子的发生包括精原细胞的分化增殖、精母细胞的减数分裂以及圆形精子细胞的变形三个阶段17。精原细胞的正常功能是维持精子发生的基础，也是维持精子数量的前提条件18。其他的研究中还发现孕期高脂饮食会导致子代精子数量减少19-20，Meneghini等21则进一步证明母体肥胖降低子代精子质量，包括精子畸形率增高及精子DNA受损等。在我们的研究中不仅发现精子数量的显著减少，还发现母体肥胖能降低精子活力和前向运动率，这也是显著影响生殖力的重要表现。进而通过对精子形态HE染色发现，精子畸形主要表现在精子尾部异常，而尾部异常是造成精子活力显著下降的重要原因之一。FOXO1是叉头转录因子家族成员之一，是精原细胞稳态和精子发生启动所必需的，FOXO1基因缺陷使精原细胞自我更新与分化之间失去平衡，出现精原细胞进行性减少，导致精原细胞自我更新障碍，相反，FOXO1的高表达也会引起精原细胞的过度增殖，造成精原细胞分化障碍22-24。本研究数据显示母体肥胖组相对于对照组FOXO1转录和表达水平显著上升，免疫A：ELISA法检测睾丸匀浆睾酮水平；B：ELISA法检测睾丸匀浆雌激素水平；C：ELISA法检测睾丸组织黄体生成素水平；D：HE染色观察睾丸组织；E：透射电镜观察睾丸组织精原细胞.与对照组比较，*P0.05，*P0.01.图3母体肥胖引起子代睾丸功能受损(n=8)论著癌变畸变突变1 1 4CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.2Mar.2023组化检测结果显示母体肥胖组相对对照组出现精原细胞的堆积，提示母体肥胖能够造成子代精原细胞的分化障碍，这可能是子鼠精子数量减少的原因之一。此前研究证明母体肥胖会导致子代睾丸组织抗氧化系统老化10，氧化应激是男性生殖力受损的重要原因之一25。在氧化应激状态下，FOXO1 易发生核易位，导致FOXO1蛋白在转录后表达上调，以应对氧化应激26-28。在Lin等29的研究中，ROS能够激活Nrf2，再通过级联反应激活FOXO1，为此我们检测了睾丸组织的ROS水平，发现母体肥胖组显著高于对照组，同样母体肥胖组Nrf2蛋白表达水平也显著高于对照组，证明在子鼠睾丸内存在氧化应激现象，与此一致的是FOXO1表达水平也是上升的，这表明睾丸存在的氧化应激是造成精原细胞分化障碍的可能原因。综上所述，母体肥胖对子代生殖力产生严重影响，尤其是精子数量的显著降低，精原细胞分化功能的正常进行是精子发生的基础。当睾丸组织受到氧化应激的影响时，通过氧化应激激活Nrf2通路的表达，增加精原细胞中FOXO1的含量，进而影响精原细胞造成分化障碍，导致精子数量显著减少，最终引起雄性生殖损伤。参考文献1WANG L M,ZHOU B,ZHAO Z P,et al.Body-mass index andobesity in urban and rural China:findings from consecutivenationally representative surveys during 2004-2018J.Lancet,A：免疫组化检测睾丸组织FOXO1蛋白的相对表达水平；B：Western blot检测睾丸匀浆的FOXO1蛋白的条带图；C：FOXO1蛋白相对表达水平；D：免疫荧光检测睾丸组织ROS水平；E：睾丸组织ROS水平的荧光光密度；F：Western blot检测睾丸匀浆Nrf2蛋白的条带图；G：Nrf2蛋白相对表达水平.与对照组比较，*P0.05，*P0.01.图4母体肥胖可能通过氧化应激激活FOXO1导致子鼠精原细胞分化障碍(n=8)论著癌变畸变突变1 1 5CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 3 月第 35 卷第 2 期2021,398(10294):53-63.2WANG M C,FREANEY P M,PERAK A M,et al.Trends inprepregnancy obesity and association with adverse pregnancyoutcomes in the United States,2013 to 2018J.J Am HeartAssoc,2021,10(17):e020717.3DRISCOLLAK,GREGORYECW.Increasesinprepregnancy obesity:United States,2016-2019J.NCHSData Brief,2020(392):1-8.4MOUTON A J,LI X,HALL M E,et al.Obesity,hypertension,and cardiac dysfunction:novel roles of immunometabolism inmacrophage activation and inflammationJ.Circ Res,2020,126(6):789-806.5PAVLOV V A.The evolving obesity challenge:targeting thevagus nerve and the inflammatory reflex in the responseJ.Pharmacol Ther,2021,222:107794.6PICHME,TCHERNOFA,DESPRSJP.Obesityphenotypes,diabetes,and cardiovascular diseasesJ.Circ Res,2020,126(11):1477-1500.7OLIVEIRA P F,SOUSA M,SILVA B M,et al.Obesity,energybalance and spermatogenesisJ.Reproduction,2017,153(6):R173-R185.8BAUTISTA C J,RODRGUEZ-GONZLEZ G L,MORALESA,et al.Maternal obesity in the rat impairs male offspringaging of the testicular antioxidant defence systemJ.ReprodFertil Dev,2017,29(10):1950-1957.9MAO J D,PENNINGTON K A,TALTON O O,et al.In uteroand postnatal exposure to high fat,high sucrose diet suppressedtestis apoptosis and reduced sperm countJ.Sci Rep,2018,8(1):7622.10 RODRGUEZ-GONZLEZ G L,VEGA C C,BOECK L,et al.Maternal obesity and overnutrition increase oxidative stress inmale rat offspring reproductive system and decrease fertilityJ.Int J Obes(Lond),2015,39(4):549-556.11 GE Z J,LIANG Q X,HOU Y,et al.Maternal obesity anddiabetesmaycauseDNAmethylationalterationinthespermatozoa of offspring in miceJ.Reprod Biol Endocrinol,2014,12:29.12 SARKER G,SUN W F,ROSENKRANZ D,et al.Maternalovernutrition programs hedonic and metabolic phenotypesacross generations through sperm tsRNAsJ.Proc Natl AcadSci U S A,2019,116(21):10547-10556.13 LIU Y X,LIN C,LUO X X,et al.Research progress on therelationship between obesity-inflammation-aromatase axis andmale infertilityJ.Oxid Med Cell Longev,2021,2021:6612796.14 GODFREY K M,REYNOLDS R M,PRESCOTT S L,et al.Influence of maternal obesity on the long-term health ofoffspringJ.Lancet Diabetes Endocrinol,2017,5(1):53-64.15 SANTOS M,RODRGUEZ-GONZLEZ G L,IBEZ C,etal.Adult exercise effects on oxidative stress and reproductiveprogramming in male offspring of obese ratsJ.Am J PhysiolRegul Integr Comp Physiol,2015,308(3):R219-R225.16 FERLIN A,GAROLLA A,GHEZZI M,et al.Sperm count andhypogonadism as markers of general male healthJ.Eur UrolFocus,2021,7(1):205-213.17 TAN K,WILKINSON M F.A single-cell view of spermatogonialstem cellsJ.Curr Opin Cell Biol,2020,67:71-78.18 HERMANN B P,CHENG K R,SINGH A,et al.Themammalian spermatogenesis single-cell transcriptome,fromspermatogonial stem cells to spermatidsJ.Cell Rep,2018,25(6):1650-1667.e8.19 YOUNGSON N A,UDDIN G M,DAS A,et al.Impacts ofobesity,maternal obesity and nicotinamide mononucleotidesupplementation on sperm quality in miceJ.Reproduction,2019,158(2):169-179.20 SU Y F,HE L T,HU Z Y,et al.Obesity causes abrupt changesin the testicular microbiota and sperm motility of zebrafishJ.Front Immunol,2021,12:639239.21 MENEGHINI M A,GALARZA R A,FLORES QUIROGA J P,et al.Diet-induced maternal obesity and overnutrition cause adecrease in the sperm quality of the offspringJ.J NutrBiochem,2022,103:108966.22 GOERTZ M J,WU Z R,GALLARDO T D,et al.Foxo1 isrequiredinmousespermatogonialstemcellsfortheirmaintenance and the initiation of spermatogenesisJ.J ClinInvest,2011,121(9):3456-3466.23 WANG J S,BAO B H,FENG J L,et al.Effects of diabetesmellitus on sperm quality in the Db/Db mouse model and therole of the FoxO1 pathwayJ.Med Sci Monit,2021,27:e928232.24 LIU T T,CHEN X X,LI T J,et al.Histone methyltransferaseSETDB1 maintains survival of mouse spermatogonial stem/progenitor cells via PTEN/AKT/FOXO1 pathwayJ.BiochimBiophys Acta Gene Regul Mech,2017,1860(10):1094-1102.25 TAKESHIMA T,USUI K,MORI K,et al.Oxidative stress andmale infertilityJ.Reprod Med Biol,2020,20(1):41-52.26 ZHAO X S,GAN L X,PAN H Y,et al.Multiple elementsregulate nuclear/cytoplasmic shuttling of FOXO1:characterizationof phosphorylation-and 14-3-3-dependent and-independentmechanismsJ.Biochem J,2004,378(Pt 3):839-849.27 MITTLER R,VANDERAUWERA S,SUZUKI N,et al.ROSsignaling:the new wave?J.Trends Plant Sci,2011,16(6):300-309.28 KOPS G J,DANSEN T B,POLDERMAN P E,et al.Forkheadtranscription factor FOXO3a protects quiescent cells fromoxidative stressJ.Nature,2002,419(6904):316-321.29 LIN C C,YANG C C,HSIAO L D,et al.Carbon monoxidereleasing molec