培养基配制及适用性检查基础标准操作专项规程.doc

文件名称培养基配制及适用性检验标准操作规程文件编号SMP-10-QC-009版 本 号00起草部门质量控制部审核部门批 准 人起 草 人审 核 人同意日期起草日期审核日期生效日期颁发部门质量控制部分 发 号分发部门质量确保部 质量控制部 目标： 建立培养基配制及适用性检验标准操作规程，规范试验人员操作步骤。范围： 适适用于微生物检验人员对培养基规范管理。依据：药品生产质量管理规范（修订）、中国药典第四部职责：1.微生物检验员：负责试验室所需求培养基管理工作，使日常检验能够顺利进行。2.微生物检验主管：负责对日常配制培养基规范操作进行监督。内容1 培养基申购 依据检验项目、工作量和工作进度需求，提前30天进行所需培养基申购。申购时需指定培养基供给商，必需时进行供给商审计。2 培养基验收2.1 培养基到货后，微生物室检验员应进行验收。验收内容包含查对品名、数量、规格、生产厂商，应和申购单一致；检验培养基包装有没有破损、包装是否完整、产品是否在使用期内。2.2 验收合格后，登记于培养基领用台账（附统计文件编号：SMP-10-QC-009-02（00）。3 培养基贮藏3.1未开封脱水培养基贮存于阴凉室，使培养基处于低温、干燥、和避光条件下。已开封脱水培养基应盖紧，贮存于阴凉库。3.2灭菌好培养基应进行预培养72h检验无菌后，置48冷藏保留待用。灭菌后培养基储存期为7天。4 培养基配制4.1培养基配制和使用应填写 培养基配制及使用统计（附统计文件编号：SMP-10-QC-009-02（00）。4.2培养基配制批号标准：原材料批号-配制日期：比如1月1日配制培养基，培养基干粉批号000000，配制批号为:00。配制好培养基贴培养基标签（附统计文件编号：R-SMP-10-QC-009-03）。（注：同一天同一培养基配置数次，在原批号后加“-”加“数字”表示，如00-01）4.3培养基配制方法 4.3.1 使用商品化脱水合成培养基时，应严格根据厂商提供使用说明配制，如重量/体积、pH、灭菌条件和操作步骤等。试验室使用多种基础成份制备培养基时，应根据配方正确配制，并统计相关信息如：培养基名称和类型及试剂等级，每个成份物质含量、制造商、批号，pH值，培养基体积/分装体积，灭菌条件（灭菌方法、温度立即间），配制日期、人员等，方便溯源。4.3.2 水、容器具要求：培养基配制均采取纯化水，特殊说明时采取去离子水和蒸馏水。培养基配制所用容器和配套器具应洁净。对热敏感培养基如糖发酵培养基其分装容器应优异行预灭菌，以确保培养基无菌性。4.3.3 称量和分装： 快速称量所需量脱水合成培养基（必需时佩戴口罩或在通风柜中操作，以防吸入含有有毒物质培养基粉末）。以免吸潮。先加入适量水，充足混合。注意避免培养基结块，然后加水至所需量。根听说明书要求选择是否加热。分装体积不超出容器体积2/3。配制斜面等含琼脂培养基也需加热煮沸至完全溶解后分装。4.4 pH 值测定和调整 pH值采取pH计进行检测，温度252。取配后培养基10ml进行灭前pH测定。另取20ml于50ml三角瓶和同批配制培养基同时灭菌冷却至252检测灭后PH。灭菌前后pH应按下表进行控制。灭菌前可使用浓度约为40g/L（约1mol/L）氢氧化钠溶液或浓度约为36.5g/L（约1mol/L）盐酸溶液进行缓慢调整，避免反复调整而增加离子浓度。灭菌后培养基不符合标按时视为不合格，不进行使用。4.5 培养基灭菌 培养基和试剂应采取湿热灭菌法或过滤除菌法。 湿热灭菌在高压灭菌锅或蒸汽灭菌柜中进行，容器具若需湿热灭菌时，灭菌条件为121灭菌30 min。培养基严格按说明书条件进行灭菌。培养基灭菌后应立即取出，不得存放于高压灭菌器中。5 培养基质量控制 5.1计数培养基适用性检验5.1.1菌种及菌液制备 菌种：试验用菌株传代次数不得超出5代（从菌种保藏中心取得干燥菌种为第0代），并采取适宜菌种保藏技术进行保留，以确保试验菌株生物学特征。计数培养基适用性检验和计数方法适用性试验用菌株见表1。 菌液制备：按表1要求程序培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，35培养18二十四小时，取上述培养物1ml加入9ml 0.9无菌氯化钠溶液中，制成10-1 菌液，依法10倍稀释至10-7， 分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml菌液备用；取白色念珠菌新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，25培养23天。取上述培养物1ml加入9ml 0.9无菌氯化钠溶液中，制成10-1菌液，依法10倍稀释至10-7，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml菌液备用；取黑曲霉新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基，经25培养57天，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯800.9无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液至无菌试管内，取上述培养物1ml加入9ml 0.9无菌氯化钠溶液中，制成10-1 菌液，依法10倍稀释至10-7， 分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml菌液备用。 菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保留在28，可在二十四小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保留在28 ,在验证过贮存期内使用。5.1.2 阴性对照 为确定试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。5.1.3培养基适用性检査 微生物计数用成品培养基、由脱水培养基或按处方配制培养基均应进行培养基适用性检验。 按表1 要求，接种小于l00cfu菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表1 要求条件下培养。每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。同时，用对应对照培养基替换被检培养基进行上述试验。被检固体培养基上菌落平均数和对照培养基上菌落平均数比值应在0.52 范围内，且菌落形态大小应和对照培养基上菌落一致；被检液体培养基管和对照培养基管比较，试验菌应生长良好。表1 试验菌液制备和使用试验菌株试验菌液制备计数培养基适用性检验计数方法适用性试验需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)CMC C(B ) 26 003胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基培养温度303 5 ，培养时间1 8二十四小时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3035, 培养时间不超出3 天， 接种量不大100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（MPN法），培养温度3035, 培养时间不超出3 天，接种量小于l00cfu铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC ( B ) 10 104胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3035，培养时间1 8二十四小时 胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基， 培养温度303 5，培养时间不超出3 天，接种量小于l00cfu胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（MPN 法），培养温度3035，培养时间不超出3天，接种量小于l00cfu枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)CMCC(B)63 501胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3035，培养时间18 -二十四小时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30-35，培养时间不超出3天，接种量小于100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（MPN法），培养温度3035，培养时间不超出3天，接种量不大l00cfu白色念珠菌 (Candida albicans) CMCC(F)98 001沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度2025，培养时间2 3天胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度3035，培养时间不超出5天，接种量小于l00cfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2025，培养时间不超出5天，接种量小于l00cfu胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN 法不适用），培养温度3035，培养时间不超出5天，接种量小于100cfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2.025，培养时间不超出5天，接种量小于l00cfu黑曲霉（Aspergillusniger) CMCC (F ) 98 003沙氏葡萄糖琼 脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养温度2025，培养时间57天，或直到取得丰富孢子胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度3035 ，培养时间不超出5天，接种量小于lOOcfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2025，培养时间不超出5天，接种量小于l00cfu胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不适用），培养温度3035，培养时间不超出5天，接种量小于l00cfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2 025，培养时间不超出5天，接种量小于l00cfu5.2控制菌检验用培养基适用性检验5.2.1 菌种及菌液制备 菌种：试验用菌株传代次数不得超出5 代（从菌种保藏中心取得干燥菌种为第0 代），并采取适宜菌种保藏技术进行保留，以确保试验菌株生物学特征。 菌液制备：按表1要求程序培养各试验菌株。取大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，35培养18二十四小时，取上述培养物1ml加入9ml 0.9无菌氯化钠溶液中，制成10-1 菌液，依法10倍稀释至10-7，分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml菌液备用；取白色念珠菌新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，25培养23天。取上述培养物1ml加入9ml 0.9无菌氯化钠溶液中，制成10-1菌液，依法10倍稀释至10-7，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml菌液备用； 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保留在28，可在二十四小时内使用。2.1.3 阴性对照 为确定试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。2.2 培养基适用性检验控制菌检验用成品培养基、由脱水培养基或按处方配制培养基均应进行培养基适用性检验。控制菌检査用培养基适用性检验项目包含促生长能力、抑制能力及指示特征检验。各培养基检验项目及所用菌株见表1。表1 控制菌检査用培养基促生长能力、抑制能力和指示特征控制菌检验培养基特征试验菌株耐胆盐革兰阴性菌肠道菌增菌液体培养基紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基促生长能力抑制能力促生长能力+指示特征大肠埃希菌、铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌、铜绿假单胞菌大肠埃希菌麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基促生长能力抑制能力促生长能力+指示特征大肠埃希菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌沙门菌R V 沙门菌增菌液体培养木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基三糖铁琼脂培养基促生长能力抑制能力促生长能力+指示特征指示能力乙型副伤寒沙门菌金黄色葡萄球菌乙型副伤寒沙门菌乙型副伤寒沙门菌白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基念珠菌显色培养基促生长能力促生长能力+指示特征促生长能力+指示能力抑制能力白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌大肠埃希菌2.2.1 液体培养基促生长能力检査 分别接种小于100cfu试验菌(表1)于被检培养基和对照培养基中，在对应控制菌检验要求培养温度及小于要求最短培养时间下培养，和对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。2.2.2 固体培养基促生能力检査 用涂布法分别接种小于100cfu试验菌（表1 )于被检培养基和对照培养基平板上，在对应控制菌检査要求培养温度及小于要求最短培养时间下培养，被检培养基和对照培养基上生长菌落大小、形态特征应一致。2.2.3 培养基抑制能力检査 接种不少于l00cfu试验菌（表1)于被检培养基和对照培养基中，在对应控制菌检査要求培养温度及大于要求最长培养时间下培养，试验菌应不得生长。2.2.4 培养基指示特征检査 用涂布法分别接种小于100cfu试验菌（表1 )于被检培养基和对照培养基平板上，在对应控制菌检验要求培养温度及小于要求最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应和对照培养基一致。6培养基销毁失效、检测用过培养基（不管是否有菌生长）均按废物进行高压蒸汽灭菌处理。参考试验室废弃物管理规程（文件编号：SMP-10-QC-014（00）。相关文件：文件名称文件编号检定菌管理规程SMP-10-QC-010试验室废弃物管理规程SMP-10-QC-014（00）相关统计：统计名称统计编号培养基登记台账R-SMP-10-QC-009-01培养基配制及使用统计R-SMP-10-QC-009-02培养基配制标签R-SMP-10-QC-009-03计数培养基适用性检验汇报R-SMP-10-QC-009-04计数培养基适用性数据统计R-SMP-10-QC-009-05控制菌培养基适用性测试统计R-SMP-10-QC-009-06控制菌培养基适用性检验汇报R-SMP-10-QC-009-07文件变更历史：文件修订及变更原因生效日期文件编号版本号新修订。SMP-10-QC-00900培 养 基 领 用 台 账R-SMP-10-QC-009-01(00)培养基名称供给商进厂编号规格安全库存量日期批号入库量领用数量剩下库存领用人管理人备注 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 培 养 基 配 制 及 使 用 记 录R-SMP-10-QC-009-02(00)培养基名称配制人/日期配制批号使用期至复核人/日期配制方法称取 g于 L纯化水中，加热煮沸至完全溶解分装，分装体积为 ml/瓶, _m l/瓶, ml/瓶。 分钟高压灭菌备用。灭菌后ph 使用日期用途使用数量使用人培 养 基 配 制 标 签R-SMP-10-QC-009-03(00)培养基名称配制批号适用性检验符合要求 不符合要求灭菌状态已灭菌 未灭菌配制日期使用期至配制人 复核人计数培养基适用性检验汇报R-SMP-10-QC-009-04(00)被测培养基名称批号起源对照培养基名称批号起源检测日期放置天数菌种名称生长情况回收率结果判定备注计数培养基适用性数据统计R-SMP-10-QC-009-05(00)被测培养基名称批号起源对照培养基名称批号起源被测日期菌种名称对照培养基菌数被测培养基菌数回收率%备注1#2#平均值1#2#平均值控制菌培养基适用性测试统计R-SMP-10-QC-009-06(00)被测培养基名称批号起源对照培养基名称批号起源被测日期菌种名称对照培养基菌数测试结果被测培养基菌数测试结果备注控制菌培养基适用性检验汇报R-SMP-10-QC-009-07(00)被测培养基名称批号起源对照培养基名称批号起源配制日期检测日期放置天数菌种名称测试指标结果判定备注