干扰ACACA基因对猪原代...增殖和成脂转分化过程的影响_雷宇航.pdf

第 41 卷 第 2 期2023 年 4 月四川农业大学学报Journal of Sichuan Agricultural UniversityVol.41 No.2Apr.2023干扰ACACA基因对猪原代肌卫星细胞增殖和成脂转分化过程的影响雷宇航1，2#，谭娅1，2，3#，黄志洋1，2，赵梦颖1，2，齐婧3，甘麦邻1，2，沈林園1，2*，朱砺1，2*（1.四川农业大学畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室，成都 611130；2.四川农业大学动物科技学院/农业农村部畜禽生物组学重点实验室，成都 611130；3.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵阳 550005）摘要：【目的】探究乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACACA）对猪原代肌肉卫星细胞（muscle satellite cells，MSCs）增殖凋亡以及成脂转分化的影响。【方法】通过体外培养MSCs模拟猪肌内脂肪的形成过程，根据ACACA基因序列构建3条小干扰RNA，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）筛选出干扰效率最高的siRNA进行转染。成功干扰MSCs内ACACA的表达后，分别通过qRT-PCR、CCK-8细胞增殖实验、流式细胞术、油红O染色和检测甘油三酯（TG）等方法对MSCs增殖、凋亡以及转分化时期脂滴形成效果进行评估。【结果】在增殖期干扰ACACA，MSCs内细胞周期标志基因Cyclin D1（P0.05）、Cyclin E（P0.000 1）以及抗凋亡基因BCL-2（P0.05）的表达量下调，促凋亡基因BAX（P0.05）的表达量上调；在对MSCs进行成脂转分化诱导作用下，MSCs具有向脂肪细胞转分化的能力，而干扰ACACA后，MSCs中脂滴极显著减少（P0.000 1）。【结论】干扰ACACA后抑制猪MSCs的增殖，促进其凋亡，并且对成脂转分化时期脂滴的形成具有抑制作用。研究结果为后续研究ACACA对肌内脂肪的影响及猪肉制品调控机制研究提供实验参考和基础数据。关键词：乙酰辅酶A羧化酶；猪骨骼肌；原代肌卫星细胞；siRNA；转分化中图分类号：S828；Q75 文献标志码：A 文章编号：1000-2650（2023）02-0335-09Effects of ACACA Gene Interference on Proliferation and Adipogenic Transdifferentiation of Porcine Muscle Satellite CellsLEI Yuhang1，2#，TAN Ya1，2，3#，HUANG Zhiyang1，2，ZHAO Mengying1，2，QI Jing3，GAN Mailin1，2，SHEN Linyuan1，2*，ZHU Li1，2*（1.Farm Animal Genetic Resources Exploration and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；2.College of Animal Science and Technology in Sichuan Agricultural Univercity/Key Laboratory of Livestock and Poultry Biomics，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Chengdu 611130，China；3.Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Guizhou Academy of Agricultural Science，Guiyang 550005，China）Abstract:【Objective】The purpose of this study was to investigate the effects of acetyl-CoA carboxylase （ACACA）on proliferation，apoptosis and transdifferentiation of porcine muscle satellite cells（MSCs）.【Method】MSCs were cultured in vitro in this study to mimic the formation of porcine intramuscular fat.The ACACA gene sequence was used to design three small interfering RNAs，and the siRNA with the greatest amount of interference was chosen for transfection using quantitative real-time PCR（qRT-doi：10.16036/j.issn.1000-2650.202209180收稿日期：2022-09-27基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFD1200801）；四川省科技计划项目（2021ZDZX0008、2021YFYZ0007、2021YFYZ0030、scsztd-2022-08-09）；国家生猪技术创新中心资助。作者简介：雷宇航，硕士研究生；谭娅，助理研究员，研究方向为猪的遗传与分子育种，E-mail：Tanya_L。#为并列第一作者。*责任作者：沈林園，博士，副教授，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail：；朱砺，教授，博士研究生导师，主要从事猪遗传育种研究，E-mail：。四川农业大学学报第 41 卷 PCR）.The proliferation，apoptosis，and formation of lipid droplets of MSCs were assessed by qRT-PCR，CCK-8 cell proliferation assay，flow cytometry，oil Red O staining，and triglyceride（TG）detection techniques after successfully inhibiting the expression of ACACA in MSCs.【Result】The results showed that after ACACA interference in the proliferation phase，the expression levels of the cell cycle marker gene Cyclin D1（P0.05），Cyclin E（P0.000 1），and the anti-apoptotic gene Bcl-2（P0.05）were down-regulated，while the expression level of the pro-apoptotic gene BAX（P0.05）was up-regulated in MSCs.MSCs had the capacity to transdifferentiate into adipocytes following the induction of adipogenic transdifferentiation，and ACACA interference significantly decreased the number of lipid droplets in MSCs（P0.000 1）.【Conclusion】The presented results indicated that the MSCs proliferation and apoptosis were inhibited by the ACACA gene interference，which also prevented the formation of lipid droplets during adipogenic transdifferentiation.The findings provided experimental guidelines and fundamental information for further research on the impact of ACACA on intramuscular fat and the control mechanism of pork products.Keywords:acetyl-CoA carboxylase （ACACA）；porcine skeletal muscle；primary muscle satellite cells；siRNA；transdifferentiation中国不仅是世界上生猪饲养规模最大的国家，而且还是世界最大的猪肉消费国，猪肉品质在很大程度上决定了生猪行业经济效益及产业发展，因此提高猪肉质量成为该行业重中之重亟需解决的问题1。一般意义上，猪肉品质包含pH值、嫩度、系水力以及肌内脂肪含量等指标2。在影响猪肉品质的诸多因素中，肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）含量是一项关键指标，它与猪肉的嫩度、风味、多汁性都具有明显关联3。肌内脂肪组织又俗称“大理石纹”，属于肌肉脂肪中的一种，由散布在肌纤维束之间的脂肪细胞组成，是衡量肉类营养和风味的重要指标4。目前普遍认为猪肉最佳肌内脂肪含量在2%3%之间，当肌内脂肪含量高于3%时，猪肉口感变得太过油腻会降低消费者购买意愿；而肌内脂肪含量太低则会导致猪肉品质下降，因此合理控制肌内脂肪含量成为了本行业的研究重点5-6。有研究显示猪肌内脂肪包括肌纤维内的脂滴沉积在肌纤维之间和肌纤维束之间的脂肪，其发育和代谢过程与身体其他部位的脂肪有明显的差别7。肌肉中能分化为脂肪细胞的干细胞有两种，即脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）和肌肉卫星细胞（MSCs）。这两种细胞之间存在密切联系，其中ADSCs能够分泌一些调控因子，调控MSCs增殖以及向脂肪细胞转分化8-10。另外，在胰岛素、地塞米松、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤和罗格列酮等成脂诱导因子的作用下，体外培养的间充质来源不同的细胞（包括卫星细胞）同样能够向脂肪细胞分化11-13。这些研究表明肌内脂肪既可由肌肉内前体脂肪细胞发育而来，也可通过MSCs转分化为脂肪细胞这一调控机制进行，并且肌内脂肪含量与MSCs的增殖和成脂转分化过程息息相关14-16。ACACA属于羧化转移家族的成员，是脂肪酸代谢过程中的关键因子，其序列753-818处有生物素/硫辛酸附着位点17。该酶在哺乳动物中以两种方式存 在，分 别 为 ACACA 基 因 编 码 的 ACC-1 以 及ACACB 基因编码的 ACC-2，两者具有高度的相似性，互为同工酶。其中ACC2主要存在于脂肪分化活跃的组织，其作用是催化脂肪酸的氧化；而ACC-1主要存在于哺乳动物肝脏和脂肪组织内，能参与脂肪酸合成代谢，催化乙酰辅酶A羧化成不饱和脂肪酸合成起始产物，即丙二酰辅酶 A18。丙二酰辅酶A是线粒体内氧化的重要调控因子，充当不饱和脂肪酸合成的限速酶，可直接影响人类的脂类代谢19-22。在前期本研究团队已经证实ACACA在高肌内脂肪含量的猪群体中呈现高表达趋势23。另外据相关研究表明，ACACA 基因在高肌内脂肪含量的莱芜猪肌肉中的表达量明显高于肌内脂肪含量低的DLY猪，ACACA与肌内脂肪含量呈现正相关24。D.Gallardo等25研究也发现，在杜洛克猪中ACACA基因的两个连锁同义突变对肌肉中脂肪酸组成（包括多不饱和/饱和脂肪酸比值）有显著影响，这些研究均提示ACACA与猪肌内脂肪有相关性。因此，本研究以猪MSCs为模型，通过体外培养诱导其转分化，模拟肌内脂肪的生成，探究干扰ACACA 基因后对猪 MSCs 增殖凋亡及转分化的影响，进而揭示其成脂转分化的分子机制，为研究猪336第 2 期雷宇航，等：干扰ACACA基因对猪原代肌卫星细胞增殖和成脂转分化过程的影响肌内脂肪生成分子调控机制和改善猪肉品质提供有关理论依据。1材料和方法1.1主要试剂与仪器胎牛血清（FBS）、DMEM/F12培养基购于Gibco公司；油红 O 染液、胰岛素（insulin）、地塞米松（DEX）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）和罗格列酮（Rosiglitazone）购于Sigma公司；甘油三酯（TG）检测试剂购于南京建成生物工程研究所；Trizol（总RNA 抽提试剂）购于 Invitrogen 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞增殖/毒性检测试剂盒购于日本DOJINDO公司；PI/Rnase Cell cycle staining Buffer细胞周期试剂盒购于美国 BD 公司；Lipofectamine 3000转染试剂购于ThermoFisher公司；Prime Script Reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒和 SYBR Permix Ex Taq Kit购于TaKaRa公司；qRT-PCR引物合成于擎科生物公司（成都）；使用CFX96荧光定量仪（Bio-Rad，美国）、Cytoflex流式细胞仪（Backman，美国）、酶标仪（Thermo，美国）、Olympus IX53荧光显微镜（Olympus，日本）。1.2试验方法1.2.1猪原代肌卫星细胞体外分离无菌采取3日龄的DLY仔猪背最长肌组织，用含3%双抗的PBS缓冲溶液清洗35次，剔除血管和结缔组织，用手术剪剪成肉糜状。经型胶原酶和胰蛋白酶消化后，将消化液用100 m的细胞筛过滤，1 000 g/min转速离心10 min后倒掉上清，收集底部细胞，加入20%培养基重悬，铺瓶，将培养瓶置于含5%CO2，37 恒温细胞培养箱中培养。由于原瓶中细胞种类较多，含有大量成纤维细胞、骨骼肌卫星细胞、组织等，其中成纤维细胞具有较强的贴壁能力最强26，因此在3 h后将原瓶中上清液转移至新的培养瓶中，未贴壁细胞继续培养，重复一次，最终采用差速贴壁法对猪MSCs进行分离纯化。1.2.2猪原代肌卫星细胞传代与诱导成脂转分化待培养瓶中细胞密度达到80%左右，经胰蛋白酶消化后，按照1 3的比例进行传代培养。当培养板内细胞密度达到90%时，将完全培养基更换为成脂诱导 A 液（DMEM+20%FBS+1%双抗+1 mol/L DEX+20 g/mL Insulin+0.5 mmol/L IBMX+10 mol/L Rosiglitazone），培养2 d之后，更换为成脂诱导B液（DMEM+20%FBS+1%双抗+20 g/mL Insulin），每2 d换液一次，并在显微镜下拍照记录。1.2.3小干扰RNA（siRNA-ACACA）的合成针对猪的ACACA基因的保守序列，由吉玛基因（Gene Pharma）公司（上海）设计并合成3条小干扰RNA，序列见表1。1.2.4细胞转染为了探究siRNA-ACACA对猪原代肌卫星细胞增殖凋亡以及转分化的影响，将细胞接种于12孔细胞培养板，分别在增殖期和转分化期将3种小干扰RNA（si-ACACA1、si-ACACA2、si-ACACA3）和一组对照组（NC）转染进细胞，每组处理设置3个重复。转染液按照Lipofectamine 3000说明书进行配制。1.2.5CCK-8细胞增殖检测将细胞接种至96孔板，每组处理6个孔，每个孔 100 L 细胞悬液。将培养板置于含 5%CO2，37 恒温细胞培养箱中预培养24 h，当细胞密度达到30%时转染细胞并换增殖培养液。转染细胞后，设定5个时间点（0、12、24、48、72 h）向待检测细胞孔中加入10 L CCK-8检测试剂，孵育1.5 h后利用表1ACACA的siRNA序列Table 1The siRNA sequence of ACACA小干扰RNA名称siRNA nameNegative Controlsi-ACACA1si-ACACA2si-ACACA3序列（53）SequenceF：UUCUCCGAACGUGUCACGUTTR：ACGUGACACGUUCGGAGAATTF：CCUCUUCAGACAGGUUCAATTR：UUGAACCUGUCUGAAGAGGTTF：GCUUCGCCAUAACCAAGUATTR：UACUUGGUUAUGGCGAAGCTTF：GAUCAUGUUUCAGGCAUAUTTR：AUAUGCCUGAAACAUGAUCTT序列长度Sequence length/bp21212121337四川农业大学学报第 41 卷 酶标仪检测在450 nm波长处的OD值，确定细胞增殖活力。1.2.6流式细胞检测细胞转染24 h后，用胰蛋白酶消化细胞，并以1 000 r/min离心5 min（收集约6105个细胞）。加入4 70%乙醇2 mL，于冰上处理30 min。加入2 mL 4 的PBS液，旋涡混匀300 g离心5 min，重复此步骤。加入500 L的PI/Rnase staining Buffer，4 孵育 30 min，加入 2 mL 的 PBS 液洗涤一次，加入 400 L的PBS液重悬细胞。使用流式细胞仪上机检测，采用Modfit软件进行数据分析。1.2.7甘油三酯检测收集转分化第8天的细胞培养液上清，参考甘油三酯试剂盒说明书，利用酶标仪操作比色法测定上清液中甘油三酯的相对含量。1.2.8油红O染色MSCs在转分化第8天时用4%多聚甲醛固定1 h，PBS漂洗3 min，60%异丙醇冲洗15 s，促进中性脂肪的染色。随后在避光处用油红 O 染液浸染15 min，每个处理组随机选取5个点在倒置荧光显微镜下拍照，并用Image J软件量化脂滴面积。1.2.9实时荧光定量PCR（qRT-PCR）用Trizol试剂裂解细胞，加入氯仿使溶液分为水相和有机相，吸取上层水相用异丙醇沉淀回收RNA。随后使用 Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒将 RNA 反转录为 cDNA，RT-PCR检测增殖、分化相关基因表达水平。PCR反应体系为SYBR Premix Ex Taq 5 L，DEPC水3 L，上下游引物各自 0.5 L，cDNA 1 L。反应条件：95预变性 15 min，95变性 10 s，60退火 30 s，72延伸15 s，共计40个循环。以-actin作为内参基因，使用2-Ct方法计算目的基因的相对表达含量27。qRT-PCR反应的引物序列见表2。1.3数据统计分析所有数据采用GraphPad Prism 8.0.2 软件进行统计学分析，使用独立样本t检验进行差异显著性检验。数据均以平均值（mean）标准差（standard deviation，SD）表示。2结果与分析2.1猪MSCs分离培养结果刚分离下来的猪原代肌卫星细胞在明场下观察呈现亮白小圆点，悬浮于培养液之中（图1A）。培养6 h之后，转移上清液至新培养瓶，更换新鲜培养液继续培养，此时上清液中少量原代肌卫星细胞开始在培养瓶上贴壁，呈现细胞样，向四周伸展；未贴壁细胞依旧呈现圆形白点状（图1B）。培养24 h之后，绝大多数细胞贴壁（图1C），此时更换培养液，去除仍未贴壁细胞。经过48 h后，细胞大量增殖，细胞形态逐渐呈现出纤维状或梭形（图1D）。表2qRT-PCR引物序列Table 2The primer sequence for qRT-PCR基因名称Gene nameACACACyclin D1Cyclin EBAXBCL2MyoGMyoDC/EBP-actin功能Function目的基因细胞周期相关基因，促进细胞增殖细胞周期相关基因，促进细胞增殖促进细胞凋亡关键基因抑制细胞凋亡关键基因成肌分化关键基因成肌分化关键基因成脂分化关键基因内参基因引物序列（53）Primer sequenceF：GAGGTGTATGTGCGAAGGR：GTTGAGGTTGGAGGAGAAGF：TGACCTGCCTTAGACCTTAR：GCTGCTGTTACTGACTATATCF：GCCACTGCCTATACTGAACR：ACACCTCCATTAACCAATCCF：CTACCAAGAAGTTGAGCGAGTGR：CCAGTTGAAGTTGCCGTCAGF：GGAACAGGACGCTCAGACTTR：GCAGGATAGCAGCACAGGATF：GAAACTACCTGCCCGTCCAR：CCACAGACACGGACTTCCTCF：CACGTCTAGCAACCCGAATCAR：GGCGTTGCGCAGGATTTF：CAAGAACAGCAACGAGTACCGR：GTCACTGGTCAACTCCAGCACF：AAGGACCTCTACGCCAACACR：CTGGCTGATCCACATCTGCT产物长度Product length/bp17114015815811918355124207退火温度Anneal temperature/606060596261616160338第 2 期雷宇航，等：干扰ACACA基因对猪原代肌卫星细胞增殖和成脂转分化过程的影响2.2siRNA-ACACA的干扰效率qRT-PCR检测结果如图所示（图2），与NC未转染组相比，转染 si-ACACA 之后 ACACA 的 mRNA表 达 量 均 下 降，且 si-ACACA1、si-ACACA2、si-ACACA3 的 干 扰 效 率 分 别 为 56.04%、88.43%、72.06%。其中si-ACACA2干扰效率最好，较NC组有极显著差异（P0.000 1），从而筛选出si-ACACA2对猪MSCs进行转染，用于后续实验。2.3干扰ACACA基因对猪MSCs增殖的影响转染24 h之后，通过CCK-8试剂盒测定细胞活力，结果显示：当细胞培养到12 h和24 h时，NC组与si-ACACA2组在450 nm处OD值基本相同，细胞数目没有明显差异；当细胞培养到 48 h 时，si-ACACA2组OD值显著低于NC组（P0.05）；当细胞培养到72 h时，si-ACACA2组OD值极显著低于NC组（P0.01）（图3A）。转染细胞24 h后，经过流式检测分析发现，si-ACACA2组相比于NC组，G0/G1期细胞比率由53.15%（55.32.66）上升到 60.67%（60.320.36）（P0.05），G2/M 期变化差异不大，S 期细胞数量由 35.47%（33.053.35）下降到 27.47%（28.440.97）（P0.05）（图3B和C）。*表示 P0.05，差异显著；*表示 P0.01，*表示 P0.001，*表示P0.000 1，差异极显著。下同。*indicates P0.05，the difference is significant；*，*，and*indicate P0.01，P0.001，and P0.000 1，the difference is highly significant.The same as below.图2siRNA-ACACA的筛选Figure 2The screening result of siRNA-ACACAA：刚分离出的猪原代肌卫星细胞；B、C、D：分离培养6、24、48 h的猪原代肌卫星细胞。A：Freshly isolated porcine primary muscle satellite cells；B，C，D：Porcine primary muscle satellite cells isolated and cultured for 6，24，48 h.图1不同培养时间猪原代肌卫星细胞形态Figure 1The morphology of porcine primary muscle satellite cells at different culture time339四川农业大学学报第 41 卷 实时荧光定量 PCR 检测细胞增殖相关基因（Cyclin D1、Cyclin E）的表达量，结果显示：干扰ACACA 能 够 降 低 Cyclin D1（P0.05）（图 3D）和Cyclin E（P0.000 1）的表达量（图3E）。以上结果表明：抑制ACACA基因之后，猪MSCs活性和新生细胞比率均极显著低于对照组，细胞周期相关基因Cyclin D1和Cyclin E表达量显著降低，G0/G1期细胞比例显著增多（P0.05），而S期细胞比例显著降低（P0.05）。说明干扰ACACA可抑制猪MSCs从G1期向S期转变，从而导致G0/G1期阻滞，细胞增殖受到抑制。2.4干扰ACACA基因对猪MSCs凋亡的影响转染24 h后，利用qRT-PCR检测凋亡标志基因在细胞样本中的表达量。结果显示，si-ACACA2组与NC组相比，BAX表达量显著升高（P0.05），BCL-2表达量显著下降（P0.05）（图4A和B）。由此可以推测，干扰ACACA基因可以显著促进猪MSCs凋亡。2.5诱导猪MSCs转分化结果增殖期细胞融合度达100%时，更换成脂诱导液，继续培养至8 d左右，细胞形态逐渐由纤维状变为椭圆形，并且伴随有明显脂滴出现，猪原代肌卫星细胞成功转分化为脂肪细胞（图5A）。通过实时荧光定量PCR分别对转分化不同时期的细胞进行成脂和成肌相关标志基因表达量的检测，进一步验证脂肪细胞的形成，结果如下图所示：成脂相关基因C/EBP的表达量在转分化时期显著高于第0天，并且在第2天左右表达量达到最高，随后开始逐渐降低（图5B）；成肌相关的基因MyoD和MyoG的表达A：CCK8检测细胞增殖速率；B、C：流式细胞术测定细胞周期变化；D：Cyclin D1表达量变化；E：Cyclin E表达量变化。A：The CCK 8 test cell proliferation rate；B，C：Detection of Cell cycle by flow cytometry；D：The changes in Cyclin D1 expression；E：The changes in Cyclin E expression.图3干扰siRNA-ACACA后对猪原代肌卫星细胞增殖的影响Figure 3Effect of interfering siRNA-ACACA on proliferation of porcine primary muscle satellite cellsA：BAX表达量变化；B：BCL-2表达量变化。A：The change in BAX expression；B：The change in BCL-2 expression.图4干扰siRNA-ACACA 24 h后对猪原代肌卫星细胞凋亡的影响Figure 4Effect of interfering siRNA-ACACA after 24 h on apoptosis of porcine primary muscle satellite cells340第 2 期雷宇航，等：干扰ACACA基因对猪原代肌卫星细胞增殖和成脂转分化过程的影响量与转分化第0天相比均呈现极显著下降的趋势（P0.001），其中MyoD的表达量从第2天开始逐渐升高，而MyoG的表达量逐渐递减，到第8天时表达量最低（图5C和D）。成肌基因与成脂基因的表达量变化在猪MSCs转分化时期呈现相反趋势，成功诱导猪MSCs向脂肪细胞转分化。2.6干扰 ACACA 基因对猪 MSCs 成脂转分化的影响转染之后，对转分化第8天细胞进行油红O染色发现，si-ACACA2组中红色脂滴产生量明显少于NC 组，并且脂滴大小也明显小于 NC 组（图 6A 和B）。检测甘油三酯含量同样发现，si-ACACA2组中甘油三酯的含量显著低于NC组（图6C）。因此，干扰ACACA基因可以阻碍猪MSCs转分化时期脂肪沉积作用。3讨论ACACA基因定位在猪的12号染色体，其编码的乙酰辅酶A羧化酶属于羧化转移家族成员，是脂肪酸从头合成途径中的关键酶，可促进乙酰辅酶A转变为丙二酸单酰辅酶A，能提供脂肪酸合成所需的二碳单位28。有研究表明ACACA转录水平含量决定细胞和/或个体脂肪酸合成，维持正常生存。如杨青29发现在谷氨酸棒杆菌中过表达ACACA可显著促进脂肪酸合成，提升效率接近2倍之多。相反，当ACACA基因受到抑制后，脂肪酸的合成明显受到阻碍，并且对多种细胞的增殖及个体生长发育会产生负调控作用。Liao T.等30通过抑制KMT5A的表达间接抑制了ACACA的表达，从而可使人甲状腺乳头状癌细胞系（PTC）的增殖减弱，并促进其凋亡。E.C.Jessica等31通过双转染siRNA直接抑制ACC1和ACC2 mRNA水平的表达量，同样发现人胶质母细胞瘤的增殖受到抑制，并且其新生脂肪产生量也显著降低。Zhang H.等32发现前列腺癌组织中ACACA的表达量非常高，与前列腺癌细胞增殖速度快有一定相关性，但是沉默ACACA的表达可以抑制前列腺癌细胞增殖并诱导其凋亡，研究还揭示ACACA对前列腺癌细胞增殖调控的作用机制，发现A：诱导分化第8 天细胞内脂滴形成情况；B：转分化不同时期内C/EBP表达量的变化；C：转分化不同时期内MyoG表达量变化；D：转分化不同时期内猪MyoD表达量变化。A：Formation of lipid droplets in cells on the 8 d of induced differentiation；B：The change of C/EBP expression in different stage of transdifferentiation；C：The change of MyoG expression in different stage of transdifferentiation；D：The change of MyoD expression in different stage of transdifferentiation.图5诱导MSCs转分化结果Figure 5The result of induced transdifferentiation of MSCs341四川农业大学学报第 41 卷 其是通过影响 NAD+/NADH、线粒体 ATP 产量、mtDNA和ROS水平的平衡，干扰线粒体的正常功能，从而降低细胞的增殖能力。程婧等33在对肾透明细胞癌研究同样发现下调肾透明细胞癌786-O和Caki-1细胞中ACACA的表达，能抑制细胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4表达进而影响细胞增殖。在活体实验上，L.Abu-Elheiga等34发现双敲除ACACA基因，对小鼠胚胎具有显著致死效应。同样，本研究发现通过在体外培养的猪MSCs中干扰ACACA基因可导致细胞增殖受阻，细胞发生G0/G1期阻滞，并且伴随细胞周期标志基因（Cyclin D1、Cyclin E）的表达量显著下降。细胞凋亡相关基因BAX显著升高，BCL-2显著下降，从而加速猪MSCs凋亡。这些结果提示MSCs干扰ACACA后增殖受阻与G0/G1期阻滞以及细胞凋亡增强密切相关。猪肌内脂肪的形成不仅与遗传因素有关，而且更多受到营养条件的影响。动物骨骼肌卫星细胞作为肌内脂肪形成的细胞之一，可以通过体外添加胰岛素、罗格列酮、地塞米松等进行诱导培养，促进向脂肪细胞转化16,26,35。其中胰岛素作为机体内唯一降低血糖的激素，可以促进脂肪的合成36；罗格列酮则是PPAR的激动剂，通过激活脂肪细胞标志物脂蛋白脂酶（LPL）的表达以及下调丝裂原激活蛋白激酶激酶3（MAP2K3）的表达来诱导脂肪细胞的形成37；DEX可以促进C/EBP的表达，而C/EBP是脂肪形成过程中的关键因子38。因此无论成肌细胞是否有内在成脂能力，均可通过PPAR和C/EBP这两种成脂转分化因子的异位表达来诱导转分化为成熟脂肪细胞。闫研12研究表明通过上调延边牛骨骼肌卫星细胞中PPAR的表达，可以促进肌肉卫星细胞成脂转分化。皇甫一凡39研究证明，在牛成肌细胞内过表达C/EBP同样也可以诱导成肌细胞向脂肪细胞转分化。另外，C.Fux等40研究证实，C2C12成肌细胞向脂肪细胞转分化过程中，脂肪细胞的形成仅在C/EBP表达最高时发生，这也说明C/EBP 的高表达对于成脂转分化至关重要。因此，本研究通过体外添加胰岛素、罗格列酮、地塞米松等，进而上调MSCs内C/EBP的表达，检测了成脂相关基因C/EBP和成肌相关的基因MyoD、MyoG在转分化过程中表达量的变化，成功诱导MSCs向脂肪细胞转分化。其中C/EBP基因作为脂肪细胞形成的标志物，其表达量在转分化时期极显著高于A：NC组和si-ACACA2组油红O染色图及量化图；B：NC组和si-ACACA2组490 nm下OD值比较；C：干扰ACACA后甘油三酯相对含量变化。A：Oil Red O staining and quantification of NC group and si-ACACA2 group；B：Comparison of OD value at 490 nm between NC group and si-ACACA2 group；C：The change of triglyceride relative content after ACACA interference.图6干扰ACACA后对猪原代肌卫星细胞转分化时脂滴形成的影响Figure 6The effect of ACACA interference on lipid droplet formation during transdifferentiation of porcine primary muscle satellite cells342第 2 期雷宇航，等：干扰ACACA基因对猪原代肌卫星细胞增殖和成脂转分化过程的影响转分化开始。而生肌调节因子家族（myogenic regulatory factors，MRFs）中的生肌决定因子（MyoD）和肌生成素（MyoG）在肌肉的形成和分化起着重要作用，前者对于成肌细胞分化起决定性作用，而MyoG则是分化后期形成肌管和肌纤维所必需的。在转分化过程中，猜测是由于肌卫星细胞向脂肪细胞转分化，从而抑制肌管的形成，导致MyoD和MyoG的表达量则始终低于转分化开始时，具体的机制还有待进一步验证。在表观层面，通过油红O染色显示干扰ACACA基因后会明显阻碍转分化时期脂滴的累积过程，抑制了脂肪沉积过程。4结论本研究以猪MSCs体外培养为模型，探究出干扰ACACA后抑制猪MSCs的增殖，促进其凋亡，并且减少成脂转分化时脂肪的沉积。研究结果为进一步研究ACACA在猪肌内脂肪生成分子调控机制和改善猪肉品质提供实验参考和基础数据。参考文献：1 夏万千.猪肉品质的影响因素及改善措施 J.畜禽业，2022，33（5）：38-40.2 袁艳枝，邓文，金瑶瑶，等.猪肉品质评定指标及影响因素的研究进展 J.黑龙江畜牧兽医，2020（1）：31-35，40.3 WOOD J D，ENSER M，FISHER A V，et al.Manipulating meat quality and compositionJ.Proceedings of the Nutrition Society，1999，58（2）：363-370.4 MIAO Z G，ZHANG L P，FU X，et al.Invited review：mesenchymal progenitor cells in intramuscular connective tissue development J.Animal：an International 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