济川煎干预肠道动力改善慢传输型便秘的机制探究.pdf

中国中西医结合外科杂志 2023 年 10 月第 29 卷第 5 期济川煎干预肠道动力改善慢传输型便秘的机制探究屈子怡1，张雨田1,王红2，薛俊丽3，戚军明3摘要目的：探讨济川煎对慢传输型便秘（STC）大鼠模型的影响及其作用机制。方法：将 40 只 SD 大鼠随机分为正常组、模型组、济川煎高、中、低剂量组，每组 8 只。正常组予以 10 mL/（kg d）生理盐水灌胃 14 d；其余组用浓度为 1.5 mg/mL 的复方地芬诺酯混悬液10 mL/（kg d）灌胃 14 d，建立 STC 模型。自第 15 天，济川煎低、中、高剂量组分别给予 1.85、3.7、7.4 g/kg 的济川煎灌胃至实验结束，正常组和模型组予以相同体积的蒸馏水。测定各组大鼠首粒黑便时间、肠道内碳末推进长度，用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测结肠组织 Cajal 间质细胞（ICC）的特异性标志物（C-Kit）和血清中血管活性肠肽（VIP）的含量。结果：与正常组相比，模型组大鼠首粒黑便时间显著增加、血清中 VIP 浓度明显上升、肠道碳末推进长度和结肠中 C-Kit 蛋白含量减少（均约0.05）。与模型组比较，济川煎低、中、高剂量组大鼠首粒黑便时间、血清中 VIP 浓度显著下降，肠道碳末推进长度和结肠 C-Kit 蛋白含量明显增加（均约0.05）；与济川煎中、低剂量组比较，济川煎高剂量组首粒黑便时间、血清 VIP 浓度显著降低，肠道碳末推进长度、结肠 C-Kit 含量显著升高，差异有统计学意义（约0.05）。结论：济川煎可促进肠道运动、改善便秘症状，其作用机制可能与增加结肠组织中 C-Kit 的表达、降低血清中 VIP 的含量有关。关键词：慢传输型便秘；济川煎；血管活性肠肽；C-Kit 蛋白中图分类号：R656.7；R259文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.1007-6948.2023.05.018Investigation of the mechanism of Jichuan decoction intervention on serum VIP and colonic C-Kit toimprove slow-transmission constipation in ratsQU Zi-yi,ZHANG Yu-tian,WANG Hong,et al.Abstract:ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of Jichuan decoction on rat models of slow-transit constipation.MethodsForty SD rats were randomly divided into normal group,model group,Jichuanfried high,medium and low dose group,with 8 rats in each group.The normal group was given 10 mL/（kg d）normal saline gavage for 14 days;The remaining groups were gavaged with compound diphenoxylate 10 mL/（kg d）at a concentration of 1.5 mg/mL for 14 days to establish an STC model.Jichuan decoc tion gavage of 1.85 g/kg,3.7 g/kg and 7.4 g/kg was given to the low,medium and high dose groups of Jichuan decoction for 14 days,andthe normal group and the model group were gavaged with the same volume of distilled water.The time of firstmelena and the length of carbon powder propagation in the colon were determined in each group.The ELISAmethod measures the content of C-Kit and serum vasoactive intestinal polypeptide(VIP)in colonic tissue.ResultsCompared with the normal group,the first melena time increased,the concentration of VIP in serumincreased significantly,the length of carbon end propeller and the content of C-Kit protein in the colondecreased(all0.05).Compared with the model group,the first melena time and serum VIP concentration ofrats in the low,medium and high dose groups in Jichuan fried significantly decreased,and the length of intestinalcarbon powder advance and colonic C-Kit protein content increased significantly(all0.05),and compared withthe Jichuan fried group,the first melena time and serum VIP concentration in the high-dose group weresignificantly reduced,the length of intestinal carbonpowder advancement and colonic C-Kit content weresignificantly increased,and the difference between themedium and low dose groups was significantly higher(0.05).ConclusionJichuandecoctioncanpromote intestinal motility and improve constipation实验研究基金项目：天津市教委科研项目（2018KJ035）1.天津市中医药大学研究生院（天津 300000）2.天津中医药大学第二附属医院（天津 300000）3.陕西省周家山卫生中心院（陕西汉中 724200）通信作者：王红，E-mail:663中国中西医结合外科杂志 2023 年 10 月第 29 卷第 5 期近年来，便秘在普通人群中的发病率逐年升高，长期便秘会诱发结直肠恶性肿瘤、脑血管意外、心肌梗死等危重疾病1。临床上将便秘分为继发性便秘和原发性便秘，原发性便秘又分为功能排便障碍性便秘、慢传输型便秘（slow transit constipation，STC）和出口梗阻性便秘2，其中 STC 在原发性便秘中的比例高达 45.5%，临床表现为大便困难、大便频率减少、缺乏便意等3。临床采用口服泻剂的短期效果较好，但长期服用有不良反应4。手术治疗则存在创伤大等缺点5。寻求一种安全有效的 STC 治疗策略是当前急需解决的问题。已有多项研究证明济川煎对于 STC 具有显著疗效6-7，但其作用机制尚未明确。C-Kit 是 Cajal 间质细胞（interstial cells ofCajal，ICC）的特异性标志物，ICC 是胃肠道运动慢波的起搏细胞，在胃肠神经系统和平滑肌之间信号传递中扮演重要角色，与 STC 发生密切相关8。血管活性肠肽（vasoactive intestinal polypeptide，VIP）是一种小分子多肽，主要由大脑神经元、胃肠道共同分泌，可松弛平滑肌，抑制胃肠道蠕动和排空，从而引发便秘9。本研究使用济川煎干预 STC 模型大鼠，观察济川煎对结肠上 C-Kit 和血清 VIP 的影响，以期为济川煎治疗 STC 提供理论依据。1材料与方法1.1实验动物SPF 级 SD 大鼠 40 只，11耀12 周，体质量 210耀230 g，由斯贝福生物技术有限公司提供许可证号：SCKX（京）2019-0010。1.2实验药物济川煎由天津中医药大学第二附属医院药房提供。方剂组成：升麻 3 g，当归 10 g，枳壳 3 g，肉苁蓉 9 g，泽泻 4.5 g，怀牛膝 6 g。生药饮片加入 10 倍量的水，浸泡半小时后，将全部药物用沸水煎煮 15 min，将药液滤出，再加 10 倍水再次煎煮20 min，将两次的滤液混合，冷藏在 4 益冰箱中保存使用。将复方地芬诺酯研磨成粉末，再和 0.9%氯化钠溶液混合制成浓度为 1.5 mg/mL 的复方地芬诺酯混悬液。制备碳末糊：将 4 g 无水碳末和 15 g 羧甲基纤维素钠混合，再加入蒸馏水至 300 mL，加热至质地黏稠糊状。1.3试剂与仪器5%无水碳末（天津科密欧化学试剂公司）；羧甲基纤维素钠（天津致远试剂有限公司）；3%戊巴比妥钠（美国 Sigma 公司）；高速离心机（力康生物医疗科技控股有限公司）；酶标仪（上海科华实验系统有限公司）；VIP 及 C-Kit 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（江苏酶免实业有限公司）。1.4分组、造模及给药40 只 SD 大鼠先适应性喂养 1 周，随机分为正常组、模型组、济川煎高、中、低剂量组，每组 8 只。正常组予 10 mL/（kg d）生理盐水连续灌胃 14 d；其余组予复方地芬诺酯混悬液 10mL/（kg d）连续灌胃 14 d，建立 STC 模型大鼠。于第14 天碳末糊灌胃，记录各组大鼠首粒黑便时间，证实 STC 大鼠造模成功，第 15 天，分别以 1.85 g/kg、3.7 g/kg、7.4 g/kg 的济川煎灌胃，为济川煎低、中、高剂量组，每天 1 次，连续 14 d。同时正常组、模型组大鼠用相同体积的蒸馏水灌胃。1.5取材造模第 28 天，用碳末糊以 0.1 mL/10 g灌胃。30min后，腹腔内注射3%戊巴比妥钠（30mg/kg)麻醉，腹部正中切口，腹主动脉取血，静置 0.5 h后，使用离心机以 3 000 r/min 离心 15 min 取得血清，-80 益冻存备用。摘除从幽门到直肠末端的全部肠道，轻轻将肠管拉直后，测量各组大鼠幽门括约肌到碳末推进末端距离，然后取中段结肠组织于-80 益保存。1.6结肠组织 C-Kit 含量检测记录各组大鼠首粒黑便时间、碳末推进长度，取部分大鼠结肠，加入预冷的 PBS 缓冲液中超声粉碎以制备结肠组织匀浆，以 3 000 r/min 离心 15 min 取得上清液，-20 益反复冻融 3 次，按 C-Kit 试剂盒说明进行检测，计算出大鼠结肠组织 C-Kit 蛋白含量。1.7血清 VIP 含量检测用 ELISA 法按 VIP 试剂盒说明书要求和步骤检测定血清 VIP 含量。1.8统计学方法实验数据用 SPSS 26.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数依标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，使用 LSD-t 进行两两比较。以约0.05 为有统计学意义。2结果2.1各组大鼠首粒黑便时间比较与正常组相比，模型组大鼠首粒黑便时间显著增长，差异有统计学意义（约0.05）。与模型组相比，济川煎中、高剂量组首粒黑便时间下降（约0.05）；济川煎高剂量组首粒黑便时间低于济川煎低、中剂量组，差异均有统计学意义（约0.05）。见表 1。symptoms,and its mechanism of action may be related to increasing the expression of C-Kit in colon tissues andreducing the content of VIP in serum.Key words:Slow-transit constipation;Jichuan decoction;vasoactive intestinal polypeptide;C-Kit protein664中国中西医结合外科杂志 2023 年 10 月第 29 卷第 5 期2.2各组大鼠肠道碳末推进长度比较与正常组比较，模型组大鼠的碳末推进长度明显减少（约0.05）；与模型组比较，济川煎低、中、高剂量组大鼠碳末推进长度均增加，差异均有统计学意义（约0.05）；济川煎高剂量组大鼠肠道碳末推进长度较中、低剂量组升高，差异有统计学意义（约0.05）。见表 1。2.3各组大鼠血清中 VIP 浓度比较与正常组相比，模型组大鼠血清中 VIP 浓度明显上升，差异有统计学意义（约0.05）；与模型组相比，济川煎低、中、高剂量组血清中 VIP 浓度均降低，差异均有统计学意义（约0.05）；济川煎高剂量组的血清 VIP 浓度较中、低剂量组降低，差异有统计学意义（约0.05）。见表 1。2.4各组大鼠结肠组织 C-Kit 蛋白含量比较与正常组比较，模型组大鼠结肠中 C-Kit 蛋白含量下降，差异有统计学意义（约0.05）；与模型组比较，济川煎低、中、高剂量组大鼠结肠 C-Kit 蛋白含量均上升，差异均有统计学意义（约0.05）；济川煎高剂量组大鼠结肠 C-Kit 蛋白含量较中、低剂量组升高，差异有统计学意义（约0.05）。见表 1。表 1大鼠首粒黑便时间、肠道碳末推进长度、VIP、C-Kit 含量比较（8）组别首粒黑便时间（min）肠道碳末推进长度（cm）血清 VIP 浓度（pg/mL）结肠 C-Kit 蛋白含量（ng/mL）正常组416.75依15.2675.63依12.3319.923依2.58484.264依1.542模型组498.88依28.21a55.29依9.50a25.885依6.930a67.058依13.589a济川煎低剂量组496.38依24.37c70.50依12.38bc24.008依0.753bc75.634依10.069bc济川煎中剂量组476.75依14.09bc70.06依10.28bc24.161依1.621bc78.315依2.680bc济川煎高剂量组432.75依30.48b82.94依14.90b20.3294依1.986b88.062依5.314b64.562366.773228.984296.752约0.001约0.001约0.001约0.001注：a与正常组比较，约0.05；b与模型组比较，约0.05；c与济川煎高剂量组比较，约0.053讨论济川煎源自 景岳全书，方中君以肉苁蓉温肾助阳行便；臣以当归、牛膝补血益肾，润燥通便；佐以枳壳消积除满，泄肾浊而利小便；臣以升麻升清阳而浊阴自降。诸药合用共奏温肾益精，润肠通便之功，主治肾阳虚弱，精津不足证，如大便秘结，腰膝酸软，舌淡，苔白，脉沉迟等。临床研究发现中医药治疗便秘有较好疗效10-11。虽各代中医典籍中均无“便秘”名称的记载，但在传统理论中已有“脾约”“大便难”等概念，治疗也多立足于“脏腑辨证”12-13，临床上也都取得良好疗效14-15。STC 的证型多为本虚标实，水谷精微亏虚则不能濡润肠道，正气不足，津液匮乏，无水行舟，导致糟粕留滞于肠内最终出现便秘。因其病机中有精津不足，无水行舟的共性，故用济川煎以温润下行通便治疗 STC 较为适宜。现代临床研究也发现济川煎可以有效改善 STC 患者的临床症状16-17，但其机制仍不清楚。当肠道运动功能出现障碍，内容物传输延迟，久之则出现 STC，因此肠道运动功能下降是 STC 出现的主要原因之一，而肠道运动能力与相关神经信号递质、运动信号传递密切相关18。课题组前期临床实践中发现济川煎能够较好地改善 STC 患者的临床症状。本实验发现，造模 STC 模型 14 d 后，模型组大鼠出现排便便粒小、便质干、数量较少等情况，且大鼠首粒黑便排出时间长，肠道内碳末推动长度缩短，反映大鼠肠道运动能力减弱19，说明成功建立了 STC 大鼠模型。采用济川煎干预后，首粒黑便排出时间减少、肠道内碳末推动长度增加，说明济川煎对 STC 大鼠的肠道运动功能障碍具有治疗作用。肠道神经元（enteric nervous system，ENS）通过释放不同的神经递质调控肠道运动，因此肠道神经系统与肠道运动密切相关。根据含有的神经递质不同，肠道神经元可以分为胆碱能神经元、肽能神经元、氮能神经元、5-TH 能神经元等，其中肽能神经元释放的 VIP 属于抑制性肠神经递质20，它能抑制小肠运动、松弛胃肠道平滑肌，造成胃肠动力障碍21。张娟等22发现当上调 VIP 浓度后，患者的便秘症状明显加重。本研究发现，模型组大鼠血清中 VIP 含量明显上升，说明 VIP 与 STC 的发病有密切联系。经济川煎干预后，大鼠血清 VIP 浓度下降，提示济川煎可以降低 VIP 的浓度来缓解 STC 的症状。ICC 产生的慢波电信号是肠道机械运动的基665中国中西医结合外科杂志 2023 年 10 月第 29 卷第 5 期础，与胃肠道蠕动功能密切相关23。C-Kit 是 ICC 的特异性标志物，C-Kit 与干细胞因子 SCF 结合后，C-Kit 会被迅速活化，同时激活 Ras/Erk 等多个下游信号通路24，作用于 ICC 以促进其发育、分化、增殖，因此C-Kit对于维持ICC的数量、功能起重要作用25-26。Tong 等27研究发现 STC 患者乙状结肠标本 C-Kit蛋白和 C-Kit mRNA 表达下降，推测 C-Kit 表达途径异常可以通过影响 ICC 数量和功能进而影响肠道运输功能。Choi 等28将 C-Kit 基因敲除后发现敲除 C-Kit 基因后的大鼠肠道内的 ICC 数量明显下降，回、结肠的运动功能均较之前显著减弱。本研究中，模型组大鼠结肠 C-Kit 含量明显降低，说明 STC的发生与结肠 C-Kit 表达水平降低相关。济川煎干预后，大鼠结肠 C-Kit 表达上升，提示济川煎可以通过提高结肠 C-Kit 表达水平来改善 STC 的症状。综上所述，本研究结果表明济川煎可以促进大鼠肠道运动功能，改善 STC，这可能与其能提高结肠上 C-Kit 表达、降低血清中 VIP 浓度相关，其作用机制有待进一步研究。参考文献：1温友林,刘秋江.气阴两虚型便秘的中医药治疗进展J.中外医学研究,2023,21(5)：166-171.2陈容,周泠.结肠慢传输型便秘的研究进展J.海南医学,2020,31(18):2409-2413.3刘丽兵,邓秋林,汤国辉,等.补气增液汤对慢传输型便秘大鼠肠道功能、肠神经递质及 Cajal 间质细胞的影响J.东南大学学报(医学版),2019,38(3):433-438.4Kamm MA,Mueller-Lissner S,Wald A,et al.Oral bisacodyl iseffective and well-tolerated in patients with chronic constipationJ.Clin Gastroenterol Hepatol,2011,9(7):577-583.5张东平,杨士民,马军宏,等.改良单孔腹腔镜手术治疗混合型便秘的临床效果 J.中国中西医结合外科杂志,2022,28(4)：512-516.6朱振.加味济川煎治疗功能性慢传输型便秘的临床观察 D.武汉:湖北中医药大学,2010.7闫军堂.麻子仁丸、济川煎方治疗慢传输型便秘的理论及实验研究D.北京:北京中医药大学，2010.8张陆昕,易顺,曾植唯,等.中医药调节 Cajal 间质细胞治疗慢性传输型便秘的研究进展 J.世界科学技术(中医药现代化),2022,24(6):2230-2235.9朱莉娟,余曙光,张寒潇,等.电针调节腹部术后胃肠功能障碍的参数选择与分析 J.中华中医药杂志,2022,37(8):4572-4575.10 张肖楠,林爱珍.益肠通秘汤联合生物反馈治疗功能性便秘J.中国中西医结合外科杂志,2019,25(4):606-608.11 徐思敏,戴泽琦,李苗苗,等.口服中成药治疗便秘临床研究证据的概况性综述J.中国实验方剂学杂志,2022,28(20):144-153.12 汤立东,王学良,王垂杰,等.李玉奇教授治疗便秘经验J.世界中医药,2013,8(8):932-934.13 葛来安,王小辉,谢明君,等.健脾理气润肠法治疗慢传输型便秘的疗效及对胃肠激素的影响 J.中国中西医结合消化杂志,2021,29(9):659-664.14 孔鹏飞,王秋晓,王邦林,等.加味逍遥散治疗肝郁气滞型慢传输型便秘的临床研究 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